ويقدم البروتوكول الحالي إجراءات تجريبية لحفز الضامة مثقف أن تتمتع بالقدرة على إطلاق سراح الجزيئية العوامل التي تعزز ثمرة نورت. علاج مخيم إلى ثقافات المشارك العصبية-بلعم يستحث الضامة لإنتاج مكيفة المتوسطة التي تمتلك قوي نورت ثمرة النشاط.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ويقدم البروتوكول الحالي إجراءات تجريبية لحفز الضامة مثقف أن تتمتع بالقدرة على إطلاق سراح الجزيئية العوامل التي تعزز ثمرة نورت. علاج مخيم إلى ثقافات المشارك العصبية-بلعم يستحث الضامة لإنتاج مكيفة المتوسطة التي تمتلك قوي نورت ثمرة النشاط.
وهناك أدلة قوية على أن الضامة يمكن المشاركة في تجديد أو إصلاح الجهاز العصبي المصاب. هنا، نحن تصف بروتوكول الذي يتم التي يسببها الضامة إلى متوسط إنتاج مكيفة (سم) يعزز ثمرة نورت. حادة فصل الكبار الظهرية جذر العقدة (DRG) الخلايا العصبية ومطلي. بعد ثابت يتم إرفاق الخلايا العصبية، الضامة البريتوني تربى المشترك على إدراج ثقافة خلية مضافين على نفسه جيدا. يتم نقل ديبوتيريل دوري أمبير (db-مخيم) يتم تطبيقه على ثقافات المشارك ح 24، بعد إدراج ثقافة الخلية تحتوي على الضامة إلى بئر أخرى لجمع سم ح 72. سم من ثقافات المشارك تعامل مع db-مخيم، عندما يطبق على ثقافة العصبية DRG الكبار منفصلة، يسلك نورت قوية ثمرة النشاط. سم تم الحصول عليها من ثقافات db-مخيم-معاملة تتكون من خلية واحدة نوع وحدها، أما من العصبية DRG أو بلعم البريتوني، لا يحمل نورت ثمرة النشاط. وهذا يشير إلى أن التفاعل بين الخلايا العصبية والضامة لا غنى عنها لتفعيل الضامة إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت في سم. وهكذا، كما ستكون مفيدة لدراسة الإشارات بين الخلايا في التفاعل بلعم العصبية لحفز الضامة أن هبت النمط الظاهري برو-التجدد نموذجنا ثقافة المشارك.
مجموعة متنوعة من دراسات سعت إلى تعزيز التجدد إكسون الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابات النخاع الشوكي أو الدماغ. ويعتقد تقليديا ردود الفعل الملتهبة، حتما المصاحبة للإصابات في الجهاز العصبي، للمشاركة في العمليات المرضية الثانوية مما يؤدي إلى نتائج ضارة1،2. وفي الواقع، هو methylprednisolone التي يمكن قمع ردود الفعل الملتهبة العلاج المعتمدة فقط ل إصابات النخاع الشوكي الحادة3. ومع ذلك، قدمت دراسات أكثر حداثة الأدلة أن الضامة، نوع خلية الملتهبة ممثل، يمكن المشاركة في تجديد أو إصلاح الجهاز العصبي المصاب4،،من56. على سبيل المثال، تسلل الضامة عقب عدسة إصابة جزيئات برو-التجدد منتجات لتعزيز تجديد العقدة الشبكية العصبية7،8. وبالإضافة إلى ذلك، زيادة زرع الخلايا العصبية DRG إكسون النمو يصل المنطقة حيث تم تفعيل الضامة قبل زيموسان9. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء الضامة في موقع الآفة بيئة نمو متساهلة لإصابة الأعصاب المحيطية10.
عملنا أيضا قدمت أدلة قوية على أن الضامة يمكن أن تسهم في قدرة التجدد إكسون في الخلايا العصبية المجاورة. وقد أظهرنا أن تم تفعيل الضامة في العقد الجذرية الظهرية (DRG) عنصرا أساسيا في تعزيز قدرة التجدد DRG الخلايا العصبية الحسية عقب preconditioning الطرفية العصبية إصابة11. وذكر إجراء بحوث مماثلة بشكل مستقل من مختبر آخر12. ونحن كما أظهرت أن حقن إينتراجانجليونيك من ديبوتيريل سيكليك أمبير (db-مخيم)، وجزيء معروفة جيدا لتعزيز قدرة التجدد إكسون13، الناجم عن تفعيل الضامة. إبطال مفعول الضامة إلغاء آثار db-مخيم على نورت ثمرة النشاط. وحددت الأعمال اللاحقة التعبير الناجمة عن الإصابة من CCL2 في الخلايا العصبية كإشارة لحفز الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد14،15.
استناداً إلى النتائج التجريبية المذكورة أعلاه، وقد أنشأنا نموذجا في المختبر تشبه الأحداث الجزيئية التي تحدث في باﻷسعار عقب إصابة نموذج11،بريكونديتيونينج14. في هذا النموذج، يتم تطبيق db-مخيم ثقافات المشارك العصبية-بلعم التماس بين الخلايا مما يشير إلى أن يؤدي إلى تفعيل الضامة مع النمط الظاهري برو-التجدد. هنا، نحن وصف مفصل البروتوكولات التي يمكن أن تتولد لدينا الضامة التي تفرز الجزيئية عوامل تعزيز نورت ثمرة (الشكل 1). يوضح هذا النموذج التجريبي من مفهوم أنه يمكن حفز الضامة أو المستحث لدعم التجديد إكسون عقب إصابة الجهاز العصبي. سيكون من المفيد أيضا لنا نموذجا في دراسة الآليات التي تؤدي إلى تفعيل الضامة برو-التجدد في الإشارات بين الخلايا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وافق جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام اللجنة العجو كلية الطب في جامعة.
1-الثقافة إعداد الخلايا العصبية معزولة DRG الكبار
2-ثقافة المشارك ف "الضامة البريتوني" ريماري على إدراج الثقافة الخلية A
ملاحظة: إنشاء ثقافات المشارك ح 4 بعد الطلاء الأولى من الخلايا العصبية DRG منفصلان
3-معاملة Db-المخيم وجمع بلعم سم
ملاحظة: بدء العلاج db-مخيم ح 4 بعد ثقافات المشارك بلعم العصبية.
4-نورت ثمرة المقايسة مع سم المجمعة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ونحن تصف بروتوكول التي يمكن أن تولد الضامة قادرة على إفراز العوامل الجزيئية مع نشاط ثمرة نورت. وأسفرت بلعم سم تم الحصول عليها من ثقافات المشارك تعامل مع db-مخيم ثمرة نورت قوية عند تطبيقه على ثقافة العصبية DRG منفصلة (الشكل 2A). وبالمقارنة، سم تم الحصول عليها من ثقافات المشارك تعامل برنامج تلفزيوني لا يحدث ثمرة نورت في مدة 15-ح الثقافة لدينا (الشكل 2). عند التعامل مع db-مخيم للثقافة مع بلعم وحدها، سم تم الحصول عليها من هذا الشرط ل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد هذا النظام الثقافي المشترك. أنها هامة لضمان أن تكون مستعدة بالماوس DRG الخلايا العصبية والضامة البريتوني طازجة وصحية. لقد شهدنا نورت تقلص ثمرة نشاط مجلس الوزراء عند التشريح لجميع باﻷسعار استغرق أكثر من 30 دقيقة. وباﻹضافة إلى ذلك، تلوث مكونات الدم في الضامة البريتوني أدى أيضا إلى انخفاض النشاط ثمرة نورت في مجلس الوزراء. من أجل الحصول على تفاعل بلعم العصبية قوية بمعسكر db، الغسيل شامل سيكون أيضا خطوة حاسمة لضمان إتمام إزالة الحطام الأنسجة وإزالة المتبقية المحتملة السامة للخلايا المكونا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
ويدعم هذا البروتوكول منحة جبهة الخلاص الوطني-2015R1A2A1A01003410 من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل، وجمهورية كوريا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إدراج ثقافة الخلية غشاء PET شفاف 0.4 & mu ؛ م حجم المسام | كورنينج ، فالكون | 353090 | غشاء PET شفاف مع 0.4-& مو ؛ م حجم المسام ، للوحة 6 آبار |
| 70-& مصفاة خلايا النايلون م | Corning ، Falcon | 352350 | |
| منزلق ثقافة 8 آبار | Biocoat 354632 | مع تطبيق موحد ل Poly-D-Lysine | |
| المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase من Clostridium histolyticum< / em> | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific ، Gibco | 21103-049 | يحتوي على 1٪ جلوتاماكس و 1٪ مكمل بنيسيلين ستربتومايسين |
| B-27 ، خال من المصل | Thermo Fisher Scientific ، محلول جيبكو | 17504-044 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific ، Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific ، Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine هيدروبروميد | سيجما-ألدريتش | P6407-5MG | |
| لامينين | ثيرمو فيشر علمي ، إنفيتروجين | 23017-015 | |
| أدينوزين 3 '، 5'أحادي فوسفات دوري ، N6< / sup> ، O2'-dibutyryl- ، ملح الصوديوم | Merck Millipore Corporation ، Calbiochem | 28745 | |
| 10٪ مصل الماعز | العادي Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung للكيماويات والمعادن | 8566-4405 | |
| مكافحة بيتا ؛ III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | الفأر الجسم المضاد أحادي النسيلة |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي | Thermo Fisher Scientific ، Invitrogen | A11005 | |
| مقياس الدم | Marienfeld-Superior | N / A | |
| ثقافة الخلايا CO2< / sub> حاضنة | باناسونيك | N / A | |
| المجهر | المجسمكارل زايس | ستيمي DV4 | |
| تويست شاكر | FINEPCR | Tw3t | |
| جهاز طرد مركزي منضدي | سورفال | N / A | |
| مجهر متحد البؤر | أوليمبوس أمريكا إنك | IX71 | |
| FBS (مصل الأبقار الجنينية) | VWR International ، Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (أدوات العلوم الجميلة) | 16021-14 | ستانلس ستيل ، 14 سم ، منحني ، مقص دقيق أحادي |
| الحركة - كربيد التنجستن & ToughCut | FST (أدوات العلوم الدقيقة) | 14558-11 | حاد ، مسنن |
| Dumont # 7 ملقط | FST (أدوات العلوم الدقيقة) | 11272-30 | Dumoxel ، 0.07 × 0.04 مم ، مقص |
| زنبركي منحني Vannas | FST (أدوات العلوم الدقيقة) | 15000-00 | مستقيم ، 3 مم متطورة ، حاد |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | الإدخال: 115 فولت تيار متردد |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.