يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

10.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56943

⸱

مارس 21, 2018

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

في هذه المقالة

ملخص

الحصول على جودة عالية المجينية الحمض النووي من أنسجة الورم خطوة أولى أساسية لتحليل التعديلات الوراثية باستخدام تسلسل الجيل القادم. في هذه المقالة، نحن نقدم طريقة بسيطة وسريعة لإثراء الخلايا السرطانية والحصول على الحمض النووي سليمة من لمس بصمة عنق العينات.

الملخص

من المهم تحديد حالة حيث في السرطان قبل الإدارة والعلاج العقاقير المستهدفة جزيئية محددة لمرضى السرطان. في الإعداد السريرية، الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (FFPE) تستخدم على نطاق واسع للاختبارات الجينية. ومع ذلك، FFPE الحمض النووي عموما أضرار ومجزأة أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين. ولذلك، "فب الحمض النووي" ليس أحياناً كافية للاختبارات الجينية بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي. هنا نقدم طريقة للمس بصمة علم الخلايا (عرة) للحصول على الحمض النووي من الخلايا السرطانية، التي يمكن ملاحظتها تحت مجهر. يمكن تقييم أرقام الخلية مورفولوجيا وسرطان الخلية باستخدام عينات عرة. وعلاوة على ذلك، استخراج الحمض النووي من عينات التشنج يمكن أن تكتمل في غضون يومين. وكان إجمالي كمية ونوعية من "عرة الحمض النووي" التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب أعلى من "الحمض النووي فب". يسمح هذا الأسلوب السريع والبسيط الباحثين للحصول على الحمض النووي عالي الجودة للاختبارات الجينية (مثلتحليل تسلسل الجيل القادم، بكر الرقمية والوقت الحقيقي الكمي PCR) وتقصير المدة اللازمة للإبلاغ عن النتائج.

المقدمة

الجيل القادم تكنولوجيا التسلسل وقدم الباحثون أوجه التقدم الكبير في تحليل المعلومات الجينوم في الاختلافات الوراثية والأمراض مندلية والاستعداد الوراثي والسرطان 1،2،3 . أطلس جينوم السرطان (تكجا)، واتحاد جينوم السرطان الدولية (إيكجك) اتبعت تحديد التعديلات الوراثية في عدة أنواع من السرطانات الشائعة4. مئات جينات سائق السرطان الأساسية قد حددت بنجاح، وبعض هذه الجزيئات مستهدفون للمخدرات التنمية1،،من56.

في الإعداد السريرية، يشيع استخدام العينات FFPE المرضية التشخيص والاختبارات الجزيئية للأمراض المختلفة، بما في ذلك السرطان. ومع ذلك، أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين، البروتين الحمض النووي أو الحمض الخلوي الصبغي DNA العابرة للربط يحدث وفعل تجزؤ الحمض النووي. وهكذا، عينات من "الحمض النووي فب" ليست دائماً مناسبة للتحليل الجيني بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي7،،من89. بالإضافة إلى ذلك، يستغرق عدة أيام لإعداد العينات فب، والمهارة التقنية اللازمة لإعداد دقة المقاطع. لذلك، من المستحسن لتطوير طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية سليمة الحمض النووي.

علم الخلايا طريقة بديلة لتشخيص المرضية. إعداد عينة الخلوية أبسط، أقل النهج باهظة الثمن، وأكثر سرعة بالمقارنة مع إعداد فب10. وقد أجريت تقنية تيك على الحارس الغدد الليمفاوية والأنسجة هامشية من مرضى سرطان الثدي للمضاعفات التشخيص السريع لبعض السنوات11،12. ومع ذلك، هناك عدد قليل من التقارير التي درست ما إذا كان يمكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة من العينات عرة، وتستخدم للتحليل الجيني اللاحقة. عينات الخلوية عادة ملطخة بابانيكولاو (Pap) أو تلطيخ جيمسى، وكنا ذكرت سابقا أن كمية ونوعية من الحمض النووي المستخرج من عينات عرة (لا سيما العينات الملطخة جيمسى) تعلو على العينات التي تم الحصول عليها من فب 13من الأنسجة. وبالمقارنة مع تلطيخ Pap، تلطيخ Giemsa لديه ميزة التي تتطلب إجراءات المصبوغة أقل. في تلطيخ Pap، بعد أن تم إصلاح العينات والملون، يجب تحميل مع تصاعد المتوسطة (مثلاً، مالينول) للتمييز بين محتويات نموذج، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية والخلايا الملتهبة تحت مجهر. إذا كانت العينة Pap مستعدة دون خطوة متصاعدة، من المستحيل تقريبا لمراقبة الخلايا تحت مجهر لأن العينة هو المجففة. وبالمقارنة، تلطيخ Giemsa يمكن ملاحظتها في الدولة المجففة، ولذلك الخطوة تصاعد ليس ضروريا للتقييم السريع الخلوية. ميكروديسيكشن، جيمسى تلطيخ أكثر ملاءمة لأنها تتطلب العينات الجافة.

في هذا التقرير، علينا الأخذ بطريقة بسيطة وسريعة لإعداد العينات التشنج مع تلطيخ Giemsa وتثبت أن التشنج أفضل مصدر للحمض النووي مقارنة مع العينات فب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-تيك التحضير لتقييم مجهرية سريعة لاستخدام الزجاج العادي الشرائح

  1. تنفيذ إعداد عرة وقت ممكن بعد تتوفر مواد الأنسجة المرضية الإكلينيكية. إذا كان لا يمكن مباشرة إعداد العينات عرة، الحفاظ على هذه المواد الأنسجة مغطاة بالمياه المالحة مبلل شاش معقم وتخزينها في الثلاجة لمنع جفاف الأنسجة.
  2. إعداد3 5 ملم أنسجة المواد مثل الأورام الصلبة (مثلاً، والكبد والرئة وأنسجة الثدي) حصل سريرياً بالجراحة أو المناظير.
    1. بلطف يمسح الأنسجة مع مغلفة بالمحلول الملحي الفسيولوجي شاش معقم وإزالة الدم، إذا كان سطح الأنسجة لديها الكثير من الدم.
    2. للحصول على عينات مجهرية مثل المواد خزعة، تبقى العينة مبلل مع غارقة في المحلول الملحي الفسيولوجي شاش معقم.
  3. قص وتقليم أنسجة طبيعية بسكين تشذيب وتعريض سطح الآفة الورم، إذا لم تكن مرئية الجماهير ورم صارخ.
  4. لمس سطح الورم العينات ريسيكتيد إلى شريحة زجاج عادي عدة مرات مع الأيدي القفاز. بصريا وتؤكد المنطقة لمست هو ما يزيد على 80 في المائة الشريحة الزجاجية العادية.
  5. طفيفة اضغط على الشريحة الزجاجية العادية ضد شريحة غشاء (قلم) نافثالاتي البولي إيثيلين وفرك بلطف من 2-3 مرات مع الأيدي القفاز. تأكيد بصريا يتم نقل الخلايا من الشريحة الزجاجية العادية للشريحة غشاء القلم.
  6. أيردري كل من الزجاج والقلم غشاء الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. وصمة عار الشريحة الزجاجية العادية للفحص الخلوية مباشرة. تراجع الشرائح الزجاجية مع الحل مثبت ل 5 s، ووصمة عار ثم مع جيمسا تلطيخ الحل لمدة 15 ثانية.
  8. تقييم والشاشة محتويات الورم وسيلولاريتي على الشريحة الزجاجية العادية تماما مع مجهر للتقييم السريع. تقييم الخلايا السرطانية استناداً إلى عدة معايير؛ توسيع النووية، تناذر غير طبيعي، الكروماتين وفيرة، والتوزيع غير المتكافئ للخلايا، نسبة العنصر المكون/هيولى النووي وحجم الخلية، والخلية القطبية.

2-إعداد فيلم الشريحة غشاء القلم للاختبارات الجينية

  1. إذا كانت العينة يظهر الورم سيلولاريتي أكثر من 60% بتقييم سريع مجهرية (الخطوة 1.8)، قص الفيلم تطرق الورم الشرائح غشاء القلم لاستخراج الحمض النووي بسكين والقفاز الأيدي. نقل قطع الفيلم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة مع بينسيتي والأيدي القفاز.
  2. إذا كان تحديد cellularity الورم منخفضة (أقل من 60 في المائة محتويات الورم) بتقييم سريع مجهرية (الخطوة 1.8)، استخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن والحصول على عينات الورم.
    1. أداء Giemsa تلطيخ لتقييم الخلايا السرطانية باستخدام البروتوكولات القياسية.
    2. قص فيلم الشريحة الغشاء بيم بالليزر مناسبة القبض على ميكروديسيكشن.
    3. نقل قطع الفيلم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة مع بينسيتي والأيدي القفاز.
    4. تخزين أنبوب ميكروسينتريفوجي المحتوية على الفيلم في 4 درجات مئوية حتى استخراج الحمض النووي (البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا).

3. استخراج الحمض النووي

  1. القيام باستخراج الحمض النووي من عينات الأنسجة التشنج أو فب باستخدام مجموعة أدوات استخراج "الحمض النووي فب" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة. يتوفر مجموعة مكافئة لخطوة استخراج "الحمض النووي فب".
  2. إضافة ميليلتر 180 من المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة (pH = 8.3) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي المحتوية على الفيلم مع ماصة ميليلتر 200 يدوي. إضافة 20 ميليلتر من البروتيناز ك الماصة اليدوية 20-ميليلتر ومزيج من فورتيكسينج مع خلاط دوامة بأقصى سرعة ممكنة (حوالي 2,500 لفة في الدقيقة) ل 5 ق.
  3. احتضان هذه العينات في 56 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع حاضنة هواء.
  4. احتضان عينات فب والتشنج عند 90 درجة مئوية في كتلة حرارة لمدة 1 ساعة و 10 دقيقة، على التوالي. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب ميكروسينتريفوجي في 1,500 ز خ لل 5 s في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة.
  5. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل للعينة ماصة 200 ميليلتر ومزيج دقيق فورتيكسينج بأقصى سرعة ل 5 ق.
  6. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول (96-100%) مع ماصة 200 ميليلتر ومزيج دقيق من فورتيكسينج بأقصى سرعة ل 5 س. باختصار تدور أسفل أنبوب ميكروسينتريفوجي في 1,500 ز خ لل 5 s في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة.
  7. نقل كامل ليساتي بعناية لعمود الدوران مع ماصة 1,000 ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  8. ضع عمود الدوران في أنبوب جمع نظيفة 2 مل مع الأيدي القفاز، وتجاهل جمع الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر إلى مربع التخلص من بلاستيك.
  9. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي إلى عمود الدوران مع ماصة 1,000 ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  10. ضع عمود الدوران في أنبوب جمع نظيفة 2 مل مع الأيدي القفاز، وتجاهل جمع الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر إلى مربع التخلص من بلاستيك.
  11. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي إلى عمود الدوران مع ماصة 1,000 ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  12. تجاهل جمع الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر إلى مربع التخلص من بلاستيك. ضع عمود الدوران في أنبوب نظيف 1.5 مل ميكروسينتريفوجي بالأيدي القفاز والطرد المركزي في 20,000 ز x دقيقة 3 عند 25 درجة مئوية الجاف للغشاء.
  13. ضع عمود الدوران في أنبوب ملزمة منخفضة والحمض النووي مع الأيدي القفاز.
    1. إضافة 40-50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى مركز الغشاء مع ماصة 100 ميليلتر.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    3. تخزين عينات الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى الخطوة التالية (البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا).

4-تقدير جودة الحمض النووي بالوقت الحقيقي الكمي PCR

  1. إعداد مزيج الرئيسي في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة مع ماصة، على النحو التالي: 10 ميليلتر من 2 × الوقت الحقيقي بكر ماجستير المزيج، 1 ميليلتر من 20 x رناسي ف التحقيق التمهيدي "مزيج" (amplicon الحجم: 87 bp)، و 8 ميليلتر من الماء المعقم نوكلاس مجاناً.
  2. إعداد مزيج الرئيسي الثاني في أنبوب عقيم ميكروسينتريفوجي واحد على النحو التالي: 10 ميليلتر من 2 × الوقت الحقيقي بكر ماجستير المزيج، 1 ميليلتر من 20 x رناسي ف التحقيق التمهيدي "مزيج" (amplicon الحجم: 268 bp)، و 8 ميليلتر من الماء المعقم نوكلاس مجاناً.
  3. إجراء تخفيف المسلسل لسيطرة الإنسان الجينوم الحمض الخلوي الصبغي (المتوفرة في هذه المجموعة) 4 مرات لخمس نقاط منحنى قياسي وتحديد تركيزات الحمض النووي المطلق13.
  4. إضافة 19 ميليلتر من يمزج الرئيسي استعداد اثنين (تم إعداده في الخطوة 4، 1 و 4-2) في آبار منفصلة من صفيحة الضوئية 96، حسنا فعل مع 20-ميليلتر ماصة.
  5. أضف 1 ميليلتر FFPE الحمض النووي أو "الحمض النووي عرة" لفصل الآبار التي تحتوي على مزيج رد فعل مع ماصة 2-ميليلتر. أضف 1 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس في بئر منفصلة تحتوي على مزيج رد فعل للسيطرة على لا قالب.
  6. عقد الجانب غير لاصقة فيلم لاصق الضوئية وقشر الواقية دعم من مركز الفيلم مرة أخرى. بلطف اسحب قضيب فوق الفيلم، وختم الفيلم عبر لوحة 96-جيدا.
  7. المزيج بلطف لوحة 96-جيدا باستخدام خلاط لوحة 96-جيدا لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة 2,000 لفة في الدقيقة. الطرد المركزي في اللوحة بإيجاز في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. السلطة على الصك PCR الوقت الحقيقي، وإدراج لوحة 96-جيدا. تشغيل ردود فعل PCR باستخدام البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 45 من 95 درجة مئوية ل 1 s و 60 درجة مئوية 20 س. استخدام "المنحنى القياسي" و "الوضع السريع".
  9. تقييم تجزؤ الحمض النووي مع النسبة الحمض النووي (القياس الكمي النسبي؛ RQ) الحصول على أمبليكون طويلة (268 bp) إلى أمبليكون قصيرة (87 bp). RQ القيمة يعني قيمة amplicon قصيرة13يعني amplicon/فترة طويلة.

5-إعداد مكتبة الجيل القادم على التسلسل

  1. تعد المكتبة التسلسل لتسلسل الجيل القادم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. إعداد مزيج PCR رئيسي متعدد في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة كل عينة على النحو التالي: 4 ميليلتر من 5 × PCR متعدد رد فعل الحل، ميليلتر 4 من 5 × تجمع التمهيدي، ميليلتر دي سيكس التشنج أو فب الحمض النووي (1-100 نانوغرام)، وإضافة المياه خالية من نوكلاس ما يصل إلى 20 ميليلتر.
    1. إضافة مزيج PCR رئيسي متعدد أنبوب بكر والمزيج بلطف بالتنصت على الأنبوب.
    2. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب ميكروسينتريفوجي في 1,500 ز خ لل 5 s في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة.
  3. تشغيل ردود فعل PCR باستخدام البروتوكول التالي: 99 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها دورات 20 99 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية 4 دقيقة، وعقد الخطوة 10 ° C. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تحديد عدد الدورات على أساس العدد أزواج التمهيدي.
  4. فتح غطاء أنبوب PCR، وإضافة ميليلتر 2 إنزيم التقييد مع ماصة 2-ميليلتر. أغلق غطاء أنبوب بكر والمزيج بلطف بالتنصت على أنبوب PCR. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  5. تشغيل ردود فعل PCR استخدام بروتوكول التالية: 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وإجراء الخطوة 10 ° C. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة محول ربط مزيج الرئيسي إلى كل جيدا التي تحتوي على أمبليكونس بكر هضمها مع ماصة كالتالي: 4 ميليلتر من محول ربط الحل 0.5 ميليلتر من الرمز الشريطي، 0.5 ميليلتر لمحول، 2 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي و 2 ميليلتر من ليجاسى الحمض النووي. إغلاق غطاء أنبوب بكر والمزيج بلطف عن طريق التنصت. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب PCR مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  7. تشغيل ردود فعل PCR باستخدام البروتوكول التالي: 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد الخطوة 10 ° C.
  8. تنقية المكتبة التسلسل مع الخرز المغناطيسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  9. نقل الحل مكتبة محول متصلة في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي 1.5 مل. إضافة ميليلتر 45 من حبات مغناطيسية في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي لتنقيةش 1. المزيج بلطف بالتنصت على الأنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. ضع الأنبوب ملزمة منخفضة والحمض النووي في رف مغناطيسية، ثم احتضانها لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى الحل الواضح. عناية تجاهل المادة طافية مع ماصة 200 ميليلتر دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  11. إضافة 150 ميليلتر طازجة الإيثانول 70% مع ماصة 200 ميليلتر، ثم نقل في أنبوب إلى جنبا من المغناطيس لغسل الخرز. تجاهل المادة طافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  12. كرر الخطوة 5.11 ليغسل ثانية.
  13. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب مع ميني أجهزة الطرد المركزي في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، وتجاهل بعناية قطرات الإيثانول مع ماصة 10 ميليلتر.
  14. إضافة 50 ميليلتر من "الشركة المصرية للاتصالات المنخفضة" في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي المحتوية على بيليه الخرز المغناطيسي لتفريق الخرز. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  15. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة حتى يصبح الحل واضح.
  16. نقل 50 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي الجديد وإضافة ميليلتر 75 من حبات مغناطيسية مع ماصة 100 ميليلتر لتنقية 2nd . المزيج بلطف بالتنصت على الأنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  17. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، ثم احتضانها لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى الحل الواضح. عناية تجاهل المادة طافية مع ماصة 200 ميليلتر دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  18. إضافة 150 ميليلتر طازجة الإيثانول 70% مع ماصة 200 ميليلتر، ثم نقل في أنبوب إلى جنبا من المغناطيس لغسل الخرز. تجاهل المادة طافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسية.
  19. كرر الخطوة 5.18 ليغسل ثانية.
  20. تدور بإيجاز إلى أسفل الأنبوب مع أجهزة الطرد مركزي مصغرة في 1,500 س ز ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، وتجاهل بعناية قطرات الإيثانول مع ماصة 10 ميليلتر.
  21. إضافة 50 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات منخفضة في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي المحتوية على بيليه الخرز المغناطيسي لتفريق الخرز. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  22. وضع أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي في رف مغناطيسية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة حتى يصبح الحل واضح.
  23. نقل ميليلتر 45 من المادة طافية يحتوي على مكتبة المنقاة في أنبوب منخفض-ملزمة الحمض النووي الجديد مع ماصة 100 ميليلتر.

6-قياس تركيز مكتبة بالوقت الحقيقي الكمي PCR

  1. تحديد تركيز كل مكتبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة13.
    1. إعداد حل برنامج تخفيف على النحو التالي: مزيج 2 ميليلتر من مكتبة المنقي وميليلتر 38 من المياه خالية من نوكلاس في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي مع ماصة 2-ميليلتر و 100 ميليلتر.
    2. تخزن المكتبات غير مخفف في-20 درجة مئوية حتى الخطوة 7، 3.
  2. تعد حلاً تمييع 200-fold كما يلي: مزيج 5 ميليلتر من برنامج مكتبة المنقي المخفف (إعدادها في الخطوة 6، 1) و 45 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي.
  3. تعد حلاً تمييع 2,000-fold كما يلي: مزيج 5 ميليلتر مكتبة المنقي المخفف 200-fold (تم إعداده في الخطوة 6، 2) و 45 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي في أنبوب منخفض--ربط الحمض النووي.
  4. إعداد مزيج الرئيسي في رد فعل على النحو التالي: مزيج 10 ميليلتر من 2 × الحل مزيج الرئيسي و 1 ميليلتر من 20 x الحل المقايسة التحقيق التمهيدي في أنبوب ميكروسينتريفوجي العقيمة مع ماصة، ثم تخلط بالتنصت على الأنبوب. إضافة 11 ميليلتر من رد فعل مزيج الرئيسي في الآبار من فعل 96-جيدا البصرية.
  5. إضافة ميليلتر 9 مكتبة المخفف 2,000-fold أو ميليلتر 9 لكل عنصر تحكم قياسي 9 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لكل بئر مع ماصة 10 ميليلتر.
  6. عقد الجانب غير لاصقة للفيلم لاصقة الضوئية وقشر الواقية دعم من مركز الفيلم مرة أخرى.
    1. بلطف اسحب قضيب فوق الفيلم، وختم الفيلم عبر لوحة 96-جيدا.
    2. المزيج بلطف لوحة 96-جيدا باستخدام خلاط لوحة 96-جيدا لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    3. الطرد المركزي في اللوحة بإيجاز في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. السلطة على الصك PCR الوقت الحقيقي، وإدراج لوحة 96-جيدا. تشغيل ردود فعل PCR استخدام بروتوكول التالية: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 1 s و 60 درجة مئوية 20 س. استخدام "المنحنى القياسي" و "الوضع السريع".
  8. حساب تركيز مكتبة غير مخفف بضرب تركيز يحددها 2,000 مع قبكر.

7-القادم جيل التسلسل

  1. خطة شرط التشغيل وتعيين المعلمة التشغيل داخل البرنامج.
    1. انقر فوق [الخطة التبويب] و [قالب]، وحدد طريقة التشغيل المناسبة.
    2. حدد نوع الأسلوب والتطبيق، وانقر فوق [التالي].
    3. حدد الصك، نموذج إعداد مجموعة أدوات (اختياري)، نوع مجموعة المكتبة، وطقم قالب، كيت التسلسل وقاعدة طريقة المعايرة، رقاقة نوع، التحكم في تعيين تسلسل (اختياري)، والرمز الشريطي، وانقر فوق [التالي].
    4. حدد الوظائف الإضافية وانقر فوق [التالي].
    5. حدد المشروع ثم انقر فوق [التالي].
    6. حدد مرجع الافتراضية وملفات سرير من المنطقة المستهدفة.
    7. اكتب اسم النموذج، حدد الرمز الشريطي، ثم انقر [خطة تشغيل].
  2. قم بإعداد قالب ورقاقة تحميل أداة مؤتمتة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. ذوبان الجليد خرطوشة الكاشف في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. تمييع المكتبة غير مخفف بالمياه خالية من نوكلاس طبقاً لتركيز مكتبة المحسوبة في الخطوة 6.8 وجعل 20 م المكتبات.
    1. تعد مكتبة مجمعة للتسلسل ومخزن على الجليد.
    2. إضافة 25 ميليلتر من مكتبة المجمعة مع 100 ميليلتر ماصة للجزء السفلي من أنبوب عينة. استخدام مكتبة المجمعة خلال 48 ساعة.
  4. على السلطة وفتح الغطاء الصك الآلي.
    1. مكان رقاقة التسلسل ومحول رقاقة وخرطوشه الإثراء، خرطوشة تلميح، لوحة بكر، بكر الإطار الختم، أنبوب الانتعاش، خرطوشة الحل وخرطوشه كاشف للموقف المناسب من أداة مؤتمتة.
    2. لمس [إعداد تشغيل] و [خطوة بخطوة] على الشاشة.
    3. أغلق الغطاء واللمس [بدء الفحص] على الشاشة.
    4. بعد على سطح المسح الضوئي عملية، لمس [التالي] على الشاشة.
    5. تحقق من محتويات العرض (مجموعة شرائح النوع رقاقة خطط معرف، معرف عينة،) وتعيين الوقت واللمس [موافق] على الشاشة.
  5. بعد الانتهاء من تحميل رقاقة:
    1. لمس [التالي] على الشاشة وفتح الغطاء.
    2. تم إلغاء تحميل رقاقة التسلسل من محول رقاقة مع الأيدي القفاز.
    3. ضع الرقاقة داخل الحاوية رقاقة، الراب مع بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية حتى رد فعل التسلسل.
    4. إزالة خرطوشة تخصيب، لوحة بكر، بكر الإطار الختم، أنبوب الانتعاش، خرطوشة الحل، وكاشف خرطوشة من الموقف المناسب صك الأيدي القفاز الآلي.
    5. نقل خرطوشة فارغة-تلميح إلى موقف نصيحة النفايات الصك الآلي مع الأيدي القفاز.
    6. لمس [التالي] وأغلق الغطاء.
    7. لمس [Start] وتنظيف أداة مؤتمتة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 4 دقائق.
  6. حل كمبيوتر لوحي كلوريت صوديوم في 1,000 مل من الماء عالي النقاوة والحل تصفية مع وحدة تصفية تدفق تصفية 0.22 ميكرومتر.
    1. السلطة على الصك التسلسل.
    2. لمس [Clean] و [التالية] على شاشة الصك التسلسل.
    3. تنظيف أداة التسلسل مع 250 مل من حل كلوريت الصوديوم تصفية تعقيم وبعد ذلك 250 مل من الماء عالي النقاوة.
  7. لمس [تهيئة] وحدد مجموعة التسلسل المناسب على الشاشة.
    1. تثبيت الشاحن رمادية في الموقع المناسب مع الأيدي القفاز.
    2. تهيئة أداة التسلسل مع الحل أغسل (المقدمة في الطقم)، والحل تعديل درجة الحموضة (التي تحتوي على 350 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم 100 ملم)، والحل القياسية الأس الهيدروجيني (المقدمة في الطقم).
  8. إضافة 20 ميليلتر من النيوكليوتيدات داتب، دجتب، دكتب ودتتب (المقدمة في الطقم) في أنابيب 50 مل (المتوفرة في مجموعة أدوات) مع ماصة 100 ميليلتر.
    1. تثبيت الشاحن رمادية في الموقع المناسب مع الأيدي القفاز.
    2. تحميل أنبوب 50 مل والمسمار على الصك التسلسل.
    3. لمس [التالية] على الشاشة لبدء الخطوة التهيئة، التي تستغرق حوالي 25 دقيقة.
  9. بعد الانتهاء من الخطوة التهيئة:
    1. لمس [تشغيل] على الشاشة، وحدد أداة إعداد المكتبة المناسبة.
    2. مسح الباركود ثنائي الأبعاد للرقاقة.
    3. إدراج شرائح التسلسل في الموقف المناسب.
    4. إغلاق الباب المشبك وصك رقاقة.
    5. لمس [رقاقة الاختيار]، [التالية]، و [موافق] على الشاشة لبدء تشغيل تسلسل.
  10. بعد رد فعل التسلسل، نقل البيانات وتنفيذ خط أنابيب تحليل البيانات على ملقم التسلسل13،17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 العملية برمتها من إعداد العينات عرة لاستخراج الحمض النووي. جدير بالذكر أن يستغرق الإجراء يومين فقط للحصول على الحمض النووي من عينات عرة. نحن تقييم أية آثار لتخزين الورم قبل تجهيز الشريحة. ووجدنا أن الخلايا السرطانية كانت تعلق على شريحة الزجاج عندما تم التطرق عينات الأنسجة مباشرة على الشريحة، وعندما الأنسجة وأبقى في المالحة ترطب العقيمة-شاش ح 1 (الشكل 2). ومع ذلك، عندما الأنسجة تم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة، خ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، وقد عرضنا طريقة بديلة للحصول على الورم الحمض النووي من العينات المرضية السريرية استخدام عرة. إعداد عرة بسيطة جداً وتحتاج إلى وقت أقل بالمقارنة مع أساليب فب، دون الحاجة إلى أدوات خاصة10. يمكن إكمال كافة الإجراءات من إعداد عرة لاستخراج الحمض النووي في غضون يومين (الشكل 1). ومن ثم يقصر هذا الأسلوب الزمنية اللازمة لإجراء الاختبارات الجينية. جدير بالذكر أن هذا يوفر ميزة كبيرة في تقصير عدد الأيام اللازمة للتحليل الجزيئي. هذا الزمنية قصيرة يتيح لنا أن نقدم فو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونشكر جميع الموظفين الطبية والتبعية للمستشفى والمرضى لموافقتها على المشاركة. ونحن نشكر "غابرييل الأبيض وولف"، دكتوراه، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذا التقرير. وأيد هذه الدراسة معونات "مشروع بحوث الجينوم" من محافظة ياماناشي (أي إتش ومو) ومنحة من ياسودا الطبية مؤسسة (أي إتش).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
FINE FROST white20 زجاج منزلق صغيرMatsunami Glass ind، LtdSFF-011
Arcturus PEN غشاء زجاجي شرائححراري فيشر العلميLCM0522
Cyto حل سريعMuto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B solutionMuto Pure Chemicals20581
May-Grunwald SolutionMuto Pure Chemicals15053
Giemsa solutionMuto Pure Chemicals15002
QIAamp DNA FFPE مجموعة الأنسجةQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan RNase P Detection RecodeKit Thermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay من FFPE DNA QC ASSAY V2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate ثيرمو فيشر العلمي4346907
ميكروأمبير فيلم لاصق بصريثيرمو فيشر العلمي4311971
ميكرو ميكس E36TITEC0027765-000
VIIA 7 نظام PCR في الوقتالحقيقي ثيرمو فيشر العلميVIIA7-03
هيماك CF16RXIIهيتاشي كوكيCF16RII
مكتبة أيون طقم القياس الكمي TaqManThermo Fisher Scientific4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2Thermo Fisher Scientific4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress محولات الباركود 1-16 كيتThermo Fisher Scientific4471250
Ion PGM Hi-Q View Set Sequencing Kit (200 قاعدة)Thermo Fisher ScientificA30044
أيون شيف نظامثيرمو فيشر العلمي4484177
فيريتي 96 بئر حراري سايكلثيرمو فيشر العلميفيريتي 200
أيون 318 رقاقة كيت v2 BCثيرمو فيشر ساینيتفيك4488150
أيون PGM نظامثيرمو فيشر العلميPGM11-001
أيون PGM 2 طقم زجاجةحراري فيشر ScientificA25591
Agencourt & trade; AMPure™ XP KitBeckman CoulterA63881
حامل مغناطيسي ذو 16 وضعاThermo Fisher Scientific4457858
غير لاصق ، أنابيب Microfuge خالية من RNase ، 1.5 مل (أنبوب ربط منخفض)Thermo Fisher ScientificAM12450
ماء خال من NucleaseThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp&trade ؛ لوحات تفاعل بصرية 96 بئرThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp&trade ؛ فيلم لاصق واضحThermo Fisher Scientific4306311
Agencourt & trade ؛ AMPure™ XP KitBeckman CoulterA63881
الإيثانول (99.5)Nacalai Tesque08948-25
هيدروكسيد الصوديوم (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipet-Lite LTS ماصة L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipet-Lite LTS ماصة L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
ماصة LTS L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
Pipet-Lite LTS ماصة L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS +METTLER TOLEDO17014382
للطرد المركزيWAKENMODEL8864
صغيرة للطرد المركزي WAKENWKN-2290حاضنة هواء
SensiCare قفازات فحص النتريل الخالية من البودرةMEDLINESEM486802
شاش معقمثلاجة أوساكي11138
MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
ريشة تشذيب ريشةريشة رقم 130
تشذيبرقم 260
ريشة SريشةFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458خلاط دوامة
PincetteNATSUMEA-5
1.5 مل microtubeبيوبيكRC-0150
حاضنة صغيرة ريشة ريشة

المراجع

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3(2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493(2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استخلاص الحمض النووي من الأوراممقارنة الحمض النووي المدمج في البارافين والمثبت بالفورمالينشريحة غشاء PENتقييم جودة الحمض النوويتسلسل الجيل التاليتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقميتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقيالكشف عن الطفرات الجسديةالتسلسل الآلي
طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.