مقالة منهجية

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

DOI:

10.3791/56953

⸱

يناير 10, 2018

 ,  , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الأسلوب يصف الاستنساخ، والتعبير، وتنقية Nsa1 المؤتلف للتصميم الهيكلي البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية (ساكسس)، وقابلاً للتطبيق لتحليل البروتينات الأخرى الهيكلية الهجين يحتوي على كل أمر واضطرابه المجالات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد طول بنية الريبوسوم الجمعية عامل Nsa1 من Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) يشكل تحديا بسبب اضطرابه وحوزتي مجا تيرمينوس ج من البروتين. هذه المخطوطة يصف الأساليب لتنقية Nsa1 المؤتلف من S. cerevisiae للتحليل الهيكلي ساكسس بعلم البلورات بالأشعة السينية. علم البلورات بالأشعة السينية واستخدم حل بنية المجال WD40 الطرفي ن أمر جيد من Nsa1، وثم استخدمت ساكسس لحل هيكل ج-محطة Nsa1 في الحل. الحل تشتت بيانات جمعت من كامل طول Nsa1 في الحل. ثم كشفت مزيجاً من هيئة جامدة و أساسه النمذجة ج-محطة Nsa1، وحسبت ستريك نثر النظرية من هيكل كريستال عالية الدقة للمجال WD40. من خلال هذا النهج الهجين أعيد هيكل رباعي من البروتين الكامل. الأساليب المقدمة هنا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق عموما لتحديد الهيكلية الهجين من غيرها من البروتينات التي تتكون من خليط مجالات منظم وغير منظم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ريبوسوم هي الآلات ريبونوكليوبروتين الكبيرة التي تضطلع بالدور الأساسي لترجمة مرناً إلى البروتينات في جميع الخلايا الحية. ريبوسوم تتكون من وحدتين فرعيتين التي تنتج في عملية معقدة ووصف الريبوسوم نشوء حيوي1،2،،من34. الجمعية الريبوسوم التوكسينات تعتمد على معونة مئات من الجمعية ريبوسومال أساسي العوامل2،،من35. Nsa1 (Nop7 المرتبطة 1) هو عامل الجمعية الريبوسوم التوكسينات مطلوب على وجه التحديد لإنتاج وحدة فرعية ريبوسومال كبيرة6، وهي المعروفة باسم WD-كرر تتضمن 74 (WDR74) في أعلى الكائنات الحية7. لقد ثبت WDR74 أن تكون مطلوبة من أجل تشكيل الكيسة في الفئران8وهو كثيرا ما تحور المروج WDR74 في خلايا السرطان9. ومع ذلك، الدالة واليات دقيقة من Nsa1/WDR74 في الريبوسوم الجمعية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. للبدء في الكشف عن دور Nsa1/WDR74 أثناء النضج الريبوسوم حقيقية النواة، أجريت تحليلات هيكلية متعددة، بما في ذلك علم البلورات بالأشعة السينية، وزاوية صغيرة بالأشعة السينية ونثر (ساكسس)10.

مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) والمجهر الإلكتروني، علم البلورات بالأشعة السينية وساكسس تقنيات هامة لدراسة بنية الجزيئات. الحجم والشكل، وتوافر واستقرار الجزيئات تأثيرات تناسب أسلوب الأحياء الهيكلية التي ستكون أفضل جزيء ضخم خاص، غير أن الجمع بين تقنيات متعددة من خلال اتباع نهج ما يسمى "هجينة" أصبح 11من أداة مفيدة على نحو متزايد. لا سيما علم البلورات بالأشعة السينية وساكسس أساليب قوية ومتكاملة للتصميم الهيكلي للجزيئات الكبيرة12.

علم البلورات توفر هياكل الذرية ذات الدقة العالية بدءاً من الجزيئات الصغيرة إلى الآلية الخلوية الكبيرة مثل الريبوسوم، وقد أدى إلى تحقيق إنجازات عديدة في فهم الوظائف البيولوجية للبروتينات وغيرها 13من الجزيئات الكبيرة. وعلاوة على ذلك، يسخر تصميم الأدوية على أساس هيكل سلطة هياكل الكريستال للالتحام الجزيئية بطرق حسابية، مضيفاً بعدا حاسما ل اكتشاف وتطوير العقاقير14. على الرغم من انطباق واسع النطاق، نظم مرنة واضطرابه تحديا لتقييم علم البلورات حيث يمكن أن تعوق التعبئة كريستال أو إلكترون كثافة الخرائط قد تكون ناقصة أو من نوعية رديئة. على العكس من ذلك، ساكسس نهجاً هيكلي القائم على الحل ومنخفضة الدقة قادرة على وصف نظم مرنة تتراوح بين الحلقات اضطرابه وتيرميني البروتينات جوهريا اضطرابه12،،من1516. معتبرا أنها متوافقة مع مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات12، ساكسس العمل تآزر مع علم البلورات لتوسيع نطاق الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تتناولها الدراسات الهيكلية.

Nsa1 مناسبة لاتباع نهج هيكلية هجين لأنه يحتوي على مجال WD40 جيد التنظيم متبوعاً الوظيفية، ولكن مرنة ج-محطة التي ليست قابلة لأساليب علم البلورات بالأشعة السينية. التالي بروتوكول للاستنساخ، والتعبير، وتنقية Nsa1 S. cerevisiae لتحديد الهيكلية الهجين بعلم البلورات بالأشعة السينية وساكسس. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة هياكل غيرها من البروتينات التي تتكون من خليط من مناطق مرتبة واضطرابه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إنتاج البروتين المؤتلف وتنقية لضمانات الأمن السلبية 1

  1. Nsa1 التعبير بلازميد التصميم والاستنساخ
    1. الحصول على أو شراء S. cerevisiae المجينية الحمض النووي.
    2. [بكر] تضخيم متواليات مستهدفة من Nsa1 (Nsa1فلوريدا، بقايا 1-463) واقتطاع ج-محطة Nsa1 (Nsa1ΔC، وبقايا 1-434) مع الإشعال المناسبة باستخدام الحمض النووي المعزولة من S. cerevisiae ودرجة حرارة ذوبان حوالي 60 درجة مئوية مع وقت تمديد من 1-2 دقيقة. واستخدمت أجهزة الإشعال التالية تضخيم Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: جاتكجااجكجككجكتااككتككتتتتتجكتككك
    3. سوبكلون Nsa1 في فمبب ناقلات التعبير الإشريكيّة القولونية () التي تحتوي على N-مبنى رقم 6 X-الحامض الأميني العلامة التي تليها مالتوس ملزمة البروتين (MBP) وموقع حوزتي فيروس أحفر التبغ (TEV) باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية17 .
    4. استخدام تسلسل الحمض النووي للتحقق من أنه تم استنساخ Nsa1 في الإطار مع العلامة صاحب MBP الطرفي ن.
  2. تعبير البروتين Nsa1
    1. تحويل plasmid(s) التعبير مناسبة كولاي سلالة التعبير مع نظام يستند إلى مروج T7. لوحة ترانسفورمانتس على ألواح أجار رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان لوحة مقلوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. تلقيح ثقافة مل 50 رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين من لوحة التحويل، وأنها تنمو بين عشية وضحاها مع الهز 200 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. تطعيم 3 × 1000 مل رطل في قوارير فيرنباتش مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين مع 15 مل الثقافة بين عشية وضحاها، وأنها تنمو مع الهز 200 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: للبروتين بنية الحل، إدراج سيلينوميثيونيل (سمية) يمكن أن يتحقق بزراعة الخلايا في M9 المتوسطة الدنيا التي تستكمل مع سمية وخليط من الأحماض الأمينية تمنع إنتاج الميثيونين قبل التعريفي، بدلاً من وسائل الإعلام رطل 18.
    4. حمل التعبير عن Nsa1 عندما يصل القطر الخارجي600 ~0.8 بإضافة الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوبيرانوسيدي β-د-1 (إيبتج) بتركيز 1 ملم تليها الحضانة عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز 200 لفة في الدقيقة الأخيرة.
    5. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 5,050 س ز.
      ملاحظة: يمكن تخزين طويل الأجل في-80 درجة مئوية خلايا أو استخدامها فورا لتنقية البروتين.
  3. تنقية البروتين Nsa1
    1. ريسوسبيند الخلايا في 25 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 10 مم مجكل2) مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية الذي يحتوي على قرص المانع حوزتي خالية يدتا واحد.
    2. الخلايا التي سونيكيشن عند 4 درجة مئوية (الوقت 7 دقيقة، 2 s على دورة، 2 s إيقاف دورة؛ السعة: 70%).
    3. توضيح ليستي بالطرد المركزي في 26,900 س ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. تطبيق توضيح إلى عمود تدفق جاذبية محملة 10 مل راتنج تقارب الكوبالت المعطل تداولها، وقبل متوازن مع تحلل المخزن المؤقت.
    5. السماح بتمرير أكثر من الراتنج بتدفق الجاذبية عند 4 درجات مئوية وتغسل الراتنج مرتين مع 100 مل من المخزن المؤقت لتحلل المادة طافية.
    6. الوت Nsa1 مع 20 مل من شطف المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl pH 7.5، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 5 مم مجكل2، 5% والغليسيرول وايميدازول 200 ملم).
    7. تأخذ 15 ميكروليتر من النذرة وتشغيله على جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15% للتحقق من أن البروتين هو التيد من الراتنج تقارب (الشكل 1A).
    8. قم بإزالة العلامة MBP بحوزتي TEV الهضم. إضافة 1 مل TEV حوزتي19 (الأوراق المالية 1 ملغ/مل) شطف راتنج تقارب Nsa1 واحتضان أنه في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    9. تركز MBP المشقوق Nsa1 إلى ~ قص 5 مل باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع وزن الجزيئي الخروج من كاتشين 10.
    10. تطبيق Nsa1 المشقوق MBP لعمود هلام ترشيح، قبل اكويليبراتيد في المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5، 100 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم مجكل2والجلسرين 5% 1 مم β-mercaptoethanol) (الشكل 1B).
    11. تحليل كسور العمود من هلام الترشيح للتحقق من أن MBP المشقوق وفصل من Nsa1 بتشغيل 15 ميكروليتر عينات على جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15 ٪ (الشكل 1B).
    12. الجمع بين الكسور التي تحتوي على Nsa1 والتركيز على 8 ملغ/مل باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع وزن الجزيئي قص الخروج من كاتشين 10.
    13. تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي استخدام انقراض معامل م 42530–1سم–1. استخدام البروتين فورا للمحاكمات الفرز وتبلور بروتيوليتيك.

2-بلورة والفحص بروتيوليتيك من وكالة الأمن القومي 1

  1. مصفوفة متناثر الكريستال الفرز من Nsa1
    1. الطرد المركزي 500 ميكروليتر من رصيد 8 ملغ/مل Nsa1 في 16,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. إعداد المحاكمات تبلور استخدام روبوت تبلور وشاشات الكريستال مصفوفة متفرق. ملء الخزان من 96 الصواني جيدا مع 30 ميكروليتر من الكواشف شاشة كريستال الفردية من شاشات تبلور مصفوفة متفرق. إعداد قطرات الجلوس مع الروبوت بمزج 250 nL الحل جيدا مع 250 nL الحل البروتين.
    3. ختم لوحات تبلور مع الشريط واحتضانها لهم عند 25 درجة مئوية.
    4. فحص اللوحات كل يومين في الأسابيع الأولى 2-3 مع ستيريوميكروسكوبي.
    5. تحقق من أن يضرب بلورات المحتملة تحتوي على البروتين مع مجهر الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: بالنسبة Nsa1 كريستال مختلفة نموذجين (مكعب و orthorhombic، الشكل 2 ألف) تم الحصول عليها خلال أسبوع واحد من الشاشات التالية: جكسج + شرط B11 (1.6 م سترات الصوديوم tribasic يذوي، الرقم الهيدروجيني 6.5) ومعالج مرسب التآزر الشاشة بلوك 2 شرط C11 (20.1%(v/v) ربط 1500، 13.4%(v/v) ربط 400، هيدروكسيد الصوديوم حبيس تريس/0.1 متر، ودرجة الحموضة 7.5).
  2. فحص بروتيوليتيك
    ملاحظة: أثناء تبلور الأمثل، فإنه اكتشف أن بلورات أورثورهومبيك من Nsa1 نشأ نتيجة proteolytic الانقسام والبلورات يمكن أن تتكرر لا استخدام البروتين كامل طول. باستخدام مزيج من بروتيوليسيس المحدودة إلى جانب الطيف الكتلي، اتضح أن ج-محطة Nsa1 الحساسة إلى بروتيوليسيس وإزالة الذيل ج-الطرفية المطلوبة للاستنساخ اللاحقة (شكل بلوري Nsa1ΔC).
    1. إعداد 1 ملغ/مل حوزتي الحلول الأسهم التالية البروتياز α-تشيموتريبسين، التربسين، elastase، باباين، سوبتيليسين، واندوبروتيناسي غلو-جيم
    2. إنشاء 01:10، 1: 100، وتخفيف 1: 1000 من كل الأسهم في حوزتي 1 ملغ/مل مع "إضعاف المخزن المؤقت" (10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم 500 مم).
    3. "الماصة؛" ميكروليتر 1 من الأسهم في حوزتي (01:10، 1: 100 و 1: 1000) في 9 ميكروليتر مختبرين للبروتين (1 ملغ/مل) لكل مبطلات فحص.
    4. احتضان الحل في 37 درجة مئوية ح 1.
    5. وقف رد الفعل بإضافة 10 ميكروليتر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة x 2 عينة المخزن المؤقت والحرارة رد فعل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. تحليل النبذ بتشغيلها في جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15 ٪ (الشكل 2).
    7. تحديد المجالات مقاومة حوزتي من البروتين المستهدف بالتحليل في جل الطيف الكتلي.
    8. إزالة المناطق حوزتي مجا من البروتين المستهدف بإنشاء تعبير مبتوراً بنيات واتباع بروتوكول الاستنساخ، والتعبير، وتنقية الموصوفة أعلاه.
  3. تبلور الأمثل
    1. إعداد أو الحصول على حلول الأسهم من الكواشف تبلور الأولية التالية: 1.6 م سترات الصوديوم tribasic يذوي درجة الحموضة 6.5، 100%(v/v) ربط 400، 50%(v/v) ربط 1500، هيدروكسيد الصوديوم حبيس/1 م، ودرجة الحموضة 7.5.
    2. إعداد حل أسهم من Nsa1فلوريدا و Nsa1ΔC في 8 ملغ/مل كما هو موضح أعلاه.
    3. تحسين بلورات مكعب Nsa1 (Nsa1فلوريدا).
      1. إعداد شاشة شبكة 24-جيدا مع الآبار التي تحتوي على 500 ميليلتر مع تدرج 1-1.6 متر من سترات الصوديوم مع درجة الحموضة 6.5 من حل أسهم من 1.6 متر سترات الصوديوم تريباسيك مع درجة الحموضة 6.5.
      2. ميكس 1 ميليلتر من البروتين مع 1 ميليلتر الحل جيدا ومكان الخليط إلى شريحة غلاف سيليكونيزيد. مختومة بعناية عكس الشريحة غطاء رأس مدهون مسبقاً جيدا والتأكد من أنها كذلك ولكن رعاية لا تخل الإسقاط أو كسر غطاء الشريحة. كرر هذه العملية حتى يتم ملء العلبة ومن ثم تخزين عند 25 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب أن تظهر بلورات مكعب صغير في 2-7 أيام.
      3. إعداد مخزون ميكروسد من بلورات مكعب. استخدم حلقة نايلون محملة لنقل بلورات مكعب صغير ~ 10 إلى أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل تحتوي على حبة صغيرة و 50 ميليلتر من 1.6 متر سترات الصوديوم فيت تريباسيك الرقم الهيدروجيني 6.5.
      4. دوامة أنبوب 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية (~ 3000 لفة في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة.
      5. جعل سلسلة من تخفيف المسلسل إذ مخزون البذور مع 1.6 متر سترات الصوديوم تريباسيك ودوامه الخليط جيدا ل 5 ق.
      6. ملء كل جيدا لشبكة 24-حسنا، شاشة مع 500 ميليلتر من 1.6 متر سترات الصوديوم تريباسيك الرقم الهيدروجيني 6.5.
      7. تحسين ظروف ميكروسيدينج بإعداد قطرات مع نسب متفاوتة من البروتين مع حلول الزريعة (الشكل 3A). يجب أن تظهر بلورات مكعب أكبر من حيود عالية الجودة في 2-5 أيام (الشكل 3).
    4. تحسين بلورات أورثورهومبيك (Nsa1ΔC)
      1. إعداد شاشة شبكة مع 500 ميليلتر في كل بئر بظروف مختلفة 24 (الشكل 3B) من حلول الأسهم 50%(v/v) ربط 1500، وربط 400 100%(v/v). بالإضافة إلى التدرجات من ربط 1500 وربط 400، كل جيدا ينبغي أن تتضمن أيضا 0.1 م حبيس/الصوديوم هيدروكسيد درجة الحموضة 7.5.
      2. يخلط 1 ميليلتر من حل البروتين 1 ميليلتر الحل جيدا على شريحة غلاف سيليكونيزيد. بعناية عكس الشريحة غطاء رأس مدهون مسبقاً جيدا والتأكد من أنها مختومة جيدا. كرر هذه العملية حتى تم شغل الدرج بأكمله. تخزين علب الورق عند 25 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب أن تظهر بلورات أورثورهومبيك Nsa1 في 2-7 أيام.
      3. مواصلة تحسين بلورات orthorhombic ميكروسيدينج كما هو موضح لبلورات مكعب (الخطوات 2.3.3.3 إلى 2.3.3.7) باستخدام 500 ميليلتر 20.1%(v/v) ربط 1500 و 13.4%(v/v) ربط 400 م 0.1 حبيس/الصوديوم هيدروكسيد درجة الحموضة 7.5 كحل جيد.
        ملاحظة: بلورات سمية Nsa1 ينبغي أن يكون الأمثل مماثلة لبلورات الأصلي.

3-حيود الأشعة السينية جمع البيانات ووكالة الأمن القومي 1 بنية الحل

  1. Cryo-الحماية من بلورات وجمع البيانات حيود الأشعة السينية
    1. لبلورات أورثورهومبيك (Nsa1ΔC)، إعداد محلول كريوبروتيكتانت 1 مل يحتوي على 22.5%(v/v) ربط 1500 و 15%(v/v) ربط 400 م 0.1 حبيس/الصوديوم هيدروكسيد درجة الحموضة 7.5.
    2. ملء رغوة ديوار مع النتروجين السائل، وتبريد قبل عفريت كريستال. توخي الحذر عند العمل باستخدام النتروجين السائل وارتداء قفازات واقية ونظارات واقية.
    3. بعناية عكس الشريحة غطاء لبلورة أيضا تحتوي على بلورات على خشبة المسرح من ستيريوميكروسكوبي.
    4. "الماصة؛" 2 ميليلتر من محلول كريوبروتيكتانت على شريحة جديدة من غطاء.
    5. إرفاق حلقة نايلون محملة من الحجم المناسب للبلورة بعصا cryo مغناطيسي.
    6. استخدام المعونة من ستيريوميكروسكوبي، بسرعة نقل كريستال في حل كريوبروتيكتانت مع الحلقة المحملة من البرد.
    7. واسمحوا الكريستال حجته لمدة 5 دقائق في حل كريوبروتيكتانت.
    8. استخدام المعونة من ستيريوميكروسكوبي، بسرعة حلقة الكريستال من حل كريوبروتيكتانت وتجميد يغرق في نيتروجين سائل.
    9. الانتظار للنتروجين السائل حول الحلقة لوقف الغليان وثم حرر في الحلقة من العصا إلى مكان محدد داخل عفريت كريستال.
    10. Nsa1 مكعب بلوراتفلوريدا لا تحتاج إلى أن تكون كريوبروتيكتيد، ويمكن أن تكون مباشرة فلاش المجمدة (عقب 3.1.8-3.1.9 الخطوات أعلاه).
    11. ختم عفريت كريستال باستخدام أدوات البرد ونقل عصا النقل البحري في ديوار مبردة مسبقاً. تخزين البلورات في كرات الصولجان/dewars حتى جمع البيانات.
    12. إذا كان جمع البيانات في السنكروتروني، السفينة البلورات إلى السنكروتروني استخدام الشاحن جافة.
    13. جمع البيانات حيود الأشعة السينية عقب التقنيات القياسية20.
      ملاحظة: أصلي Nsa1 والساحل ومجموعات البيانات (طول موجي واحد تشتت الشاذة) جمعت في 100 ك خطوط شعاع SER-القط معرف-22 و 22-BM مصدر فوتون متقدمة في "مختبر أرغون الوطني" (شيكاغو). تم تجميعها في dataset Nsa1 حزين في λ = 0.97911 Å. تم تسجيل البيانات باستخدام وقت تعرض 1 s وذبذبات 0.5°. وكانت موسيسيتي من هذه البلورات عادة حوالي 0.3 درجة.
    14. وعملية تغيير حجم الصور حيود الأشعة السينية لإنشاء ملفات انعكاسا لكل مجموعة بيانات في مجموعة الفضاء الملائمة.
      ملاحظة: تم تجهيز مجموعات البيانات الحيود Nsa1 مع HKL200021. تم تجهيز البلورات Nsa1 مكعب في الفضاء مجموعة P213 وجهزت بلورات orthorhombic في الفضاء مجموعة P212121.
  2. Nsa1 بنية الحل.
    ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج البلورات التي يمكن استخدامها لحل وتحسين هياكل الكريستال بما في ذلك فينيكس و CCP4،من2223. التالي هو بروتوكول Nsa1 بنية الحل باستخدام مجموعة برامج فينيكس22.
    1. تحليل أصلي وحزين تحجيم مجموعات البيانات مع phenix.xtriage22.
    2. حل بنية Nsa1 مع Phenix.autosol استخدام الذروة حزينة انعكاس الملف22،24. لتشغيل برنامج أوتوسول، إدخال عدد المواقع selenomethionine (مواقع = 9)، ملف تسلسل فاستا Nsa1ΔC، وطول الموجه المستخدمة لجمع البيانات حزين (λ = 0.97911 Å).
      ملاحظة: من dataset Nsa1 SAD، ينبغي أن يكون phenix.autosol قادرة على تحديد المراحل التجريبية وبناء أكثر من النموذج.
    3. التعديلات اليدوية إلى النموذج مع أبله25، تليها الصقل في phenix.refine،من2226.
    4. حل هيكل بلوري الأصلية ذات الدقة العالية وبلوري مكعب باستبدال الجزيئية باستخدام فيزر27،28.
    5. بعد حل هيكل الناجحة، وفحص النموذج وكثافة الإلكترونات الخريطة في الكاحل25.
    6. بناء وصقل الهياكل عن طريق تشغيل جولات متكررة من الصقل في phenix.refine،من2226 ونموذج بناء في الكاحل25.

4-ساكسس جمع البيانات وتجهيزها، والنمذجة

  1. ساكسس جمع البيانات
    ملاحظة: تم تسجيل البيانات ساكسس لكامل طول S. cerevisiae Nsa1 في "مصدر الضوء المتقدم"، على بيمليني العرافات الفائق 12.3.1 في "مختبر لورنس بيركلي الوطني"، بيركلي، كاليفورنيا29.
    1. تنقية Nsa1فلوريدا عقب البروتوكول، المذكورة أعلاه. 24 ساعة قبل شحن Nsa1فلوريدا إلى بيمليني، دهس البروتين عمود هلام ترشيح متوازن مسبقاً في مخزن مؤقت أ
    2. تجمع الكسور التي تحتوي على Nsa1 وتحديد تركيز البروتين كما هو موضح سابقا.
    3. إعداد 30 ميكروليتر مختبرين في تركيز سلسلة من Nsa1 من 1 إلى 6.2 ملغ/مل باستخدام مخزن مؤقت أ
    4. نقل 20 ميكروليتر من سلسلة تركيز كل من Nsa1 إلى تنورة واضحة كامل 96 ميكروسكوبية جيدا جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت بوحدة التحكم.
      ملاحظة: جمع البيانات ساكسس عن تمييع الحلول استخدام تركيزات العديد من عينة المنقي لتجنب التنافر بين الجسيمات والتجميع، وآثار أضرار الإشعاع.
    5. ختم الصفيحة مع سيليكون ختم حصيرة والسفينة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية إلى بيمليني.
    6. تخزين الميكروسكوبية في 4 درجات مئوية حتى جمع البيانات.
    7. مباشرة قبل جمع البيانات، وتدور اللوحة في 3200 x ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية إزالة الركام المحتملة وفقاعات الهواء.
    8. سجل ساكسس البيانات.
      ملاحظة: ل Nsa1، تم تسجيل بيانات ساكسس للمخزن المؤقت قبل وبعد كل سلسلة تركيز البروتين. مسح متتالية ثلاثة وثلاثين من 0.3 ثانية جمعت ل Nsa1فلوريدا أكثر من تركيز سلسلة (6، 1 إلى 2 مغ/مل) في 10 درجة مئوية.
    9. تنفيذ الطرح المخزن المؤقت لبيانات ساكسس.
      ملاحظة: ل Nsa1 تم الطرح المخزن المؤقت تلقائياً في بيمليني لكن الطرح المخزن المؤقت يمكن أن يؤديها أيضا استخدام برامج الحد من البيانات مثل مبعثر30 و31جناح أتساس. المخزن المؤقت للطرح جزء هام من تحليل البيانات ساكسس وينبغي الحرص على ضمان أن يكون المخزن المؤقت المستخدم للطرح مطابق للعينة البروتين المخزن المؤقت.
    10. متوسط 33 على التوالي بمسح لإنشاء ملف *ave.dat لكل تركيز.
      ملاحظة: تراكب الإطارات 33 على التوالي مقارنة المنحنيات. التغييرات إلى منحنيات ونثر على مر الزمن في كثير من الأحيان يدل على أضرار الإشعاع. استبعاد هذه الإطارات من المتوسط. وأجرى في المتوسط من الأشعة على التوالي Nsa1 تلقائياً في بيمليني العرافات.
  2. ساكسس تجهيز البيانات ومقارنة سلسلة تركيز
    ملاحظة: هناك العديد من حزم البرامج التي يمكن استخدامها لتحليل البيانات ساكسس. ل Nsa1 حددت دائرة نصف قطرها gyration والمسافة لبير توزيع المهام باستخدام بريموس32 و33 من غنوم من أتساس 2.7.2 جناح31 والمقارنة عبر جميع تركيزات البروتين لضمان وجود لا إشعاع الضرر أو التفاعلات بين الجسيمات تعتمد على تركيز10.
    1. فتح المحطة طرفية قذيفة، وانتقل إلى الدليل الذي يحتوي على البيانات ساكسس.
    2. إطلاق بريموس32 واجهة المستخدم الرسومية من داخل المحطة الطرفية shell.
    3. ضمن "واجهة المستخدم الرسومية بريموس"، تحميل منحنيات نثر (* ave.dat).
    4. استخدم كاتبز لتحديد دائرة نصف قطرها Gyration (صز) وللأمام كثافة نثر I(0)، لكل منحنى ونثر (* ave.dat).
    5. توليد المؤامرات كراتكي لكل منحنى ونثر (* ave.dat)، لتقييم درجة اﻻكتناز.
    6. استخدام أوتوجنوم33 لحساب دالة التوزيع لبير (تسمى أيضا P(r)) لكل منحنى ونثر (* ave.dat). أدخل انطلاق دماكس ≈ 3 * صز د قيمةالحد الأقصى للحصول على منحنى P(r) سلس على النحو الأمثل. خلال الاستفادة المثلى من دماكس، تأكد من أن P(r) المحسوبة دالة يتسق مع المنحنى التجريبي ونثر بالتحقق من قيمة2 χ المبلغ عنها وتقييم مجمل تلائم المنحنى نثر بصريا.
    7. حساب الوزن الجزيئي ل Nsa1 من نثر المنحنيات باستخدام حجم ارتباط34.
    8. مقارنة المعلمات الهيكلية لكل تركيز التأكد من أنه لا توجد أي أضرار الإشعاع أو الآثار تعتمد على التركيز.
      ملاحظة: يمكن أن تظهر آثار تركيز كزيادة صز ودكحد أقصى بالنسبة زيادة تركيز بروتين. إلى الأمام نثر I(0) مقسوماً على تركيز العينة ينبغي أيضا تظل ثابتة عبر سلسلة تركيز البروتين.
  3. ساكسس النمذجة
    ملاحظة: لتحديد موضع ج-محطة Nsa1فلوريدا، Nsa1 كريستال الهيكل10 (PDB 5SUM) والمنحنيات ونثر ساكسس استخدمت للقيام بالجمع بين هيئة جامدة و أساسه النمذجة، واستخدام البرامج باقة 35 و الأسلوب الأمثل فرقة (الانتخابات)36 من جناح البرمجيات أتساس31. مجال WD40 Nsa1 يعامل كهيئة جامدة، بينما كانت على غرار ج-محطة Nsa1 جنبا إلى جنب مع عدة حلقات اضطرابه من المجال WD40 لاحتواء البيانات ساكسس التجريبية.
    1. إنشاء ملفات PDB الإدخال. يجب تقسيم الملف PDB كل مرة بقايا مفقودة من السلسلة الرئيسية، ولا يمكن أن تحتوي على عدة والتشكلات، يغاندس، ملف PDB أو جزيئات المياه.
    2. قم بتشغيل برنامج Pre_BUNCH35 لإعداد ملف PDB الإدخال لمجموعة (pre_bunch.pdb). إدخال تسلسل البروتين المستهدف (*.seq)، العدد من المجالات/بدبس التي تم إنشاؤها في 4.3.1، وكل من ملفات PDB الفردية التي تم إنشاؤها أعلاه.
    3. حساب الاتساع ونثر لكل ملف PDB الفردية باستخدام برنامج كريسول37. لتشغيل الإدخال كريسول ملف PDB الفردية ومنحني نثر ساكسس التجريبية (*.dat). سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف ستريك (*.alm).
    4. تشغيل باقة البرنامج35 نموذج المجال WD40 من Nsa1 ضد ساكسس البيانات باستخدام نهج الهيئة و منذ البداية جامدة مجتمعة. إدخال ملف PDB من Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb)، ومنحني نثر ساكسس التجريبية (*.dat)، والسعة الفردية (*.alm) ملفات لكل ملف PDB الجزئية التي تم إنشاؤها بواسطة كريسول.
    5. مقارنة القيمة2 χ من PDB انطلاق (5SUM) مع أن من طراز أصلها المتولدة عن مجموعة باستخدام البيانات ساكسس التجريبية.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون نموذجا ناجحاً من مجموعة قيمة2 χ أقل بكثير من طراز انطلاق. بعثرة النظري لنموذج مجموعة يجب أيضا أن تصف أيضا البيانات التجريبية كما يحكم بالفحص البصري للتراكب بين بعثرة النظري لنموذج مجموعة البيانات ساكسس وقيمته2 χ (الشكل 4، مركز خطوط الأنابيب).
    6. فحص ملفات الإخراج من باقة في بيمول38 تراكب بنية بلورية مع نموذج المتولدة عن حفنة، والمغلف ساكسس (الشكل 4، مركز خط الأنابيب) يدوياً.
    7. أعد تشغيل باقة 10-20 ضعفا لتوليد نماذج مستقلة التأكد من أن النماذج مماثلة.
      ملاحظة: ل Nsa1 كان هناك نطاق من القيم2 χ من ~ 1 إلى 3 من يدير مستقلة 20.
    8. فرقة النمذجة
      ملاحظة: كنهج اختياري لمجموعة تشغيل أما من بعثة مراقبة الانتخابات36 أو "الحد الأدنى فرقة البحث"39 (MES). بعثة لمراقبة الانتخابات، ومس استخدام نهج الفرقة، وأيضا مناسبة للبروتينات مع مرونة المجالات/المناطق التي في والتشكلات متعددة.
      1. قم بتشغيل برنامج مراقبة الانتخابات36 استخدام الخادم على شبكة الإنترنت أتساس. لتشغيل بعثة لمراقبة الانتخابات، ملفات PDB من 4.3.1، تسلسل البروتين المستهدف (*.seq)، والبيانات التجريبية ساكسس (*.dat) الإدخال.
      2. مقارنة القيم2 χ من PDB انطلاق (5SUM) مع أن من الفرقة التي تم إنشاؤها باستخدام البيانات التجريبية ساكسس بعثة لمراقبة الانتخابات.
        ملاحظة: ينبغي أن يكون فرقة مراقبة الانتخابات ناجحة قيمة2 χ أقل بكثير من طراز انطلاق. بعثرة النظرية للفرقة يجب أيضا أن تصف أيضا البيانات التجريبية كما يحكم بالفحص البصري للتراكب بين بعثرة النظرية للفرقة إلى البيانات ساكسس وقيمته2 χ (الشكل 4، حق خط الأنابيب). أحد يجب أيضا مقارنة القيم2 χ من باقة وبعثة مراقبة الانتخابات لتحديد النموذج الذي أفضل وصف البيانات ساكسس التجريبية.
      3. افحص يدوياً كونفورميرس بعثة لمراقبة الانتخابات في بيمول38 تراكب بنية بلورية مع كونفورميرس التي تم إنشاؤها بواسطة بعثة لمراقبة الانتخابات (الشكل 4). ملاحظة العدد الإجمالي من كونفورميرس وجزء صغير من شغل لكل الامتثال أن يسهم في تشتت المنحنى. لجزيئات أكثر تشدداً، مثل Nsa1، ينبغي أن يكون عدد كونفورميرس الصغيرة (1-5) (الشكل 4، أنابيب الحق)36.
      4. إعادة تشغيل مراقبة الانتخابات عدة مرات لضمان الحصول على نتائج متسقة.
        ملاحظة: ل Nsa1 من كونفورميرس وكان العدد عادة 3 إلى 4 مع χ2 قيم تتراوح من 0.1 إلى 0.3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان Nsa1 بكر تضخيم من الحمض النووي S. cerevisiae وسوبكلونيد إلى ناقل التي تحتوي على علامة تقارب العاشر 6-الحامض الأميني الطرفي ن تليها MBP وموقع البروتياز TEV. وتحولت Nsa1 إلى خلايا BL21(DE3) كولاي وعالية الغلة من التعبير البروتين تم الحصول عليها بعد التعريفي مع إيبتج والنمو عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها (الشكل 1A). وكان Nsa1 تنقية تقارب راتنج تقارب الكوبالت المعطل تداولها، متبوعاً بانشقاق MBP بحوزتي TEV، وأخيراً حل بحجم الاستبعاد اللون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا البروتوكول، ولدت الدراسات الهيكلية Nsa1 المؤتلف من S. cerevisiae ساكسس بعلم البلورات بالأشعة السينية. وقد تصرفت بشكل جيد في حل Nsa1 وتبلورت في أشكال بلورية متعددة. وخلال الاستفادة المثلى من هذه البلورات، اكتشف أن ج-محطة Nsa1 كانت حساسة لتدهور حوزتي. عالية الدقة، يمكن فقط تكرار نموذج بلوري مع المتغيرات اقتطاع ج--المحطة الطرفية من Nsa1، من المحتمل نظراً للمرونة ج-المحطة من Nsa1 منعت التعبئة كريستال. هيكل Nsa1 تم حلها عن طريق البلورات بالأشعة السينية بدقة عالية، ولكن لا يمكن بناء ج-المحطة في شكل كريستا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجمعت البيانات حيود في "جنوب شرق الإقليمي وصول الفريق التعاوني" (SER-القط) 22-معرف و 22-BM بيملينيس في المتقدم فوتون المصدر (الجزائرية)، "مختبر أرغون الوطني". وجمعت البيانات ساكسس على بيمليني العرافات في تقدم الضوء المصدر (ALS)، "مختبر لورنس بيركلي الوطني". ونود أن نشكر الموظفين في بيامليني العرافات لمساعدتهم بجمع بيانات الاستشعار عن بعد ومعالجة. ونحن ممتنون لبحوث قياس الطيف الكتلي الكتلة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (نيس) وفريق الدعم للحصول على مساعدة في تحديد حدود المجال البروتين. وأيد هذا العمل "لنا المعهد من البرنامج الصحي الوطني داخلية البحوث"؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (نيس) (ES103247 ضياء أن ر. أ. س.) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا، 146626 إلى M.C.P). استخدام لوكالة الأنباء الجزائرية يدعمه مكتب علوم الطاقة الأساسية تحت "رقم العقد" ومكتب العلوم ووزارة الطاقة الأمريكية ث-31-109-إنكلترا-38. وأيده الاستخدام من مصدر الضوء المتقدم (ALS) مدير مكتب العلوم بمكتب علوم الطاقة الأساسية، من "وزارة الطاقة الأميركية" تحت "رقم العقد" دي-AC02-05CH11231. دعم إضافي بيمليني "ساكسس العرافات" يأتي من "المعهد الوطني للصحة" مشروع مينوس (R01GM105404) والراقية الأجهزة منحة S10OD018483. ونود أيضا أن أشكر القمر أندريا والدكتور أندريس سارة قراءة نقدية لهذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>الاستنساخ الجزيئي ل Nsa1< / strong>
pMBP2 المتجه المتوازيشيفيلد وآخرون ، تعبير البروتين وتنقية 15 ، 34-39 (1999) استخدمنانسخة معدلة من pMBP2 والتي تضمنت علامة N الطرفية (pHMBP)
S. cerevisiae DNA الجينوميATCC204508D-5
بادئات لاستنساخ Nsa1< / قوي>
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGG
TTACTAGTCAGCTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
<قوي > إنتاج البروتين المؤتلف وتنقية Nsa1< / قوي>
الإشريكية القولونية BL21 (DE3) الخلايا النجميةInvitrogenC601003
pMBP- NSA1 والاقتطاعات المختلفةLo et al. ، 2017
الأبعاد الجزيئيةSelenomethionineMD12-503B
IPTG ،PromegaV3953
EDTA الخاليكوكتيل Sigma-Aldrich4693159001
كلوريد الصوديومكيماويات مختبر كاليدون7560-1-80
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجما-ألدريتشM2670
تريس بافر ، 1 متر درجة حموضة 7.5دينار كويتي طبيRGF-3340
الجلسرينإنفيتروجين15514-029
بيتا ميركابتو إيثانولسيجماM6250
1M إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0TeknovaI6980-06
تالون تقارب الراتنجClonetech635503
Amicon Ultra 15 مل فلتر الطرد المركزي (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel عمود الترشيحGE-Healthcare28989335
TEV Proteaseمن إعداد NIEHSProtein Expression Core Expression Plasmid المقدم من NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology، 2009)
4-15٪ Mini-PROTEAN TGX المواد الهلامية للبروتين مسبقة الصبBioRad456-8056
<قوي > تبلور ، فحص محلل للبروتين < قوي>
شاشة كريستالهامبتون ريسيرشHR2-110
شاشة كريستال 2هامبتون ريسيرشHR2-112
سولت آر إكسهامبتون ريسيرشHR2-136
شاشة مؤشرهامبتون ريسيرشHR2-144
PEG / أيون شاشةهامبتون ريسيرشHR2-139
JCSG +الأبعاد الجزيئيةMD1-37
الأبعاد الجزيئيةللتآزر الترسيب المعالجMD15-PS-T
Swissci 96 جيدا 3 قطرات UVP يجلس لوحات إسقاطTTP Labtech4150-05823
شريط مانع للتسرب بعرض 3 بوصاتهامبتون ريسيرشHR4-506
مجموعة Proti-Aceهامبتون للأبحاثHR2-429
PEG 1500الأبعادالجزيئيةMD2-100-6
PEG 400الأبعاد الجزيئيةMD2-100-3
هيبيس / هيدروكسيد الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.5الأبعاد الجزيئيةMD2-011-سترات
الصوديوم ثلاثية القواعدالأبعاد الجزيئيةMD2-100-127
22 مم × 0.22 مم الغطاء السيليكونيهامبتون ريسيرشHR3-231
24 لوحة بئر مع مانع التسرب (لوحة VDX مع مانعة للتسرب)هامبتون ريسيرشHR3-172
حلقات نايلون مثبتة على 18 ملم (0.05 مم إلى 0.5 ملم)هامبتون ريسيرشHR4-945 ، HR4-947 ، HR4-970 ، HR4-971
طقم حبة البذورهامبتون ريسيرشHR2-320
قبعات كريستال مغناطيسيةهامبتون ريسيرشHR4-779
عصا التبريد المغناطيسيةهامبتون للأبحاثHR4-729
رغوة مبردة ديوارهامبتون للأبحاثHR4-673
نظام عفريت كريستالMiTeGenM-CP-111-021
تنورة كاملة 96 لوحة واضحةجيدا VWR10011-228
حصيرة الختم AxyMatVWR10011-130
Equipment< / strong>
UVEX-mJAN Scientific، Inc.
Nanodrop Lite SpectrophotometerThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Websites
HKL2000Otwinoski and Minor، 1997
PhenixAdams et al.، 2010
CootEmsley et al.، 2010
ATSASPetoukhov et al. ، 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo and Tainer ، 2013
Pymolنظام الرسومات الجزيئية PyMOL ، الإصدار 1.8 Schr & ouml. دينجر ، ذ م م.
بانشبيتوخوف وسفيرجون ، 2005
CRYSOLSvergun وآخرون ، 1995
PRIMUSKonarev et al ، 2003
EOMTria et al ، 2015
كوكتيل من الديوكسان ، ،

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516(2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431(2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SAXS Nsa1 Ab Initio

مقالات ذات صلة