مقالة منهجية

نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة

DOI:

10.3791/56932

⸱

مايو 6, 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحقن المباشر حويصلات خارج الخلية المستمدة من السرطان (EVs) ويؤدي إلى إعادة برمجة نخاع العظام دعم تطور الورم؛ ومع ذلك، الخلايا التي تتوسط هذا التأثير غير واضح. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق EV بوساطة الخلايا الجذعية الورم الوسيطة (MSC) التفاعلات في فيفو، يكشف عن دور حاسم للمتعلمين EV MSCs في ورم خبيث.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داخل ورم المكروية، تسهم الخلايا الجذعية الوسيطة المقيم أو المعينين (MSCs) التدرج الخبيث في العديد من أنواع السرطان. تحت تأثير إشارات بيئية محددة، يمكن أن تطلق هذه الخلايا الجذعية البالغة الوسطاء paracrine مما يؤدي إلى نمو الأورام المعجل وورم خبيث. تعريف الحديث المتبادل بين الورم و MSCs من الأهمية فهم الآليات الكامنة وراء تطور السرطان، وتحديد أهداف جديدة للتدخل العلاجي.

الخلايا السرطانية تنتج كميات كبيرة من حويصلات خارج الخلية (EVs)، التي يمكن أن تؤثر تأثيراً عميقا في سلوك الخلايا المستهدفة في ورم المكروية أو في مواقع بعيدة. ورم EVs أرفق الجزيئات الحيوية الوظيفية، بما في ذلك الكشف التحريضية والبروتينات (أونكو)، التي يمكن تعليم الخلايا اللحمية لتعزيز السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية، أو للمشاركة في تشكيل المتخصصة قبل المنتشر. في هذه المقالة، يصف لنا تطوير نموذج الماوس السرطان الإكلينيكية التي تمكن من تقييم محدد للحديث EV بوساطة المتبادل بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة. أولاً، يصف لنا بتنقية وتوصيف المركبات الكهربائية يفرز الورم وتقييم استيعاب EV ب MSCs. ونحن ثم جعل استخدام المناعة على أساس حبة متعدد لتقييم تغيير التشكيل الجانبي التعبير سيتوكين MSC الناجمة عن السرطان المركبات الكهربائية. وأخيراً، توضح توليد نموذج الماوس إكسينوجرافت أورثوتوبيك طرحه أوستيوساركوما أن يلخص التفاعل الورم-ماجستير، وإظهار مساهمة المتعلمين EV MSCs لتشكيل الورم النمو وورم خبيث.

لدينا نموذج يتيح الفرصة لتحديد كيفية تشكيل المركبات الكهربائية السرطان بيئة داعمة للورم، وتقييم ما إذا كان حصار الاتصالات EV بوساطة بين الورم و MSCs يمنع تطور مرض السرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وورم المكروية تشارك بنشاط في معظم، أن لم يكن كلها، جوانب التقدم توموريجينيسيس والسرطان، بما في ذلك تشكيل ورم خبيث وتطوير المقاومة للتداوي1. هذا يؤكد الحاجة إلى نماذج الماوس سرطان أورثوتوبيك الإكلينيكية التي تسمح لتشريح ستروما الورم معقدة التفاعلات التي تحدث في مكانة الورم.

بين العديد من المكونات الخلوية لورم المكروية، تسهم الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة في تطور السرطان في العديد من أنواع السرطان مثل سرطان الثدي وسرطان البروستاتا، وأورام الدماغ، والورم النخاعي المتعدد و osteosarcoma2 ،3،،من45،،من67. MSCs هي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الموجودة في أنسجة البالغين والجنين المختلفة، بما فيها نخاع العظام والأنسجة الدهنية، والمشيمة، ودم الحبل السري وغيرها8،9. استجابة لإشارات تحريضية تولد السرطان، ترحيل نحو مواقع الورم MSCs وإدماج وورم المكروية والتفريق في نهاية المطاف إلى خلايا السرطان دعم10. هذه MSCs المرتبطة بالسرطان توفر العوامل الأساسية (أي، عوامل النمو، المستقطبات، السيتوكينات، ووسطاء كآبته) لتطور الورم يتصرف على الخلايا السرطانية و سدى المحيطة بها2، 3 , 11 , 12 , 13-في حين تم التحقيق آثار تعزيز الورم MSCs المرتبطة بالسرطان في العديد من النماذج السرطان، الآليات التي بواسطتها برمجة الخلايا السرطانية MSCs على تشكيل السرطان-تعزيز مكانة هي غير مفهومة. هنا يصف لنا الجيل من طراز إكسينوجرافت أورثوتوبيك التي تسمح على وجه التحديد دراسة التفاعل برو ورمي بين خلايا سرطان العظام و MSCs عبر الحويصلات خارج الخلية (EVs).

المركبات الكهربائية حاسمة وسطاء الاتصال بين الخلايا بين الورم والخلايا اللحمية14. المركبات الكهربائية تحمل الجزيئات الحيوية الوظيفية من الخلية الأصلية، بما في ذلك البروتينات والدهون، والكشف التنظيمي. بعد إطلاق سراحه في الفضاء خارج الخلية، هذه الحويصلات يمكن أن تتناولها الخلايا المحيطة بها أو نقلها إلى مواقع بعيدة عن طريق الدم أو الدورة اللمفاوية، ويمكن أن تترك آثاراً عميقة على سلوك الخلية المستهدفة. 15 , 16 , 17 على سبيل المثال، ينتج الإقبال على السرطان المركبات الكهربائية بالخلايا الليفية stromal في تمايز أرومية دعم الأوعية والتعجيل بالورم النمو في فيفو18،19، استيعاب غشائي يمكن تنشيط الأوعية ورم الخلايا وزيادة نفاذية الأوعية الدموية16،20، والتفاعل مع الخلايا المناعية قد تؤدي إلى قمع استجابة مناعية انتيتومور21.

نحن مؤخرا أثبتت، باستخدام نموذج أورثوتوبيك طرحه ماوس إكسينوجرافت من أوستيوساركوما، أن الخلايا السرطانية الإفراج عن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية التي تطالب MSCs للحصول النمط الظاهري برو الورمية والمحترفين المنتشر. هذا التأثير هو سبب تغيير جذري في الشخصية التعبير سيتوكين ماجستير (يشار إلى "ماجستير التعليم")، ويمكن منع الإدارة من الأجسام المضادة مستقبلات انترلوكين-6 العلاجية (إيل-6R)7. عملنا أثبتت أن السرطان المركبات الكهربائية هي المغيرون حاسم لسلوك لجنة السلامة البحرية، مما يوفر الأساس منطقي للنهج المكروية التي تستهدف وقف التقدم osteosarcoma. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق في EV بوساطة الورم. ماجستير تفاعل في فيفو. ويهدف هذا النموذج إلى: 1) على وجه التحديد وتحديد التعديلات التي يسببها EV السرطان من السلوك ماجستير في ورم المكروية، 2) تقييم كيفية إسهام هذا التفاعل إلى نمو ورم العظام وتشكيل ورم خبيث، و 3) دراسة ما إذا كان التدخل في EV بوساطة الحديث المتبادل في فيفو يمنع تطور مرض السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة الدهنية البشرية لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة التي تم الحصول عليها من قسم الجراحة التجميلية في مستشفى تيرجوي (هيلفرسوم، هولندا) بعد الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية المؤسسية وكتب الموافقة المستنيرة. تم الحصول على MSCs الدهنية الحاملات للتجارة والنقل من إدارة الطب والعلوم الجراحية للأطفال والكبار (جامعة مودينا وريدجو إميليا).

وأجريت تجارب على الحيوانات وفقا للقانون الهولندي على التجارب الحيوانية، والبروتوكول أقرته لجنة التجارب الحيوانية من المركز الطبي في "جامعة فو"، أمستردام، هولندا.

1-عزل يفرز الورم حويصلات خارج الخلية.

  1. إعداد المنضب EV المصل البقري الجنين (FBS) عن طريق سينتريفوجينج FBS في 70,000 س ز بين عشية وضحاها (16 ساعة)، لا الفرامل، عند 4 درجة مئوية دوار دلو يتأرجح فائقة باستخدام (نتوقع ح 1 للتباطؤ). بعناية بجمع المادة طافية (FBS المستنفد EV) دون الإخلال بيليه. تصفية FBS المستنفد EV مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  2. إعداد متوسطة الثقافة المنضب EV بتكميل المتوسطة (إيمدم "تعديل دولبيكو" ل Iscove) مع البنسلين يو/مليلتر 100، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، الجلوتامين 2 مم (1 × P/S/G) و 5% FBS المستنفد EV.
  3. البذور 3 × 106 143B الخلايا في قوارير2 175 سم والثقافة لهم في مستنبت المنضب EV في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. عندما تكون الخلايا روافد 80-90 ٪ (عادة بعد ح 36 إلى 48 ساعة)، جمع المادة طافية من 8 x 175 سم2 قوارير (28 مل في قارورة) لعزل EV.
  4. قبل إلغاء المادة طافية خلية لإزالة الحطام الخلية وخلايا بالطرد المركزي التفاضلية (سينتريفوجينج المادة طافية للدوران السابق في كل مرة) ووفقا لبروتوكول التالية:
    1. الطرد المركزي المادة طافية مرتين في 500 غرام x لمدة 10 دقائق.
    2. الطرد المركزي المادة طافية مرتين في 2000 غ س لمدة 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي المادة طافية مرتين في 10,000 ز س لمدة 30 دقيقة.
    4. أداء جميع سينتريفوجيشنز في 4 درجات مئوية مع أقصى تسارع وتباطؤ سرعة إعدادات. بعد كل خطوة، بعناية جمع المادة طافية المحتوية على EV، تاركين حوالي 1 مل. المضي قدما على الفور الخطوة 1.5 أو مخزن المجازين مكيفة المتوسطة في-80 درجة مئوية حتى عزلة EV.
  5. عزل المركبات الكهربائية التي سينتريفوجينج المتوسطة مكيفة المجازين مرة واحدة في 70,000 س ز ح 1، وبطء الفرامل، عند 4 درجة مئوية في أنابيب الترا--أجهزة الطرد المركزي (الحجم النهائي 38.5 مل/أنبوب) استخدام دوار دلو يتأرجح فائقة.
  6. بعناية إزالة المادة طافية، ترك حوالي 1 مل خلف، ريسوسبيند الكريات المحتوية على EV في حجم المتبقية وتجمع لهم في كل من أنبوب أولتراسينتريفوجي واحد وإضافة المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) حتى إكمال أنبوب الملء (الحجم النهائي مل 38.5).
  7. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 70,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية، دون الفرامل (نتوقع ح 1 للتباطؤ). بعناية إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه وترك 100-200 ميليلتر.
  8. ريسوسبيند EV-بيليه، وضبط وحدة التخزين النهائي إلى 200 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني (موحدة لجميع EV-العزلة). استخدام إعداد EV فورا أو تخزينها في-80 درجة مئوية حتى استخدام22.
    ملاحظة: يمكن تخزين المركبات الكهربائية إلى 6 أشهر في-80 درجة مئوية.

2-EV التوصيف.

يمكن تصور المركبات الكهربائية المنقي بانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)23.

  1. محضرات EV ميكس مع زيادة متساوية في حجم بارافورمالدهيد 4 ٪ في المخزن المؤقت للفوسفات.
  2. مش 200 معطف النيكل المغلفة من الكربون فورمفار تيم الشبكات مع 5 ميليلتر من تعليق ف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. ثبت العينات EV في شبكات تيم مع جلوتارالديهيدي 1% في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (pH 7.0)، على النقيض من أكسالات اليورانيل (pH 7.0)، وتضمين في خليط من 4% اليورانيل خلات و 2% الميثيل السليلوز بنسبة 1:9 على الجليد.
  4. إزالة الشبكات مع حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ ولطخة السوائل الزائدة مع أوراق الترشيح لضمان سماكة مناسبة الفيلم الميثيل السليلوز.
  5. بعد التجفيف، دراسة الشبكات مع انتقال إلكترون مجهر والتقاط الصور مع كاميرا رقمية بالإضافة إلى برنامج الصورة المقابلة.

3-التعليم MSCs بالمركبات الكهربائية المستمدة من الورم.

  1. إعداد ماجستير الثقافة المتوسطة بتكميل ألفا-الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (ألفا-MEM) مع 4% المنضب EV البشرية "ليستي الصفائح الدموية" (hPL)24والهيبارين (10 U/mL) و 1 × P/S/غ.
    ملاحظة: يتم الحصول hPL المستنفد EV على اتباع الإجراء الموضح في القسم 1-1.
  2. بذور 1.4 × 106 الدهنية المشتقة MSCs الواحدة 75 سم2 قارورة والثقافة لهم في متوسط المنضب EV ماجستير-الثقافة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  3. عند التوصل إلى التقاء 70% الخلايا، إضافة osteosarcoma 143B-أو التحكم في الخلايا البشرية الليفية (hf)-المركبات الكهربائية، 10 ميليلتر EV إعداد/سم2 من قارورة الثقافة. احتضان لمدة 24 ساعة، وإضافة نفس الكمية من المركبات الكهربائية لمدة 6 ساعات إضافية. ملاحظة: تستزرع الليفية البشرية في النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو) 10% FBS والمركبات الكهربائية معزولة كما هو موضح في المقطع 1.
  4. جمع المادة طافية ماجستير والطرد المركزي 1 x في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية (مع أقصى تسارع وتباطؤ سرعة إعدادات)، نقل إلى أنبوب جديد وتخزين المادة المطهرة طافية في-80 درجة مئوية لتمكين تحليل المستقبل سيتوكين (القسم 5).
  5. في فيفو تثقيف MSCs الحاملات للتجارة والنقل25 كما هو موضح في المقاطع 3.1 إلى 3.3 تجارب (المادة 6)، وجمع الخلايا وريسوسبيند لهم في برنامج تلفزيوني بتركيز نهائي 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر. الخلايا الحفاظ على الجليد حتى الحقن.

4-EV تدخيل المقايسة.

تصور EV امتصاص MSCs، تسمية المركبات الكهربائية مع صبغ رابط الفلورية الخضراء (جفلد) (متاح تجارياً) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة:

  1. بإيجاز، إضافة ميليلتر 180 من مخفف للإعدادية EV 200 ميليلتر. تمييع 1 ميليلتر من صبغة جفلد في 50 ميليلتر من مخفف، وإضافة 20 ميليلتر لصبغ المخفف للإعدادية EV المخفف.
  2. بلطف مزيج من بيبيتينج واحتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  3. إضافة 5 مل من جيش صرب البوسنة 0.1% في برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب الترا--أجهزة الطرد المركزي وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (الحجم النهائي 38.5 مل/أنبوب).
  4. الطرد المركزي س 1 في 70,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية، دون الفرامل (نتوقع ح 1 للتباطؤ). بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند المسمى EV-بيليه بحجم نهائي في 200 ميليلتر (ضبط حجم الصوت مع برنامج تلفزيوني).
  5. إضافة المركبات الكهربائية مسماة إلى ثقافة ماجستير أو تخزينها في-80 درجة مئوية. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، تقييم استيعاب حويصلة بالفحص المجهري الأسفار والتدفق الخلوي7.

5-تقييم MSC سيتوكين التعبير الشخصية.

  1. لتحديد مقدار متعدد انترلوكين-8 (إيل-8)، مكيفة انترلوكين-1β (إيل-1β)، انترلوكين-6 (إيل-6)، 10-انترلوكين (إيل-10)، وعامل نخر الورم (تنف)، ومستويات البروتين انترلوكين-12 ف 70 (إيل-12 ف 70) في لجنة السلامة البحرية المتوسطة (راجع الخطوة 3، 4)، استخدام سيتوميتريك المتاحة تجارياً حبة الصفيف (CBA) للبشرية السيتوكينات الالتهابية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. بإيجاز، مزيج الخرز التقاط الأجسام المضادة مترافق وإضافتها إلى كل فحص الأنابيب. إضافة تخفيف قياسي سيتوكين أو عينات متوسطة مكيفة للأنابيب.
  3. إضافة الكاشف الكشف واحتضان 3 ساعات في الرايت
  4. أغسل حبات مع الحل الغسيل التي تم توفيرها. قياس العينات استخدام سيتوميتير تدفق وتحليل البيانات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

6-جيل طراز الماوس إكسينوجرافت أورثوتوبيك من أوستيوساركوما.

  1. تسمح الفئران Athymic عارية-Foxn1nu عمره ست الأسبوع، أنثى، التأقلم لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل بدء الإجراءات التجريبية.
  2. إضافة يوم واحد قبل إجراء العمليات الجراحية والتسكين شبه المنطوق الباراسيتامول لمياه الشرب. تمييع "الحل باراسيتامول للأطفال" (انظر الجدول للمواد) مع الماء للحصول على تركيز نهائي 2 ملغ/مل. استناداً إلى كمية الماء متوسط 150 مل/كغ/يوم، ووزن جسم متوسط من 20 غرام، هذه الجرعة كافية للوصول إلى جرعة من 6 مغ/فأر/يوم (300 ملغ/كغ/يوم).
  3. مواصلة العلاج مسكن حتى 24 ساعة بعد العملية، أو لفترة أطول إذا كانت الحيوانات تظهر علامات الألم.
  4. في يوم العملية الجراحية، جمع مثقف لوسيفراس-إيجابية الخلايا 143B (فلك) (تم إنشاؤه مسبقاً بتوصيل لينتيفيرال) التي سينتريفوجينج في 300 غرام x لمدة 10 دقائق وريسوسبيند الخلايا بتركيز 2 × 105 خلايا/ميليلتر في برنامج تلفزيوني. إبقاء تعليق خلية على الجليد إلى 6 ساعات.
  5. اﻷوتوكﻻف المعدات الجراحية. إعداد وتنظيف منطقة عمل ووضع مقص معقم وملاقط على أوراق عقيمة. عشرون دقيقة قبل إجراء العمليات الجراحية (الخطوة 6.8)، حقن الحيوانات تحت الجلد مع البوبرينورفين (0.05 مغ/كغ، تضعف في المحلول الملحي 0.9 في المائة) كمسكن استخدام 0.5 مل الأنسولين المحاقن (29-قياس الإبرة).
  6. قبل أنيسثيتيزينج كل الحيوان، ملء حقنه 10 ميليلتر مع على الأقل 1 ميليلتر من تعليق خلية (فلك) 143B مركزة (راجع الخطوة رقم 6، 4).
  7. تخدير الحيوان مع التخدير استنشاق إيسوفلوراني (2-3% في الأكسجين). التحقق من مستوى التخدير بأصبع معسر الحيوان. عند الحيوان لا تستجيب معسر، أي أنه يتم تخديره من عميق، تطبيق مرهم على العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
  8. ضع الحيوان على ظهره مع الرأس في قناع تخدير والساقين نحو المشغل. فليكس في الركبة اليسرى. مسح الجلد مع الإيثانول 70% وتطبيق ليدوكائين (2 في المائة) مع تلميح القطن 3 مرات كمسكن محلي.
  9. استخدام سكين جراحية معقمة لإجراء شق صغير (حوالي 5 ملم) على الجلد فقط تحت الركبة لكشف الساق. حفر ثقب في الساق، حوالي 2 ملم تحت الركبة استخدام حفر تويست الصغرى 0.8 مم. كن حذراً لا لحفر من خلال كلا كورتيسيس الساق.
  10. حقن 1 تعليق خلية ميليلتر (حوالي 2 × 105 خلايا) ببطء (في حوالي 5 ثوان) في الحفرة باستخدام إبرة مقياس 26. إغلاق الثقب مع معالجة تجميعية غراء الأنسجة لمنع الدفق التعليق.
  11. إغلاق الجلد بخيوط شعيرات وقطره واحدة من الغراء الأنسجة. السماح استرداد الحيوان في بيئة دافئة جيدا (استخدام مصباح حرارة). لا تترك الحيوانات غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. إلا بعد الحيوانات هي تعافي تماما من التخدير، إعادتها إلى الأقفاص الخاصة بهم.
  12. حقن التطعيم الورم، بعد يومين من EV المتعلمين أو MSCs السذاجة الحاملات للتجارة والنقل (106 خلايا في 100 ميليلتر PBS، راجع الخطوة 3، 5) عن طريق الوريد مع حقنه الأنسولين 0.5 مل في هذا السياق ذيل من الفئران.
  13. تتبع نمو الورم بالإضاءة الحيوية التصوير26 مرتين في أسبوع. وتحقيقا لهذه الغاية، إدخال القائمة الفئران مع 150 ميليلتر د-لوسيفرين (30 ملغ/مل) مع حقنه الأنسولين. عشرة دقيقة بعد الحقن، ضع الحيوانات في الإضاءة الحيوية نظام تصوير وقياس الفوتون-التدفق التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا السرطانية.
  14. وباﻹضافة إلى ذلك، قياس القطر من العظام-الورم الرئيسي مع قدمه ذات الورنيّة. ويقدر حجم الورم (في ملم3) قبل العرض × الطول2 × 0.5.
  15. ملاحظة: يتم تعريف نقاط النهاية إنسانية كقطر الورم > فقدان الوزن أو 15 ملم > 15%.

7-تقييم عدد العقيدات الرئة

  1. عندما يصل أحد الحيوانات إلى نقطة النهاية إنسانية محددة في الخطوة 6، 14 (في حوالي 3-4 أسابيع)، إنهاء التجربة وجمع وتحليل جميع الأنسجة ذات الصلة.
  2. عشرة دقيقة قبل يوثانيزيشن، حقن 150 ميليلتر د-لوسيفرين (30 ملغ/مل) مع حقنه الأنسولين 0.5 مل.
  3. تخدير الحيوانات مع التخدير استنشاق isoflurane (راجع الخطوة 6.7). تأكيد عمق التخدير بسبب غياب ردود فعل الماوس إلى أخمص القدمين معسر. Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم27.
  4. جمع الرئتين والكبد والطحال والكلى باستخدام مقص معقم وملاقط. تغسل الأجهزة في برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الدم ووضعها على طبق بيتري.
  5. ضع طبق بيتري مع الأجهزة في الإضاءة الحيوية نظام التصوير. قياس الإشارات الإضاءة الحيوية في كلا الجانبين من الأجهزة. فورا بعد قياس، يغرق الأجهزة في 4% فورمالين ثبت لهم (24-72 ساعة، في RT) للتحليل النسيجي في المستقبل.
  6. معالجة الصور التي يتم الحصول عليها مع برامج التصوير المناسبة بالعتبة اليدوي. حساب العدد العقيدات الرئة في كل صورة. حساب العدد الإجمالي للعقيدات الرئة على كلا الجانبين من الرئتين.

8-نسيجية تحليل

  1. التحليل النسيجي لانسجة الرئة:
    1. تضمين أجهزة ثابتة الفورمالين في البارافين وإعداد 6 شرائح الأنسجة ميكرومتر.
    2. ديبارافيناتي أنسجة الرئة الشرائح وإجراء استرجاع مستضد المغلي عليهم لمدة 15 دقيقة في المخزن المؤقت لسترات 0.01 متر (الرقم الهيدروجيني 6).
    3. احتضان الشرائح أفقياً في درجة حرارة الغرفة مع فيمنتين الإنسان المضادة الأجسام المضادة (200 ميكروغرام/مل) المخفف 1:150 في جسم-مخفف (متاح تجارياً)، وفيما بعد مع جسم التعليم الثانوي، المسمى برنامج الصحة الإنجابية (0.5 ملغ/مل، وتمييع 1: 500). وصمة عار الأنسجة مع 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) وتلطيخ العداد الهيماتوكسيلين.
    4. مراقبة الشرائح الأنسجة الملطخة مجهر بصري بالإضافة إلى الكاميرا المقابلة والصور والبرمجيات باستخدام.
  2. لتقييم وجود MSCs الحاملات للتجارة والنقل في تيبياس الماوس:
    1. ديكالسيفي تيبياس في حمض الإيثيلين (يدتا) 0.24 م، الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4. تحديث المخزن المؤقت يدتا كل يوم حتى العظام تصبح مرنة (حوالي أسبوع واحد).
    2. يذوي tibias والتسلل منها مع البارافين. تضمين تيبياس (بما في ذلك الأنسجة osteosarcoma) في كتل البارافين.
    3. استخدم مبضع لإعداد 6 مقاطع البارافين ميكرومتر. وضع المقاطع البارافين على الشرائح الزجاجية. بعد التجفيف، تخزين الشرائح بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    4. إجراء استرداد الحرارة بوساطة مستضد استخدام سترات المخزن المؤقت (انظر 8.1.2) ووصمة عار الأنسجة مع الأضداد المضادة-التجارة والنقل (كامل أنتيسيروم) في إضعاف 1:900 في جسم مخفف. كونتيرستين الأنسجة مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
    5. نلاحظ شرائح الأنسجة مجهر الأسفار بالإضافة إلى برنامج التصوير المقابلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، فإننا استكشاف قدرة يفرز osteosarcoma المركبات الكهربائية لتثقيف MSCs نحو النمط الظاهري برو الورمية والمحترفين المنتشر. ونحن تبين أن الخلايا osteosarcoma الإفراج عن المركبات الكهربائية مثل اكسوسومي التي يتم استيعابه من MSCs. نحن قياس تغيير التشكيل الجانبي التعبير سيتوكين MSC الناجمة عن السرطان المركبات الكهربائية، وتقييم أثر MSCs EV المتعلمين على نمو الورم وتشكيل ورم خبيث. التمثيل العام لتصميم الدراسة يتضح في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يغير يفرز الورم حويصلات خارج الخلية (EVs) فسيولوجيا الخلايا الوسيطة المحلية والبعيدة إيجاد بيئة داعمة لورم. هنا يصف لنا توليد نموذج الماوس الإكلينيكية osteosarcoma يسمح التشريح EV بوساطة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في فيفو. نظهر أن يعزز حقن النظامية من الأورام البشرية MSCs المتعلمين EV في الفئران التي تحمل osteosarcoma تكثيفها بقوة تشكيل النمو وورم خبيث سرطان بتفعيل مسار الإشارات إيل-6/STAT37.

وقد أظهرت الدراسات الأخي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد على زمالة بالإيطالية رابطة كل سول ريشيركا la كانكرو (التحكيمية) الممول من الاتحاد الأوروبي، Baglio ر. س. وبالإضافة إلى ذلك، تلقي هذا المشروع التمويل من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار بموجب المنحة ماري سكلودوفسكا-كوري لا 660200 (إلى Baglio ر. س).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> المعدات< / قوي>
طرد مركزي فائقبيكمانأوبتيما L-90K
الدوار SW32Tiبيكمان369650يشار إليه في المخطوطة باسم دوار دلو فائق التأرجح
مجهر إلكتروني ناقلZeissEM109أو ما شابه ذلك TEM
كاميرا رقميةنيكونDMX 1200Fأو كاميرا مماثلة
برنامج التصوير TEM نيكونACT-1
المجهر الفلوريZeissImager.D2أو ما شابه ذلك من المجهر الفلوري
برنامج التصوير FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
الطرد المركزيHettickROTANTA 460R-80
FreezerThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburأو مقياس التدفق
المماثل DrillFermFCT-300مع مثقاب 0.8 مم
HSS مثاقب تويست صغيرة ، 0.8 ممProxxon28 8520.8 مم مثقاب
IVIS كاميراXenogenIvis Luminaيشار إليها في المخطوطة باسم كاميرا التلألؤ الحيوي. Xenogen هو الآن جزء من برنامج صور Perkin Elmer
Living2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen هو الآن جزء من Perkin Elmer
10 & micro. L حقنةهاميلتونالأعصاب موديل 1701 RN
إبرة: إبرة هاميلتون RN للحقنة ، مقياس 26 ، Pointstyle AS ، طول مخصص 2 سمهاميلتونn.a.الفرجار
ميتوتويوG08004463
الأوتوكلافأستلn.a.Heat
مصباحفيليبسn.a.
<قوية > ثقافة وسائل الإعلام < / قوية>
مصل الأبقار الجنينيهيكلونRYG35912
الصفائح
متوسطلونزاBE12-722F
ألفا MEM متوسطلونزاBE02-002F
DMEM متوسطلونزاBE12-614F
قلم / بكتيريا / جلوتامينجيبكو10378-016
الهيبارينLEO012866-08
التربسين / EDTA (10x)GIBCO15400-054
<الخلايا القوية> القوية <>
الدهنية الخلايا الجذعيةn.a.n.a.gfp
إيجابية الخلايا الجذعيةالليفية
n.a.n.a.a.n.a.
143B خلاياATCCCRL-8303
خلايا FLUC-143BATCCCRL-8303قوارير
محولة <قوية > مستهلكات < / قوية >
ثقافة 175 سم 2أنابيب CELLSTAR660175
50 مل أنابيبGreiner bio-one210261
FreezeThermoscientific377224
يشار إلى أنابيب فائقة الوضوحبيكمان344058في المخطوطة باسم أنابيب الطرد المركزي الفائقة
0،22 & micro; مرشح mMillexSLGV033RS
200 شبكة شبكات النيكل المطلية بالكربونEMS (علوم المجهر الإلكتروني)
0.5 مل محاقن الأنسولين مع إبرة 29GTerumoU-100 & nbsp ؛
طبق بتريسيجما - AldrichP7612
ورق ترشيح  ثيرمو فيشر العلمي50363215
<قوي > الكواشف / المجموعات < / قوي >
بارافورمالدهايدألفا إيسر43368.9M
PBSبراون220 / 12257974/110
جلوتارالديهايدEMS (علوم المجهر الإلكتروني)16300
أوكسالات اليورانيلEMS (المجهر الإلكتروني العلوم)22510
أسيتات اليورانيEMS (علوم المجهر الإلكتروني)22400
ميثيل السليلوزEMS (علوم المجهر الإلكتروني)1560
PKH67Sigmamini67-1ktيشار إليها في المخطوطة باسم GFLD
BSASigmaA8412
CBA - مجموعة السيتوكين الالتهابي البشريBD551811
الفورمالديهايد 37٪VWR104003100
شفرات جراحية من الصلب الكربونيSwann-Morton206يشار إليها في المخطوطة باسم السكين الجراحي
المضاد للإنسان الفيمنتين المضادسانتا كروزsc-6260استنساخ V9
مخفف الأجسام المضادةDAKOS0809
HRP المضادة للفأر IgGالحياة32230
DAB-kitDAKOK500711
هيماتوكسيلينسيجماGHS232
EDTA-buffer
buffern.a.n.a.rabbit
الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل GFPAbcamn.a.Ab290
DAPI لايف تكنولوجيزD1306
باراسيتامول ، 120 مجم / 5 مل شراببايرإن إيهسيناسبريل ، محلول باراسيتامول للأطفال
إيزوفلوران 1000 مجم / جمصيدلية فومكn.a.buprenofine
هيدروكلوريد ، 0.3 مجم / ملIndivior UK Limited
2٪صيدلية Vumcn.a.70
٪ إيثانولVWR93003.1006
غراء الأنسجةDerma + Flex ، صيغ طبي سيانواكريليتVygonLB604060
قطرات العين: Vidisec Carbogel ، 2 مجم / ملBausch + Lombn.a.D-luciferin
، ملح البوتاسيومالتكنولوجيا الحيوية الذهبيةLUCK-1
شرائح زجاجيةThermo Scientific630-0954
الفولاذ المقاوم للصدأ  ؛n.a.n.a.
mice experiments< / strong>
mice, hsd: athymic nude-Foxn1nu,  أنثى ، 6 أسابيع عند الوصول ، تتوافق الحالة البكتيرية مع FELASAENVIGOn.a.Paper-pulp
المنزل الذكي (إثراء القفص)Bio Servicesn.a.Alpha-dri
مواد الفراشShepperd الأوراق المتخصصةn.a.
طعام الفأر: Teklad Global 18٪ بروتين القوارض الغذائيةENVIGO2918-11416M
خيوطEthiconV926H
مقصSigma-AldrichS3146-1EA(أو ما شابه)
ملاقطSigma-AldrichF4142-1EA(أو ما شابه ذلك)
جهاز الحركة أجهزة الخلوي الدموية n.a.n.a.IMDM الزاهرية تقنيات n.a.n.a.citrate n.a.lidocaine-HCL حلقات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة