الحصول على جودة عالية المجينية الحمض النووي من أنسجة الورم خطوة أولى أساسية لتحليل التعديلات الوراثية باستخدام تسلسل الجيل القادم. في هذه المقالة، نحن نقدم طريقة بسيطة وسريعة لإثراء الخلايا السرطانية والحصول على الحمض النووي سليمة من لمس بصمة عنق العينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من المهم تحديد حالة حيث في السرطان قبل الإدارة والعلاج العقاقير المستهدفة جزيئية محددة لمرضى السرطان. في الإعداد السريرية، الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (FFPE) تستخدم على نطاق واسع للاختبارات الجينية. ومع ذلك، FFPE الحمض النووي عموما أضرار ومجزأة أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين. ولذلك، "فب الحمض النووي" ليس أحياناً كافية للاختبارات الجينية بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي. هنا نقدم طريقة للمس بصمة علم الخلايا (عرة) للحصول على الحمض النووي من الخلايا السرطانية، التي يمكن ملاحظتها تحت مجهر. يمكن تقييم أرقام الخلية مورفولوجيا وسرطان الخلية باستخدام عينات عرة. وعلاوة على ذلك، استخراج الحمض النووي من عينات التشنج يمكن أن تكتمل في غضون يومين. وكان إجمالي كمية ونوعية من "عرة الحمض النووي" التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب أعلى من "الحمض النووي فب". يسمح هذا الأسلوب السريع والبسيط الباحثين للحصول على الحمض النووي عالي الجودة للاختبارات الجينية (مثلتحليل تسلسل الجيل القادم، بكر الرقمية والوقت الحقيقي الكمي PCR) وتقصير المدة اللازمة للإبلاغ عن النتائج.
المقدمة
الجيل القادم تكنولوجيا التسلسل وقدم الباحثون أوجه التقدم الكبير في تحليل المعلومات الجينوم في الاختلافات الوراثية والأمراض مندلية والاستعداد الوراثي والسرطان 1،2،3 . أطلس جينوم السرطان (تكجا)، واتحاد جينوم السرطان الدولية (إيكجك) اتبعت تحديد التعديلات الوراثية في عدة أنواع من السرطانات الشائعة4. مئات جينات سائق السرطان الأساسية قد حددت بنجاح، وبعض هذه الجزيئات مستهدفون للمخدرات التنمية1،،من56.
في الإعداد السريرية، يشيع استخدام العين....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تيك التحضير لتقييم مجهرية سريعة لاستخدام الزجاج العادي الشرائح
- تنفيذ إعداد عرة وقت ممكن بعد تتوفر مواد الأنسجة المرضية الإكلينيكية. إذا كان لا يمكن مباشرة إعداد العينات عرة، الحفاظ على هذه المواد الأنسجة مغطاة بالمياه المالحة مبلل شاش معقم وتخزينها في الثلاجة لمنع جفاف الأنسجة.
- إعداد3 5 ملم أنسجة المواد مثل الأورام الصلبة (مثلاً، والكبد والرئة وأنسجة الثدي) حصل سريرياً بالجراحة أو المناظير.
- بلطف يمسح الأنسجة مع مغلفة بالمحلول الملحي الفسيولوجي شاش معقم وإزالة الدم، إذا كان سطح الأنسجة لديها الكثير من الدم.
- للحصول على عينات مجهرية مثل المواد خزعة، تبقى العينة مبلل مع غارقة في المحلول الملحي الفسيولوجي شاش معق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 العملية برمتها من إعداد العينات عرة لاستخراج الحمض النووي. جدير بالذكر أن يستغرق الإجراء يومين فقط للحصول على الحمض النووي من عينات عرة. نحن تقييم أية آثار لتخزين الورم قبل تجهيز الشريحة. ووجدنا أن الخلايا السرطانية كانت تعلق على شريحة الزجاج عندما تم التطرق عينات الأنسجة مباشرة على الشريحة، وعندما الأنسجة وأبقى في المالحة ترطب العقيمة-شاش ح 1 (الشكل 2). ومع ذلك، عندما الأنسجة تم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة، خ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة، وقد عرضنا طريقة بديلة للحصول على الورم الحمض النووي من العينات المرضية السريرية استخدام عرة. إعداد عرة بسيطة جداً وتحتاج إلى وقت أقل بالمقارنة مع أساليب فب، دون الحاجة إلى أدوات خاصة10. يمكن إكمال كافة الإجراءات من إعداد عرة لاستخراج الحمض النووي في غضون يومين (الشكل 1). ومن ثم يقصر هذا الأسلوب الزمنية اللازمة لإجراء الاختبارات الجينية. جدير بالذكر أن هذا يوفر ميزة كبيرة في تقصير عدد الأيام اللازمة للتحليل الجزيئي. هذا الزمنية قصيرة يتيح لنا أن نقدم فو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونشكر جميع الموظفين الطبية والتبعية للمستشفى والمرضى لموافقتها على المشاركة. ونحن نشكر "غابرييل الأبيض وولف"، دكتوراه، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذا التقرير. وأيد هذه الدراسة معونات "مشروع بحوث الجينوم" من محافظة ياماناشي (أي إتش ومو) ومنحة من ياسودا الطبية مؤسسة (أي إتش).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| FINE FROST white20 زجاج منزلق صغير | Matsunami Glass ind، Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN غشاء زجاجي شرائح | حراري فيشر العلمي | LCM0522 | |
| Cyto حل سريع | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE مجموعة الأنسجة | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Recode | Kit Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay من FFPE DNA QC ASSAY V2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | ثيرمو فيشر العلمي | 4346907 | |
| ميكروأمبير فيلم لاصق بصري | ثيرمو فيشر العلمي | 4311971 | |
| ميكرو ميكس E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| VIIA 7 نظام PCR في الوقت | الحقيقي ثيرمو فيشر العلمي | VIIA7-03 | |
| هيماك CF16RXII | هيتاشي كوكي | CF16RII | |
| مكتبة أيون طقم القياس الكمي TaqMan | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress محولات الباركود 1-16 كيت | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Set Sequencing Kit (200 قاعدة) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| أيون شيف نظام | ثيرمو فيشر العلمي | 4484177 | |
| فيريتي 96 بئر حراري سايكل | ثيرمو فيشر العلمي | فيريتي 200 | |
| أيون 318 رقاقة كيت v2 BC | ثيرمو فيشر ساینيتفيك | 4488150 | |
| أيون PGM نظام | ثيرمو فيشر العلمي | PGM11-001 | |
| أيون PGM 2 طقم زجاجة | حراري فيشر Scientific | A25591 | |
| Agencourt & trade; AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| حامل مغناطيسي ذو 16 وضعا | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| غير لاصق ، أنابيب Microfuge خالية من RNase ، 1.5 مل (أنبوب ربط منخفض) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| ماء خال من Nuclease | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp&trade ؛ لوحات تفاعل بصرية 96 بئر | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp&trade ؛ فيلم لاصق واضح | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt & trade ؛ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| الإيثانول (99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| هيدروكسيد الصوديوم (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS ماصة L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS ماصة L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| ماصة LTS L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS ماصة L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS + | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| للطرد المركزي | WAKEN | MODEL8864 | |
| صغيرة للطرد المركزي WAKEN | WKN-2290 | حاضنة هواء | |
| SensiCare قفازات فحص النتريل الخالية من البودرة | MEDLINE | SEM486802 | |
| شاش معقم | ثلاجة أوساكي | 11138 | |
| MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| ريشة تشذيب ريشة | ريشة رقم 130 | ||
| تشذيب | رقم 260 | ||
| ريشة S | ريشة | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | خلاط دوامة |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 مل microtube | بيوبيك | RC-0150 |
المراجع
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
