مقالة منهجية

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

DOI:

10.3791/56919

⸱

يناير 2, 2018

 , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعقد النظم في فيفو يجعل من الصعب التمييز بين التنشيط وتثبيط مستقبلات الشق ترانس-و رابطة الدول المستقلة-يغاندس، على التوالي. نقدم هنا، بروتوكول يستند في المختبر فحوصات الخلية-تجميع للتقييم النوعي والكمي شبه ملزمة للشق المورفولوجية عبر-يغاندس مقابل رابطة الدول المستقلة-يغاندس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مما يشير إلى درجة نظام اتصالات تقحم مصانة خلية-خلية تستخدم على نطاق واسع في التنمية الحيوانية وصيانة الكبار. التفاعل بين مستقبلات الشق يغاندس من الخلايا المجاورة الحث على تفعيل المسار إشارات (ترانس-التنشيط)، في حين أن التفاعل مع يغاندس من نفس الخلية يحول دون إشارة (رابطة الدول المستقلة-تثبيط). التوازن السليم بين ترانس-التنشيط و رابطة الدول المستقلة-تثبيط يساعد على تحديد المستويات المثلى للشق إشارات في بعض السياقات أثناء التنمية الحيوانية. بسبب تداخل مجالات التعبير الشق ويغاندس به في العديد من أنواع الخلايا، ووجود آليات التغذية المرتدة، دراسة آثار التعديل بوستترانسلاشونال معين في ترانس-مقابل رابطة الدول المستقلة-التفاعلات من الدرجة الأولى و أن يغاندس في فيفو أمر صعب. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام المورفولوجية S2 الخلايا في خلية-تجميع فحوصات لتقييم آثار إسقاط معدل مسار الشق على الربط من الدرجة الأولى لكل من يجند في ترانس وفي رابطة الدول المستقلة. خلايا S2 transfected ثابت أو عابر مع ناقل التعبير عن الشق مختلطة مع خلايا معربا عن كل من يجند الشق (S2-دلتا أو S2 سيراتي). ترانس-الربط بين مستقبلات ويغاندس النتائج في تشكيل خلية الغيروية المجاميع ويقاس من حيث عدد المجاميع كل مل تتألف من > 6 خلايا. لدراسة تأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس، خلايا S2 المشترك معربا عن الشق ويجند كل مختلطة مع خلايا دلتا S2 أو S2 سيراتي وعدد المجاميع هي كمياً كما هو موضح أعلاه. الانخفاض النسبي في عدد المجاميع بسبب وجود رابطة الدول المستقلة-يغاندس يوفر مقياسا رابطة الدول المستقلة-يجند-بوساطة تثبيط ترانس-ملزمة. يمكن أن توفر بيانات شبه كمي عن آثار التلاعبات الجينية أو الدوائي على الربط من الدرجة لما يغاندس هذه الاختبارات مباشرة، ويمكن أن تساعد في فك رموز الآليات الجزيئية الكامنة في فيفو آثار مثل هذا التلاعب في الشق الإشارات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير الشق الكنسي هو إليه قصيرة المدى لخلية اتصال تتطلب الاتصال الجسدي من الخلايا لتيسير التفاعل بين مستقبلات الشق و يغاندس1المجاورة. التفاعل بين مستقبلات الشق (موجودة على سطح الخلايا المستقبلة للإشارات) يغاندس (موجودة على سطح إرسال إشارة الخلايا) يبدأ الشق الإشارات ويعرف باسم ترانس-التنشيط2. من ناحية أخرى، يؤدي إلى تثبيط مسار درجة التفاعل بين الشق وبه يغاندس في نفس الخلية ويعرف باسم رابطة الدول المستقلة-تثبيط3. التوازن بين ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات مطلوب لضمان المثلى تعتمد على يجند الشق مما يشير إلى4. المورفولوجية له مستقبلات حز واحد واثنين من يغاندس (دلتا وسيراتي) بدلاً من الثدييات، التي لها أربعة مستقبلات الشق ويغاندس خمسة [خشنة 1 (JAG1)، JAG2، مثل دلتا 1 (DLL1)، DLL3 و DLL4]5. يوفر الطراز المورفولوجية السهولة تشريح ودراسة آثار معدلات المسار في الدرجة-يجند التفاعلات وبعد ذلك في الدرجة الأولى مما يشير إلى أن وجود هذه البساطة،. في سياقات معينة أثناء التنمية الحيوانية (بما في ذلك تطوير الجناح في المورفولوجية)، رابطة الدول المستقلة-و عبر-تشارك التفاعلات لتحقيق إشارات الدرجة المناسبة وخلية مصير1،6 . من المهم التمييز بين آثار الشق مسار المعدلات في هذه السياقات على- رابطة الدول المستقلةمقابل ترانس-التفاعلات من الدرجة الأولى مع ما يغاندس.

وذكرت مجموعتنا سابقا أن ينظم إضافة بقايا الكربوهيدرات تسمى إكسيلوسي إلى درجة المورفولوجية سلبا على الشق إشارات في سياقات معينة، بما في ذلك تطوير الجناح7. فقدان شمس (الإنزيم إكسيلوسيلاتيس هذا الشق) يؤدي إلى النمط الظاهري "خسارة الوريد الجناح"7. في الآونة الأخيرة، استخدمت الجينات الجرعة التجارب وتحليل الاستنساخ لإظهار أن يعزز فقدان شمس الشق دلتا بوساطة أفراد. للتمييز بين ما إذا كان يشير الشق المعززة في طفرات شمس نتيجة ل انخفاض رابطة الدول المستقلة-تثبيط أو زيادة ترانس-التنشيط، ودراسات overexpression حمل خارج الرحم من يغاندس الشق في الجناح اليرقات إيماجينال أقراص وأجريت باستخدام برنامج التشغيل GAL4 الحزب الديمقراطي التقدمي . هذه التجارب قدم أدلة تشير إلى أن شمس ينظم ترانس-تفعيل الشق بدلتا دون التأثير على الدرجة رابطة الدول المستقلة-تثبيط يغاندس8. إلا أن التغذية المرتدة اللوائح وآثار يغاندس الذاتية قد يؤدي إلى تعقيد تفسير overexpression حمل خارج الرحم الدراسات1،،من69.

لحل هذه المشكلة، خلايا S2 المورفولوجية واستخدمت10 ، التي توفر نظام بسيط في المختبر ليجند درجة التفاعل الدراسات11،12. خلايا S2 لا التعبير عن مستقبلات درجة الذاتية ودلتا يجند11 والتعبير عن مستوى منخفض من سيراتي13، التي لا تؤثر على الشق-يجند تجميع التجارب8. ولذلك، الخلايا S2 يمكن أن يكون ثابت أو عابر transfected الشق و/أو يغاندس الفردية (دلتا أو سيراتي) لتوليد الخلايا التي تعبر حصرا عن مستقبلات الشق أو واحد من يغاندس على، أو مزيج منها. خلط الخلايا معربا عن الدرجة S2 مع الإعراب عن يجند S2 خلايا النتائج في تشكيل المجاميع الغيروية توسط يجند مستقبلات ملزم11،،من1214. التحديد الكمي لتشكيل الكلية توفر قدرا من ترانس-الربط بين الدرجة و يغاندس15 (الشكل 1). وبالمثل، يمكن أن تكون الخلايا S2 transfected اشتركت مع يغاندس الشق ودلتا أو سرت (أي رابطة الدول المستقلة-يغاندس). رابطة الدول المستقلة-يغاندس في هذه الخلايا معربا عن الدرجة S2 إلغاء الربط من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس وتؤدي إلى تناقص تشكيل إجمالي8،،من1214. الانخفاض النسبي في تشكيل الإجمالية الناجمة عن رابطة الدول المستقلة-يغاندس يوفر مقياسا لتأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس على الربط بين الدرجة و عبر-يغاندس (الشكل 2). تبعاً لذلك، استخدمت خلية التجميع فحوصات فحص أثر فقدان إكسيلوسيليشن في ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات بين الشق وبه يغاندس.

هنا، فإننا نقدم بروتوكول مفصل لفحوصات تجميع الخلية بهدف تقييم الربط من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس استخدام الخلايا S2 المورفولوجية . على سبيل مثال، نحن نقدم البيانات التي سمحت لنا بتحديد أثر الشق إكسيلوسيليشن على الربط بين الدرجة و عبر-دلتا8. هذه الاختبارات مباشرة توفر تقييما شبه كمي للدرجة-يجند التفاعلات في المختبر ، وتساعد في تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآثار في فيفو الشق مسار المعدلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد "مزدوجة تقطعت الحمض النووي الريبي" (dsRNA) لضربة قاضية شمس

  1. [بكر] تضخيم للمنتجات
    1. استخدام الحمض النووي البرية من نوع الأبيض الأصفر (y w) و pAc5.1-اجفب كقالب، وفيما يلي أزواج التمهيدي لتضخيم الحمض النووي الأجزاء المستخدمة في تجميع دسرنا. استخدام التشكيل الجانبي PCR الحرارية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية، 30 s)، انلينغ (58 درجة مئوية، 30 ثانية) وملحق (72 درجة مئوية، 1 دقيقة).
      تعزيز البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) دسرنا الإشعال (5 '-3')-
      التمهيدي إلى الأمام--جااتاتاكجاكتكاكتاتاججججتجاجكاججكجاجاج
      عكس التمهيدي-جااتاتاكجاكتكاكتاتاججججتكتتجكتكاججكج
      شمس دسرنا الإشعال (5 '-3')-
      التمهيدي إلى الأمام--تاتاكجاكتكاكتاتاجججاجاتجكتجتاتجتجاكاكجات
      عكس التمهيدي-تاتاكجاكتكاكتاتاجججاجاتككجتجاتاككتاكجا
      ملاحظة: يتم استخدام دسرنا اجفب كمراقبة سلبية.
  2. هلام-تنقية المنتجات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) باستخدام مجموعة أدوات تنقية جل تجاري وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  3. إجراء النسخ في المختبر باستخدام منتج تجاري قادر على تدوين من مروج T7 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  4. تنقية دسرنا استخدام مجموعة مواد تنقية الجيش النيبالي الملكي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  5. تقييم الكفاءة لضربة قاضية شمس باستخدام الخطوات التالية (1.5.1-1.5.5).
    1. عد الخلايا يدوياً باستخدام خلايا 5 × 105 S2 هيموسيتوميتير ولوحة في كل بئر 6 أيضا لوحة في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
    2. إضافة 7.5 ميكروغرام من اجفب-أو دسرنا شمس لكل بئر واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 24.
    3. شمس تعامل دسرنا خلايا S2 بلطيف بيبيتينج تليها التكوير إلى أسفل باستخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وعملية لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا والحصاد عنصر التحكم (اجفب معاملة دسرنا) البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    4. التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي وعملية 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي للخطوة 1 قرت-PCR باستخدام الكواشف قبكر التجارية والتمهيدي/تحقيقات وبكر التشكيل الجانبي الحرارية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية، 15 s) وأننيالينج/Extension (60 درجة مئوية، 1 دقيقة).
      ملاحظة: يرجى الاطلاع الجدول للمواد للحصول على معلومات على مجموعات التحقيق التمهيدي/والأداة المستخدمة لتجارب بكر qRT شمس والتحكم في هذه الدراسات.
    5. حساب مستويات مرناً النسبي شمس باستخدام 2–ΔΔCT الأسلوب16.

2-تقييم للربط بين مستقبلات الشق و عبر-يغاندس

  1. إعداد الخلايا المستقبلة للإشارات (الخلايا S2 التعبير عن مستقبلات الدرجة).
    1. عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير واستكمال لوحة 5 × 105 S2 وخلايا S2-الدرجة مستقرة في كل بئر لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
      ملاحظة: للخلايا S2-الدرجة التي تتوفر من مركز الموارد المورفولوجية الجينوم (دجرك)، إضافة 200 نانومتر الميثوتريكسيت في وسائل الإعلام. لإعداد حل أسهم ميثوتريكسات 0.5 مم، أولاً بإعداد حل ميثوتريكسات 20 ملم في 250 ميليلتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. وبعد ذلك، يضعف هذا الحل إلى 0.5 مم في المالحة العازلة فوسفات 1 متر ومخزن في-20 درجة مئوية. في الخلايا من الدرجة S2، التعبير عن البروتين الشق تحت سيطرة المروج metallothionein المورفولوجية في ناقلات pMT .
    2. إضافة 7.5 ميكروغرام من دسرنا لكل بئر واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 24.
    3. إضافة 0.7 مم CuSO4 للحث على التعبير عن الشق واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: يتم استخدام CuSO4 للحث على التعبير عن البروتينات التي تسيطر عليها المروج ميتالوثيونين.
  2. إعداد إشارة إرسال الخلايا (خلية S2 معربا عن يغاندس دلتا أو سرت).
    1. عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير ولوحة ~ 5 × 106 مستقرة دلتا S2 S2 سيراتيتوم الخلايا أو في كل بئر من لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر وتستكمل مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
      ملاحظة: إضافة 200 نانومتر الميثوتريكسات لخلايا دلتا S2 و 100 ميكروغرام/مل هيجروميسين للخلايا S2 سيراتيتوم في وسائل الإعلام. التعبير عن دلتا وسيراتيتوم– نسخة وظيفية معلم الطماطم سيراتي12– تحت المورفولوجية metallothionein المروج في ناقلات pMT .
    2. إضافة 0.7 مم CuSO4 للحث على التعبير عن يغاندس واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 3.
  3. القيام بتجميع بين الخلايا الإشارات المرسلة والمستقبلة للإشارات.
    1. حصاد S2 دسرنا معاملة (تحكم) والخلايا الدرجة S2 بيبيتينج لطيف و لوحة 2.5 × 105 خلايا/بئر في صفيحة 24-جيدا بعد العد اليدوي من هيموسيتوميتير.
    2. إضافة 5 × 105 مستقرة S2-دلتا أو S2 سيراتيتوم خلايا في إجمالي حجم 200 ميليلتر من المتوسطة شنايدر (تستكمل مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين).
      ملاحظة: تم كافة الخلايا S2 المناولة (بما في ذلك العلاج والطلاء والتعريفي ودسرنا) إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    3. وضع اللوحة على شاكر مداري 150 لفة في الدقيقة (راد 942.48/دقيقة).
    4. وبعد 1 دقيقة، تخلط محتويات كل بئر وإخراج 20 ميليلتر لإحصاء عدد المجاميع.
      1. في نفس الوقت تأخذ صورة تمثيلية تحت المجهر المركب المقلوب باستخدام 10 x التكبير (الهدف 10/0.25 PLL).
      2. عد يدوياً في المجاميع (> 6 خلايا) استخدام هيموسيتوميتير.
    5. وضع اللوحة على شاكر.
    6. تكرار الحصول على الصورة والعد بعد 5 دقائق و 15 دقيقة للتجميع.
  4. إجراء التحديد الكمي ترانس-ملزمة.
    1. حساب عدد المجاميع كل مل بين S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا أو S2 سيراتيتوم كعنصر تحكم خلفية.
    2. حساب عدد المجاميع كل مل بين خلايا دلتا S2 أو S2 سيراتيتوم والدرجة S2 (حجم ترانس-ملزمة).

3.تقييم لتثبيط للربط بين الدرجة و عبر-يغاندس رابطة الدول المستقلة-يغاندس

  1. إعداد الخلايا المستقبلة للإشارات.
    1. استكمال لوحة 5 × 105 S2 خلايا في كل بئر لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
    2. إضافة 7.5 ميكروغرام من دسرنا لكل بئر واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 24.
    3. شارك ترانسفيكت الخلايا دسرنا تعامل مع ببلويسكريبت و الشق pMT11 (دجرك) وحدها أو مع pMT-الدرجة و دلتا pMT11 (دجرك) أو pMT سيراتي17 لإجمالي تركيز الحمض النووي 2 ميكروغرام/كذلك استخدام كاشف تعداء تجارية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      ملاحظة: يتم استخدام ببلويسكريبت كعنصر تحكم. شارك transfected الخلايا سيتم استدعاء الدرجة S2 & دلتاعابرة أو الدرجة S2 & سيراتي الخلاياعابرة الآخرة.
    4. احتضان خلايا S2 transfected عابر عند 25 درجة مئوية ح 24.
    5. إضافة 0.7 مم CuSO4 للحث على التعبير عن درجة ويغاندس واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  2. إعداد إشارة إرسال الخلايا كما هو موضح في 2.2.
  3. تنفيذ التجميع بين الخلايا الإشارات المرسلة والمستقبلة للإشارات كما هو موضح في الفرع 2-3.
  4. التحديد الكمي لتثبيط ترانس-ملزمة رابطة الدول المستقلة-يغاندس.
    1. حساب عدد المجاميع كل مل بين S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا أو S2 سيراتي كعنصر تحكم خلفية.
    2. تحديد حجم تثبيط رابطة الدول المستقلة-يغاندس على النحو التالي.
      1. تعريف A كعدد من المجاميع بين الدرجة S2عابرة وخلايا دلتا S2.
      2. تعريف ب عدد من المجاميع بين الخلايا S2 عابر شارك transfected مع الشق ودلتا (الدرجة S2 & دلتاعابرة) وخلايا دلتا S2.
      3. حساب التجميع النسبي ج = (ب x 100)/A
      4. حساب حجم تثبيط من رابطة الدول المستقلة-يجند (دلتا أو سيراتي) 100 – ج.
        ملاحظة: على سبيل مثال، إذا كان التجميع النسبي هو 45%، ثم رابطة الدول المستقلة-تعتبر يغاندس تحول دون ترانس-ملزمة بنسبة 55 في المائة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظاتنا في فيفو اقترح زيادة فقدان نتائج شمس الجين إكسيلوسيلترانسفيراسي في الحصول على إشارات الدرجة المستحقة لوساطة دلتا ترانس-التنشيط من الدرجة الأولى دون أن يؤثر ذلك في رابطة الدول المستقلة-تثبيط الدرجة من يغاندس8. لاختبار هذه الفكرة، أجريت في المختبر فحوصات تجميع الخلية. أولاً، طرقت التعبير شمس في الخلايا S2 إلى أسفل باستخدام دسرنا شمس . دسرنا اجفب كعنصر التحكم. فحص PCR الوقت الحقيقي الكفاء...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير الشق الكنسي يعتمد على التفاعلات بين مستقبلات الشق و يغاندس5. على الرغم من أن معظم الدراسات في المسار الشق النظر أساسا الربط من الدرجة الأولى ويغاندس في الخلايا المجاورة (ترانس)، تتفاعل الشق ويغاندس نفس الخلية، وهذه ما يسمى رابطة الدول المستقلة-التفاعلات يمكن أن تلعب دوراً مثبطة في الشق مما يشير إلى3،4. وبناء على ذلك، فك الآليات الكامنة وراء آثار التعديل على إشارات الشق الكنسي، أنها غالباً ما ذات الصلة لدراسة كلا النو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب الاعتراف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس (R01GM084135 هجن) ومؤسسة ميزوتاني جليكوسسينسي (منحة #110071 هجن)، وهي ممتنة للي ف توم للمناقشات والاقتراحات المتعلقة الاختبارات، وسبيروس أرتافانيس-تساكوناس، "هوغو بيلين"، روبرت فليمينغ، إيرفين كين ومركز الموارد الجينومية المورفولوجية (دجرك) البلازميدات وخطوط الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بيوويتاكر شنايدر s ذبابة الفاكهة المتوسطة, معدللونزا04-351Q
HyClone البنسلين-ستربتومايسين 100X حلGE Healthcare lifescience SV30010
CELLSTAR 6 بئر لوحةGreiner Bio-One657 160
CELLSTAR 24 لوحة بئرGreiner Bio-One662160
VWR شاكر صغيرMarshell Sceintific12520-956
مقياس الدمFisher Sceintific 267110
كاشف التعداء FuGENE HDPromegaE2311
MEGAscrip T7 Transcription KitAmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (طقم تنقية الحمض النووي الريبي)Zymo ResearchR1054
VistaVision المجهر المقلوبVWR
9MP USB2.0 كاميرا رقمية + برنامج متقدمAmScopeالحصول على الصور MU-900باستخدام برنامج ToupView
استخراج الهلام السريع PureLinkالأبقار الجنين
GenDepotF0600-050
MethotrexateSigma-AldrichA6770-10
Hygromycin BInvitrogenHY068-L6
كبريتات النحاسماكرون للكيماويات الدقيقة4448-02
خلايا S2InvitrogenR69007
S2-SerrateTom < / sup>cellsهدية من R. Fleming (Fleming et al ، Development ، 2013)
خلايا S2-DeltaDGRC152
S2-Notch cellsDGRC154
pMT-Delta vectorDGRC1021هدية من S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrateمن كين إيرفين (Okajima et al ، JBC ، 2003)
pMT-Notch vectorDGRC1022هدية من S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPهدية من Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step< em> مجموعةالنظام الحيوي التطبيقي1611091
TaqMan مقايسة التعبير الجيني ل CG9996 (شمس)النظام الحيوي التطبيقيDm02144576_g1 مع صبغة FAM-MGB
TaqMan مقايسة التعبير الجيني ل CG7939 (RpL32)Dm02151827_g1النظام الحيوي التطبيقيمع صبغة FAM-MGB
الأنظمة الحيوية التطبيقية 7900HT نظام PCR سريع في الوقت الحقيقينظام Biosystem 435140596-bed وحدة كتلة
مجموعة مصل K210012 هدية ناقلات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Notch Drosophila S2

مقالات ذات صلة