المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
المعرفة الحالية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)-الاتصالات خلية يترجم إلى الدراسات الكبيرة الثقافة في المختبر (2D) ثنائي الأبعاد حيث يتم عرض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة كطلاء سطح. وهذه النظم الثقافة تشكل تبسيطا للطبيعة المعقدة للأنسجة ECM التي تشمل تشكيل البيوكيميائية وهيكل وخصائص ميكانيكية. لمحاكاة أفضل الاتصالات ECM-خلية تشكيل المكروية القلب، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ديسيلولاريزيشن قلب الجنين كله وأنسجة البطين الأيسر الكبار اكسبلانتس في نفس الوقت للدراسات المقارنة. البروتوكول يجمع بين استخدام مخزن مؤقت ناقص التوتر، مطهر خصائص السطح أنيونى، ومعاملة الدناز دون أي اشتراط للمهارات المتخصصة أو المعدات. تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن عبر عينات الأنسجة من مواضيع عصر مختلف نهج بديل لإجراء دراسات مقارنة. يسمح هذا البروتوكول تحديد الاختلافات الهيكلية فريدة من نوعها عبر الجنين والكبار القلب ECM مش والبيولوجية الخلوية الردود. وعلاوة على ذلك، هذه الوثيقة يوضح منهجية تطبيق أوسع نطاقا يجري تطبيقها بنجاح في أنسجة أخرى والأنواع مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة، كما هو الحال في خزعات الأمعاء البشرية والرئة الماوس.
المقدمة
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكة دينامية من الجزيئات التي تنظم العمليات الخلوية الهامة، إلا وهي مصير قرار،1،انتشار والتفريق2. وقد أجريت التحقيق في تفاعلات الخلية-ECM أساسا في ثنائي الأبعاد (2D) في الثقافات الأنابيب المغلفة مع مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تشكل تبسيط خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية الموجودة في فيفو. ديسيلولاريزيشن يولد اللاخلوي بيوسكافولدس ECM 3D تشبه إلى حد كبير الحفاظ على بنية الخلية وتكوين الأنسجة الأصلية والأجهزة3،4. بالإضافة إلى خدمة السقالات النشطة بيولوجيا لهندسة الأنسجة، الخارجة ديسيلولاريزيد الحيوية ECM 3D كمنصات جديدة لتقييم بيولوجيا الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة هذا التوازي المجراة في البيئة.
تقييم الدور التفاضلية لمكونات ECM أنسجة متميزة وأجهزة والعمر ستستفيد باستخدام بروتوكولات مماثلة لتوليد بيوسكافولدس الأصلية. في القلب، وقمنا بتطوير بروتوكول متعدد الاستخدامات ديسيلولاريزيشن عينات الأجنة والمستمدة من الكبار، كنهج بديل لإجراء دراسات مقارنة المكروية الجهاز. استخدام هذه المنهجية، استولت المكروية القلب الأصلي وأظهرت أن يعزز ECM الجنين غلات تعمير لخلايا القلب5. ديسيلولاريزيشن توفير مزيد من تحديد هوية المقيم الاختلافات الهيكلية بين ECM الجنين والكبار على مستوى ترتيب شبكة مصفوفة الصفيحة الطابق السفلي وبيريسيلولار والألياف تكوين5. قبل هذا العمل، أبلغ مقارنة وجها لوجه للأنسجة في مختلف مراحل التحور باستخدام نفس النهج ديسيلولاريزيشن فقط للقرد الريسوسي الكليتين وقلوب القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يقدم عدد محدود من الدراسات الأنسجة الجنينية/الجهاز ديسيلولاريزيشن في حد ذاتها5،،من67. وقد تم ذلك باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي كعامل ديسيلولاريزيشن فريدة من نوعها؛ ومع ذلك، استخدمت متميزة الحزب الديمقراطي الصربي تركيزات ديسيلولاريزيشن الجنين والكبار من أنسجة القلب7،8. الحزب الديمقراطي الصربي هو واحد من المنظفات الأيونية الأكثر فعالية لإزالة المواد النووية وحشوية، وتستخدم على نطاق واسع في ديسيلولاريزيشن لمختلف الأنسجة والعينات9،من10. المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من الحزب الديمقراطي الصربي، وفترات طويلة من التعرض لها قد يرتبط تمسخ البروتين، فقدان glycosaminoglycan (الكمامات) واضطراب ييفات الكولاجين10،11، ومن ثم التوازن بين إزالة الحفاظ عليها وخلية إدارة المحتوى في المؤسسة أمر ضروري. لتطبيق نفس الإجراء على أنسجة قلب الجنين والكبار، يتم تقسيم البروتوكول الموضحة هنا في ثلاث خطوات متتابعة: خلية تفسخ بصدمة ناضح (المخزن المؤقت ناقص التوتر)؛ سولوبيليزاتيون تفاعلات البروتينات الدهنية والبروتين الحمض النووي والبروتين-بروتين (الحزب الديمقراطي الصربي 0.2 ٪)؛ وإزالة المواد النووية (الدناز المعاملة).
لدينا بروتوكول يظهر العديد من المزايا: أنا) إمكانية أي ما يعادل ديسيلولاريزيشن من أنسجة القلب سن معينة من تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن؛ ثانيا) أي متطلبات للأساليب المتخصصة أو المعدات؛ ثالثا) جاهزة التكيف للأنسجة والأنواع الأخرى كما أنها قد طبقت بنجاح مع تعديلات طفيفة في خزعات الأمعاء البشرية12 والماوس الرئة13؛ والأهم من ذلك، رابعا) يمكن معالجة خصائص النشاط الحيوي ECM حين تمكن الجمعية العامة الثقافات مثل 3D أورجانوتيبيك أكثر عن كثب تحاكي ملامح الجزيئية المكروية الأنسجة الأصلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أقر جميع المنهجيات ووصف i3S لجنة الأخلاقيات الحيوان و Direção دي Geral Veterinária (دجاف)، وهي وفقا للبرلمان توجيه 2010/63/الأوروبي.
1-إعداد الحلول ديسيلولاريزيشن
ملاحظة: ديسيلولاريزيشن جميع الحلول ينبغي تصفيتها من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر والمخزنة لمدة أقصاها 3 أشهر، باستثناء تعيين خلاف ذلك.
- لبرنامج تلفزيوني س 1: مزيج ز 8 من كلوريد الصوديوم، ز 1.01 Na2هبو4 200 مغ بوكل، و 200 مغ من خ2ص4 مع 900 مل مياه (المياه دي). ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.5 وحجم الحل النهائي حتى لتصفية ل. 1، اﻷوتوكﻻف، ومخزن الحل في درجة حرارة الغرفة (RT).
- ناقص التوتر من المخزن المؤقت (10 ملم تريس، يدتا 0.1 ٪): حل ز 1.21 من تريسباسي وز 1 يدتا في 900 مل مياه. ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم/HCl وحجم الحل النهائي إلى 1 ل. تصفية وتعقيم قبل اﻷوتوكﻻف وتخزينها في الرايت
- لحل الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% (0.2% الحزب الديمقراطي الصربي، 10 مم تريس): إضافة 0.6 غ من تريسباسي و 1 غ من دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في 400 مل مياه دي ويقلب عند 60 درجة مئوية حتى انحلال ذائبة كاملة. السماح لإيجاد حل لتهدئة لضبط الرايت الحل الأس الهيدروجيني إلى 7.8 وحجم الحل النهائي إلى 500 مل. تعقيم الحل عن طريق الترشيح.
ملاحظة: ينبغي إعداد حل الحزب الديمقراطي الصربي قبل الاستخدام. الحل تصفية فقط بعد إكمال حل الحزب الديمقراطي الصربي، وإلا سوف تشبع الجزيئات غير قابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي عامل التصفية، تغيير تركيز الحزب الديمقراطي الصربي النهائي و وبالتالي يؤثر على كفاءة ديسيلولاريزيشن الأنسجة. - ناقص التوتر من المخزن المؤقت يغسل (10 ملم تريس): مزيج ز 1.21 من تريسباسي في 900 مل دي المياه. ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.8 والحجم النهائي لتصفية ل. 1 وتعقيمها قبل اﻷوتوكﻻف وتخزينها في الرايت
- لعلاج الدناز (20 مم تريس، 2 مم مجكل2, 50 يو/مليلتر الدناز): حل ز 2.42 من تريسباسي و 2 مل من م 1 MgCl2 في 900 مل مياه دي. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.8 وحجم الحل النهائي إلى 1 ل. تصفية وتعقيم الحل قبل اﻷوتوكﻻف. تخزين الحل في "الرايت إضافة الدناز" أنا (50 ش مل) قبل استخدامها.
- الدناز أنا الأسهم الحل: إعداد المخزن مؤقت الدناز الذي يحتوي على 50% والغليسيرول، 20 مم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 1 مم مجكل2، وضبط حجم 10 مل مع المياه دي حل نهائي. في غطاء الاندفاق الصفحي، إضافة الدناز مسحوق إلى المخزن المؤقت الدناز، وتخلط بلطف حتى حل كامل. تعقيم الحل عن طريق 0.22 ميكرومتر التصفية. تحضير مختبرين 1 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
2-الأنسجة الحصاد ونعد
- Euthanize الكبار من الإناث الحوامل في 18 يوما الحمل (E18 الأجنة) عن طريق الخنق2 CO. القيام العملية قيصرية على الإناث مع مقص جراحية وجمع قرون الرحم آخذة الفئران الجنينية إلى طبق بتري مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 x باستخدام الملقط مسنن اثنين مع أطراف منحنية (الملاقط واحد لكل نهاية القرن).
- فتح ابواق الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين لعزل الأجنة. نقل الأجنة في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني x 1 المثلج تخدير لهم وقطع رأس مع مقص.
- Euthanize 7-8 أسابيع من العمر C57BL/6 ذكور الفئران باستخدام الخنق2 CO. تنفيذ شق على كل الصدر الماوس وجمع القلب.
- باختصار شطف قلوب الأجنة والبالغين مع الجليد الباردة 1 x برنامج تلفزيوني.
- إزالة الاذينين القلب الكبار مع المساعدة من مشرط. تنفيذ شق على البطين الأيمن وإزالته باستخدام مقص صغير مباشرة. تعرض الجدار الداخلي البطين الأيسر عن طريق إزالة الحاجز. في طبق بتري جديد، تقسيم البطين الأيسر مجاناً-الجدار في شرائط طولية بسمك 2 مم وإزالة العضلات الحليمية استخدام المبضع، والملقط مسنن بأطراف منحنية.
- المكوس explants النسيج الصغيرة مع المساعدة من مشرط استخدام شبكة 2 × 2 مم (وصف مفصل في تكميلية 1 الشكل5). باختصار شطف الأنسجة explants مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- إضافة ~ 250 ميليلتر من قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) في مجمع لأنابيب ميكروسينتريفوجي يعقم 1.5 مل. نقل الجنين كله قلوب والكبار explants القلب إلى الأنابيب مع 250 ميليلتر من أكتوبر وتجميدها مع تبريد الثلج الجاف إيسوبينتاني ومخزن في-80 درجة مئوية (بحد أقصى لمدة 6 أشهر).
ملاحظة: سيقلص استخدام أنسجة القلب explants cryopreserved لأكثر من 6 أشهر كفاءة ديسيلولاريزيشن، لا سيما في explants أنسجة القلب الكبار.
3-الأنسجة ديسيلولاريزيشن
ملاحظة: يتم ديسيلولاريزيشن أنسجة القلب بصفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع عينة واحدة كل بئر. يتم إضافة 1 مل من كل حل ديسيلولاريزيشن لكل فرد كذلك. ينبغي إجراء جميع خطوات ديسيلولاريزيشن مع الانفعالات 165 لفة في الدقيقة (حاضنة شاكر مع مداري قطرها 20 مم) وعند 25 درجة مئوية، ما لم يحدد خلاف ذلك. للحصول على مزيد من التفاصيل، الرجاء مراجعة المخطط على الشكل 1A. الامفوتريسين B (مثل فونجيزوني) والجنتاميسين طازجة تضاف إلى جميع الحلول ديسيلولاريزيشن قبل استخدامها لتركيز نهائي 2.5 ميكروغرام/ملليلتر و 0.01 ميكروغرام/مل، على التوالي. لتحديد مقدار الحمض النووي الاحتفاظ داخل الأنسجة ديسيلولاريزيد، واحتياجات عينة جماعية تحدد قبل بدء تشغيل بروتوكول ديسيلولاريزيشن. بروتوكول الكمي الحمض النووي هو زيادة مفصلة في القسم 5.1.
-
يوم 1
- إزالة عينات الأنسجة من الثلاجة-80 درجة مئوية. اترك مل 1.5 أنابيب ميكروسينتريفوجي على RT حتى يصبح ذاب جزئيا في أكتوبر. نقل كتلة أنسجة القلب OCT لا تزال مجمدة على طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- بعد أن يذوب أكتوبر، نقل أنسجة القلب إلى طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني 1 x. كرر عينات المياه والصرف الصحي في 1 × برنامج تلفزيوني و 60 لفة في الدقيقة مع شاكر عن 10-15 دقيقة على الأقل مرتين.
- أضف 1 مل من العمل "ناقص التوتر المخزن المؤقت" كل من صفيحة العقيمة زراعة الأنسجة 24-جيدا جيدا. نقل عينة واحدة كل بئر بمساعدة الملقط.
- نقل لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع العينات إلى شاكر حاضنة عند 25 درجة مئوية والبدء في الحضانة ح 18 مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر".
-
يوم 2
- إعداد حل الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% كما هو موضح في الفرع 1-3.
- نضح "المخزن المؤقت ناقص التوتر" وغسل العينات مع برنامج تلفزيوني 1 x 1 حاء كرر 3 مرات.
ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت: يمكن الاحتفاظ بالنسيج تحت ديسيلولاريزيشن في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية عن ح 18 في ظروف ثابتة. - إزالة برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 مل من الحزب الديمقراطي الصربي تقدم طازجة (خطوة 1.3) حل كل بئر واحتضان عينات ح 24.
ملاحظة: (راجع النقطة) "وظيفة الحزب الديمقراطي الصربي" الحضانة، ضمان أن عينات المعرض بيضاء للمظهر شفافة. في هذه الخطوة، تعامل الحزب الديمقراطي الصربي العينات هي غارق في الحمض النووي، تبين وجود اتساق مثل الجيلاتين. إزالة حل الحزب الديمقراطي الصربي ببطء لتجنب التصاق عينة لنصيحة ماصة.
-
يوم 3
- غسل العينات مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر يغسل" (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات.
ملاحظة: في هذه الخطوة، فإنه من الطبيعي أن نلاحظ انخفاضا في حجم العينة نتيجة لإزالة مخلفات الخلية. نقطة الإيقاف المؤقت: الأنسجة تحت ديسيلولاريزيشن يمكن أن يوضع في "المخزن المؤقت ليغسل ناقص التوتر" عند 4 درجة مئوية عن ح 18 في ظروف ثابتة. - أضف 1 مل من محلول "العلاج الدناز" كل بئر واحتضان هذه العينات ح 3 في 37 درجة مئوية.
- نضح الحل "العلاج الدناز" وغسل العينات مع 1 x برنامج تلفزيوني (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات. أداء يغسل نهائي مع برنامج تلفزيوني 1 x (1 مل كل بئر) بين عشية وضحاها في الرايت وتهز 60 لفة في الدقيقة.
- (نقطة تفتيش) بعد العلاج الدناز، ضمان أن العينات ديسيلولاريزيد فقدوا الاتساق مثل الجيلاتين.
ملاحظة: بعد العلاج الدناز، إزالة وإضافة 1 x PBS بلطف حيث يمكن بسهولة أكمنة عينات وتعلق على الحافة ماصة.
- غسل العينات مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر يغسل" (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات.
4-تقييم لإزالة خلايا الأنسجة ديسيلولاريزيد
- إصلاح العينات في صفيحة زراعة الأنسجة 24-حسنا، 1 عينة الواحدة وكذلك، عن طريق إضافة 1 مل محايدة تقدم طازجة الفورمالين 10% المخزن المؤقت مع 0.03 في المائة ثم مائي ح 2.5-3 في الرايت
ملاحظة: يتم إضافة ويوزين إلى مثبت لوصمة عار الأنسجة ديسيلولاريزيد وتخفيف التصور عينة خلال تمزيقها وتلطيخ نسيجية. إضافة ويوزين لا يتداخل مع البقع النسيجي لا مع تقنيات الفلورة. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم التثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. - إزالة الحل مثبت وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لغسل العينة.
- تغليف بيوسكافولدس الثابتة في جل معالجة الأنسجة باستخدام قالب عينة الفينيل القابل للتصرف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- إزالة جل علم الأنسجة بالعينة جزءا لا يتجزأ من العفن ونقل إلى خزعة تجهيز/تضمين "أشرطة الكاسيت" مع غطاء.
ملاحظة: بديل للأنسجة التضمين في علم الأنسجة وتجهيز جل لمعالجة كل عينة في الأسفنج خزعة اثنين مع المسام الصغيرة. يجب أن تكون مترجمة العينات إلى مركز الأسفنج خزعة لتمكين الكشف عن. من المذكرة، يكون من الصعب على ترجمة هذا النهج باستخدام بعض العينات. - معالجة العينات البارافين التضمين من خلال إينكوبيشنز المتعاقبة (30 دقيقة لكل حل) في سلسلة من تركيزات الكحول (70%، 80%، 90%، 100 ٪، 100 ٪)، إيسوبارافينيك الهيدروكربونية الاليفاتيه الحل (مراكز حضانة 2) والكيروسين (الحضانة 2 محطات) في 56 درجة مئوية.
- تحميل العينات في كتلة بارافين.
- قص 3 ميكرومتر سميكة البارافين الفروع المتعلقة مبضع وجمع المقاطع على الشرائح الزجاجية المجهر.
- مقاطع البارافين الجافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم تخزين المقاطع البارافين (وقفه نقطة) في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. - للتحقق من فعالية البروتوكول، أداء هيماتوكسيلين وويوزين (H & E) و Trichrome ماسون لتلطيخ (طن متري) من المقاطع عينة ديسيلولاريزيد وإلى أجزاء من الأنسجة غير معالجته وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: ح & ه تلوين البقع خلية نويات أزرق/أرجواني، السيتوبلازم الظلام الوردي الأحمر والوردي شاحب الكولاجين والنقل المتعدد الوسائط بقع من نواة سوداء والسيتوبلازم أحمر، والكولاجين والميوسين الأزرق. ديسيلولاريزيشن كفاءة ويتحقق عند وردي الخفيفة المسامية (H & E، طن متري) ويلاحظ الأزرق (MT) شبكة، في غياب وصمة عار النووية.
5-تقييم لإزالة المواد النووية الأنسجة ديسيلولاريزيد
ملاحظة: يجب إجراء التقدير الكمي لمحتوى الحامض النووي في أنسجة ديسيلولاريزيد بالمقارنة مع الأنسجة غير التلاعب بها كل منهما.
- قبل ديسيلولاريزيشن، تزن أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على نطاق رقمية عالية دقة. نقل الأنسجة القلبية إلى الأنبوب وإزالة كمية إضافية من برنامج تلفزيوني 1 x وتزن الأنبوب مع العينات. حساب الوزن الرطب من العينات:
عينةمن الوزن الرطب = وزن الأنبوبة مع عينات – وزن الأنبوبة فارغة - ديسيلولاريزي العينات كما هو موضح في الخطوة 3.
- وبعد ديسيلولاريزيشن، جمع الأنسجة ديسيلولاريزيد في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- بسبب أبعاد صغيرة والجماهيري لعينات القلب فرادى ومجموعة المواصفات، تجمع الأنسجة ديسيلولاريزيد لكل شرط عينة (قلب الجنين: 5 قلوب كله؛ والكبار LV explants: 15 explants). تنفيذ نفس الإجراء مع الأنسجة عدم التلاعب بها.
ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) العينات التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي، والتقدير الكمي.
- بسبب أبعاد صغيرة والجماهيري لعينات القلب فرادى ومجموعة المواصفات، تجمع الأنسجة ديسيلولاريزيد لكل شرط عينة (قلب الجنين: 5 قلوب كله؛ والكبار LV explants: 15 explants). تنفيذ نفس الإجراء مع الأنسجة عدم التلاعب بها.
- قطع غير التلاعب وديسيلولاريزيد الأنسجة explants الصغيرة مع مساعدة مشرط في طبق بتري نظيفة.
ملاحظة: استخدام المبضع الفردية وطبق بيتري لكل عينة. اختلال ميكانيكية للعينات مع مشرط يسهل الهضم الأنزيمي الخلفي، واستخراج الحمض النووي اللاحقة. - لاستخراج الحمض النووي، استخدام أسلوب عمود دوران على أساس استخراج الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- جمع العينات ميكانيكيا ينتابها من طبق بيتري مع الهضم الرئيسي المخزن المؤقت (المخزن المؤقت الهضم والبروتيناز ك) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام تلميح ماصة واسعة فوهة.
ملاحظة: تحلل الأنسجة مع "ك بروتيناز" الهضم أسرع في عينات ديسيلولاريزيد. لتجهيز عينات متميزة في نفس الوقت، الاحتفاظ بعينات تفكيك على الجليد، حتى يتم تفكيك جميع العينات إلى أدنى حد من التدهور. ويتحقق تحلل عينات كاملة بين ح 4-6. - المضي قدما في البروتوكول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- لزيادة الغلة من الحمض النووي المستخرج من عينات الأنسجة ديسيلولاريزيد وغير ديسيلولاريزيد، الوت الحمض النووي في ميكروليتر 25-50 و 100 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت، على التوالي. جمع الحمض النووي الوتيد وتحميل تدور العمود. احتضان لمدة 1 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي الرايت العينات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: يمكن (وقفه نقطة) المستخرجة من العينات "الحمض النووي" مخزن في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- جمع العينات ميكانيكيا ينتابها من طبق بيتري مع الهضم الرئيسي المخزن المؤقت (المخزن المؤقت الهضم والبروتيناز ك) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام تلميح ماصة واسعة فوهة.
- تحديد كمية الحمض النووي المستخرج من العينات مع مجموعة كشف دسدنا نيون اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- تطبيع محتوى الحمض النووي نانوجرام من الحمض النووي في مليغرام من عينة أولية من الوزن الرطب (قبل ديسيلولاريزيشن).
6-ديسيلولاريزيد السقالات خلية البذر
ملاحظة: جميع الحلول/الكواشف تحتاج إلى أن تكون عقيمة وتنفيذ الإجراءات بأكملها في ظروف معقمة.
- إعداد x DPBS 1 مع 2.5 ميكروغرام/مل من الامفوتريسين B و 1% P/S (البنسلين، 100 وحدة دولية؛ ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل).
- إزالة 1 × الحل برنامج تلفزيوني من آخر خطوة الغسيل ديسيلولاريزيشن (الخطوة 3.3.3) وإضافة 500 ميكروليتر كل بئر الطازجة (1) x دببس/2.5 ميكروغرام/مل من محلول B/1% P/S الامفوتريسين. تخزين العينات في 4 درجات مئوية من 1-7 أيام.
ملاحظة: تخزين العينات في 4 درجات مئوية من المهم الحفاظ على العقم. - أضف P/S خلية الإعلام القاعدية (دون FBS والمكملات الغذائية) إلى تركيز نهائي من 1%.
- نضح 1 x دببس/2.5 ميكروغرام/مل من محلول B/1% P/S الامفوتريسين من العينات ديسيلولاريزيد. إضافة 500 ميكروليتر كل من الخلية القاعدية media/1% P/S جيدا وترك عينات حجته ح 1 في 37 درجة مئوية، أو عند 4 درجة مئوية لأكثر من ح 1.
- تقسيم خلايا اهتمام وتحضير مختبرين صغيرة من الخلايا في خلية الكثافة المرغوب.
ملاحظة: بذر الأنسجة ديسيلولاريزيد يجب إجراء تحت مجهر مجسمة وفي ظروف معقمة. خلية ثقافة وسائل الإعلام يجب أن يحتوي على 1% P/s. - "الماصة؛" 3-4 ميكروليتر من دببس إلى مركز بئر صفيحة 96-جيدا. استخدام ملاقط رقيقة والمستقيم، نقل السقالات ديسيلولاريزيد لإسقاط دببس وإزالة دببس إضافية بالطموح وتأكد من أن العينة لا مطوية أو التجاعيد. فلتصبح جافة في الحواف لتنضم إلى السطح جيدا.
ملاحظة: قد فصل السقالات أقل كفاءة البذر. - إضافة خلايا إلى السقالة التي بيبيتينج الحل خلية واحدة ببطء ضد حواف البئر.
ملاحظة: على سبيل المثال، كارديوميوسيتيس الفئران حديثي الولادة هي المصنف مع كثافة 7500 خلايا/مم2 والماوس مخلدة لين− السلف القلب خلايا Sca-1+ (المركزهيئة الأوراق المالية-1) في كثافة 60-1,500 الخلايا/مم2. ضبط كثافة الخلية وفقا للمنطق التجريبي. - إضافة دببس إلى الآبار المجاورة لتجنب التبخر سريع وسائل الإعلام.
- 24 ساعة بعد خلية البذر، إذا انضمت إلى ألواح البوليسترين زراعة الأنسجة (باﻻتصال)، نقل نوع الخلية المستخدمة بيوسكافولدس إلى بئر جديدة. خلاف ذلك، قم باستبدال المتوسط إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة.
- تغيير بعناية وسائل الإعلام وفقا للمتطلبات المحددة لنوع الخلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وينبغي تقييم كفاءة ديسيلولاريزيشن من خلال التقنيات الرئيسية الثلاثة: المراقبة العيانية، وعلم الأنسجة والكمي الحمض النووي. ويؤثر العيانية مظهر عينات بوست--الحزب الديمقراطي الصربي العلاج غير مباشر فعالية إزالة خلية. بعد حضانة الحزب الديمقراطي الصربي، يجب أن تظهر العينات شفافة إلى بيضاء (الشكل 1). الجنين (E18) ديسيلولاريزيد الأنسجة تتميز ببنية شفافة جداً بينما explants الكبار شفافة لمظهر اللون الأبيض. مظهر أكثر بياضا يرتبط عموما بشبكة إدارة المحتوى في المؤسسة ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو meshwork ديناميكية للغاية ومعقدة من glycoproteins الليفي ولاصقة، تتكون من خزان من الببتيدات النشطة بيولوجيا وفخ النمو عوامل عديدة. المغير الرئيسية التصاق الخلايا وديناميات cytoskeleton، حركية والهجرة، وانتشار، والتمايز والمبرمج، تنظم إدارة المحتوى في المؤسسة بنشاط وظيفة الخلوية والسلوك. مع العلم أن يختلف سلوك الخلوية في 2D و 3D الثقافات، بذلت جهود لتطوير نماذج أورجانوتيبيك الرواية التي يمكن دقة تحاكي بيئات الأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، برز ديسيلولاريزيشن الأنسجة كأسلوب بديل للطب الهن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب مدينون لجميع الأعضاء في مختبر بينتو-دو-Ó للمناقشة الهامة ذات الصلة. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا Programa الفقرة Ciência ه تكنولوجيا (إقليم العاصمة الاتحادية) في إطار مشروع "المهندسة كارديوستيم أنسجة القلب والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للقلب والأوعية الدموية التطبيقات" (ميتب-السل/اللجنة الاقتصادية لأوروبا/0013/2013). A.C.S. حاصلة على زمالة إقليم العاصمة الاتحادية [سفره/BD/88780/2012] و M.J.O. وهو "زميل إقليم العاصمة الاتحادية" (إقليم العاصمة الاتحادية-المحقق عام 2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| < قوي > المعدات < / قوي > | |||
| احتضان | هزازات مدارية | IKA: 3510001 | الموصى |
| به - | المعدات المتاحة | ||
| مقياس الوزن الرقمي | - | المعدات المتاحة | |
| المجهر المقلوب | - | المعدات المتاحة | |
| حاضنة زراعة الخلية | - | المعدات المتاحة | |
| ثلاجة (4 & ordm; ج) | - | المعدات المتاحة | |
| ديب فريزر (-80 & ordm; ج) | - | المعدات المتاحة | |
| Microtome | - | المعدات المتاحة | |
| < قوية > أدوات Cirurgical < / قوية > | |||
| Vannas مقص زنبركي - 2.5 مم | أدوات العلوم الدقيقة | المتطورة 5000-08 | الموصى |
| Dumont 5 ملقط ناعم - Biologie / Inox | Fine Science | Tools 11254-20 | الموصى به |
| Dumont 7 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11272-30 | |
| مقص تشريح موصى به ، مستقيم | - | أداة متوفرة | |
| ملقط ، مسنن ، منحني | - | أداة | |
| متوفرة <قوية > مواد < / قوية > | |||
| 24 ألواح بئر ، ملفوفة بشكل فردي | VWR | 29442-044 | - |
| 96 لوحة بئر ، ملفوفة بشكل فردي | VWR | 71000-078-Steriflip-GV | |
| ، 0.22 & micro ؛ م ، PVDF ، ميليبور المعقم بالإشعاع | SE1M179M6-Eppendorff | ||
| - | المواد المتاحة | ||
| 15 مل أنابيب الصقر | فيشر Scientific | 430791-50 | |
| مل أنابيب الصقر | فيشر Scientific | 430829-أربع | |
| حجرات معالجة الخزعة / تضمين الكاسيت مع علم | المجهر الإلكتروني | للغطاء 70075-B | - |
| مجهر فيشربراند سوبر فروست بلس | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 22-037-246 | - |
| <قوي>حفظ الأنسجة بالتبريد< قوي> شاندون | |||
| برايومتريكس تضمين الراتنج | الحراري العلمي | 6769006-2-ميثيل | |
| بوتان اللامائي 99 +٪ (إيزوبنتان) | سيجما ألدريتش | 277258-1 لتر-الثلج | |
| الجاف- | - | ||
| <قوي>إزالة الخلايا < / strong> | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364-Na | |
| 2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma-Aldrich | S-31264-KH | |
| sub>2< / sub>PO4< / sub> | Sigma-Aldrich | P5379-100g-KCl | |
| سيجما ألدريتش | P8041-1KG-TrisBASE | ||
| سيجما-ألدريتش | T6066-500G-كبريتات | ||
| دوديسيل الصوديوم | سيجما-ألدريتش | L-4390-MgCl | |
| 2< / sub> | MERCK | 1.05833.1000-DNAse | |
| I | AplliChem | A3778،0050-Gentamicin | |
| Gibco | 15710-049 | - | |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026-منزوع | |
| الأيونات (DI water) | - | -- | |
| <قوي > الأنسجة < / قوي > | |||
| 10٪ فورمالين عازلة محايدة | Prolabo | 361387P-Eosin | |
| Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | يمكن استبداله باليوزين الكحولي |
| ريتشارد آلان Scientific HistoGel هلام معالجة العينات | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012-الإيثانول | |
| الكحول الإيثيليك 99،5٪ من أي | آغا | 4،006،02،02،00 | |
| - ماء منزوع الأيونات (DI water) | - | -- | |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915-Shandon | |
| Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | - |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini | Kit Thermo Fisher Scientific | ||
| K182001-Quant-iT PicoGreen مجموعة dsDNA | Invitrogen | P11496 | - |
| Cell culture< / strong> | |||
| DPBS | VWR | 45000-434-Penicillin-Streptomycin | |
| Solution 100X | Labclinics | L0022-100-Fungizone | |
| Gibco BRL | 15290-026-وسائط | ||
| زراعة الخلايا للخلية ذات الأهمية | - | - | - |
المراجع
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
- Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
- Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
- Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
- Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
- Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
- Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
- Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 4/23/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. The affiliations were updated.
The fourth affiliation was corrected from:
Gladstone Institutes, University of California San Francisco
to:
Gladstone Institute of Cardiovascular Disease
An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:
University of California San Francisco
الوسوم
