مقالة منهجية

ميكروبروبي الشعرية التفريد قياس الطيف الكتلي لجميع الخلايا المفردة في أجنة "الضفادع يعيش" (ليفيس النمو)

20.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56956

⸱

ديسمبر 22, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

في هذه المقالة

ملخص

ونحن تصف الخطوات التي تمكن بسرعة في الموقع لأخذ العينات من جزء صغير من خلية مفردة بدقة عالية وغزو الحد الأدنى باستخدام المستندة إلى الشعرية الصغرى-أخذ العينات، تيسيرا لتوصيف المواد الكيميائية للقطة نشاط الأيضي في ويعيش الأجنة باستخدام خلية واحدة مبنية خصيصا التفريد الشعرية ومنصة الكتلي.

الملخص

التحديد الكمي للجزيئات الصغيرة في خلايا مفردة يثير إمكانيات جديدة لتحسين فهم العمليات الأساسية التي تقوم عليها التنمية الجنينية. لتمكين خلية واحدة التحقيقات اللازمة مباشرة في الأجنة الحية، نهج تحليلية جديدة، لا سيما تلك التي الحساسة وانتقائية، والكمية، وقوية وقابلة أن خلية مختلفة الأحجام. نقدم هنا، على بروتوكول يتيح تحليل الأيض في الخلايا المفردة في تطوير أجنة الضفدع المخالب جنوب أفريقيا (ليفيس النمو)، نموذج قوية في الخلية وعلم الأحياء التنموي بحرية في الموقع . ويستخدم هذا النهج ميكروبروبي شعرية لنضح جزء محدد من الخلايا المفردة التي تم تحديدها في الجنين، ترك الخلايا المجاورة سليمة للتحليل اللاحق. يتم تحليل محتوى الخلية التي تم جمعها بواسطة microscale شعرية التفريد اليكتروسبراي تاين (CE-ESI) واجهة بالإضافة إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية جنبا إلى جنب. وهذا النهج قابلة لأحجام مختلفة من الخلية ومتوافقة مع بنية ثلاثية الأبعاد معقدة للجنين النامي. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر أن ميكروبروبي خلية واحدة CE-ESI-MS يتيح الكشف عن تغاير خلية الأيض التي تتكشف كما يثير خلية السلف لاحفاد أثناء وضع الجنين. بجانب الخلية وعلم الأحياء التنموي، البروتوكولات تحليل الخلايا المفردة الموصوفة هنا قابلة لأخرى أحجام الخلية، أنواع الخلايا، أو نماذج حيوانية.

المقدمة

ويتطلب فهم شامل للتنمية الجنينية توصيف جميع التغيرات الجزيئية التي تتكشف في كل خلية من الكائن الحي النامي. بينما الجيل التالي "التسلسل" مع التضخيم الجزيئية يمكن قياس أعماق من خلية واحدة ترانسكريبتوميس1 في تطوير نظم2،3، أقل بكثير المعروف عن مجموعة الجزيئات الصغيرة تنتج في الخلايا الجنينية واحد، بما في ذلك البروتينات، ولا سيما، والايضات (الكتلة الجزيئية < دا ~ 1,500). مع استجابة سريعة وديناميكية للأحداث الجوهرية والخارجية، ميتابولومي بمثابة واصف قوية للدولة الجزيئية في خلية. ولذلك، يثير ميتابولومي خلية واحدة، يمكن أن تتبع التنمية المكانية والزمانية لتغاير الخلية في الجنين المبكر وتحديد الجزيئات الجديدة للدراسات الفنية. ومع ذلك، دون تضخيم الجزيئية المتاحة لهذه الجزيئات، يطالب الكشف عن ميتابولومي حساسية استثنائية باستخدام الطيف الكتلي (مللي ثانية)، التي هي التكنولوجيا المفضلة لتحليل المستقلب.

خلية واحدة مرض التصلب العصبي المتعدد هو عبارة عن مجموعة من التكنولوجيات بحساسية كافية لقياس نواتج الأيض في الخلايا المفردة (انظر ملاحظات 4،،من56،،من78،9 ،10،11،،من1213،،من1415). أخذ العينات استنساخه من خلايا وكفاءة الاستخراج من نواتج الأيض ضرورية لنجاح الكشف عن نواتج الأيض في الخلايا المفردة. ومكن تشريح كامل الخلية من الخلايا التي تم تحديدها في الأجنة النمو توصيف الجزيئات الصغيرة والببتيدات16. نهوج أخرى تستخدم ميكروبيبيتيس لأخذ عينات الخلايا الحية الفردية تليها الكشف عن استخدام اليكتروسبراي التأين (ESI) مرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال، تم قياس نواتج الأيض في المصنع أو في خلايا الثدييات خلية واحدة فيديو MS17وضغط التحقيق18، مسبار واحد19وقوة فلويديك المجهري20، بين التقنيات الأخرى21، 22،،من2324. بالإضافة إلى ذلك، يبسط إدماج فصل المواد الكيميائية قبل التأين في سير مرض التصلب العصبي المتعدد الخلايا المفردة كفاءة ميتابولومي، وبالتالي التخفيف من حدة التدخلات المحتملة خلال جيل أيون قبل الكشف. الأهم من ذلك، يوفر الفصل أيضا المعلومات الخاصة بمجمع للمساعدة في التعرف الجزيئي. وقد استخدمت التفريد الشعرية (CE) للكشف عن نواتج الأيض في تشريح واحدة25،26 أو ميكروسامبليد27الخلايا العصبية، التقاط جزيء صغير الاختلافات بين الخلايا العصبية تعمل. ونحن مؤخرا تتكيف CE الترادف ESI MS لتمكين تتبع مستوى الكشف عن مئات من نواتج الأيض في الخلايا الفردية التي تم تشريح من الأجنة في وقت مبكر من النمو لإيفيس16،28. هذه الدراسات كشفت عن اختلافات ايضية الدهشة بين الخلايا الجنينية في مرحلة مبكرة من التنمية، وأدت إلى اكتشاف نواتج الأيض مع سبق الآثار الإنمائية غير معروف16.

هنا نقدم بروتوكول تم تمكين الكشف عن نواتج الأيض في الخلايا المفردة في جنينا فقاريات حية باستخدام ميكروبروبي خلية واحدة CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد29،30مباشرة. نموذج الكائن المختار هو 8-إلى-32-الخلية X. laevis الجنين، على الرغم من أن هذا النهج ينطبق أيضا على المراحل اللاحقة للتنمية وأنواع أخرى من طراز الكائنات الحية. يستخدم هذا البروتوكول شحذ الشعيرات الدموية مع مراقبة متعدية الجنسيات المتعددة المحاور تحت التوجيه بنظام تصوير عالي الدقة لنضح جزء nL ~ 10 من الخلايا التي تم تحديدها في الموقع في الجنين النامي معقدة شكلياً. هذا ميكروبروبي قابلة لخلايا أصغر ويعمل في غضون ثوان، وسريعة بما فيه الكفاية لتتبع الأنساب الخلية في الجنين. بعد استخراج القطبية أو الجزيئات الصغيرة أبولار، مثل نواتج الأيض والببتيدات، من العينة التي تم جمعها في ~ 4-5 ميليلتر استخراج الحل، 10 ~ يتم تحليل nL استخراج الناتجة في منصة CE مبنية خصيصا بالواصلة إلى مطياف شامل دليل الاستدامة الاقتصادية. بناء وتشغيل النظام الأساسي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد يبني على البروتوكولات المذكورة في أماكن أخرى. 31 , 32 هي التي شيدت في واجهة CE ESI co-المحوري كما هو موضح في مكان آخر. 31 هو الإبقاء على هذا النظام الأساسي في نظام الرش مخروط النفاثة لتحقيق مستوى التتبع حساسية مع قدرة على القياس الكمي على مدى 4-5 ترتيب سجل-دينامية (النسبي28،29،30 أو المطلقة16). يوفر النظام الأساسي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد حد أدنى 60-أمول الكشف مع الانحراف المعياري النسبي بنسبة 8 في المائة (RSD) في كوانتيتيشن أكثر من مجموعة اختبار من 10 نانومتر إلى 1 ميكرومتر للجزيئات الصغيرة16، وكافية لتوصيف نواتج الأيض الذاتية في س. ليفيس الخلايا. خلايا ميكروبروبيد الاستمرار في تقسيم تقدم الجنين من خلال تطوير30، مما يسمح بتحليل حل زمنياً ومكانيا الأيض الخلوية. في الواقع، يمكن استخدامها خلية واحدة CE-أي إس أي-مللي ثانية البحث عن الاختلافات الأيضية بين الخلايا التي تشغل الظهرية البطني16،29،16من الحيوانات النباتية، والمحاور الإنمائية28 من اليسار واليمين، فضلا عن الخلايا أن تشكل نسب الأنسجة العصبية الظهرية الطالع من خلية السلف مشترك في X. laevis30. بالإضافة إلى الاستعلام عن الأيض الاختلافات بين الخلايا الجنينية الفردية في مختلف مراحل نمو الجنين X. laevis 30، ونحن نتوقع أن البروتوكولات المذكورة هنا تنطبق على مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية و ميكروسامبليد خلايا مفردة من مراحل مختلفة من التنمية الجنينية، فضلا عن أنواع أخرى من الخلايا والكائنات نموذج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ميكروبروبي ميكروسامبلينج بينما منصة مختلفة متوافقة مع عينات ضئيلة يمكن أن تستخدم لفصل و/أو توصيف الجزيئات الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كافة البروتوكولات المتصلة بالصيانة ومعالجة النمو ليفيس وافقت عليها لجنة الاستخدام في جامعة جورج واشنطن ورعاية الحيوان المؤسسية (IACUC لا. A311).

1-إعداد العينات الصكوك، ووسائط الإعلام، والمذيبات، وأخذ عينات من الأطباق

  1. إعداد 1 × الحل شتاينبرغ (SS) بإذابة الأملاح التالية في الماء عالي النقاوة (~18.2 MΩ.cm عند 25 درجة مئوية) في الترتيب التالي وتركيزات المشار إليها بعد معيار البروتوكول33: كلوريد الصوديوم (58.2 مم)، (كلوريد البوتاسيوم 0.67 ملم)، نترات الكالسيوم (0.34 mM) وسلفات المغنيزيوم (0.83 مم)، تريس-هيدروكلوريد (4.19 ملم)، وقاعدة تريس (0.66 ملم). جعل 0.5 x SS من شقين، و 0.1 x SS بعشرة إضعاف إضعاف، من 1 x SS استخدام ماء عالي النقاوة.
  2. إعداد أطباق أخذ العينات من الأولى مما يجعل نسبة 2% [اغروس] في 1 × سان اﻷوتوكﻻف عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة حل. وفي حين لا يزال السائل، معطف الجزء السفلي من أطباق بيتري 60 ملم مع الحل. مرة واحدة [اغروس] هلام تبريده وتوطد، لهب نهاية ماصة باستور ستة بوصة حتى تشكل كرة، وخفة تلمس نهاية ساخنة بصمة 5-10 آبار، ~ 1 مم العميق، إلى [اغروس].
    ملاحظة: تستخدم هذه الآبار شل الأجنة أثناء أخذ العينات.
  3. إعداد المستقلب استخراج المذيبات. خياط الخصائص الفيزيائية الكيميائية المذيب (مثلاً، الأقطاب ودرجة الحموضة) لفئات الجزيئات التي موضع اهتمام في الدراسة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، نستخدم الميثانول 40% والاسيتو الانيتريل 40% في المياه LC-مرض التصلب العصبي المتعدد-الصف كنهج اكتشاف لاستهداف والايضات القطبية أساسا، وعدد قليل من الأيض والببتيدات أبولار28.
  4. جعل حلقات الشعر باستخدام الشعر نظيفة وماصة باستور كما هو موضح في مكان آخر من33 للطف نقل الأجنة في أطباق بتري مع الحد الأدنى من اضطراب.
  5. اختﻻق ميكروبيبيتيس نصيحة مدبب كما هو مبين في الشكل 1 ألف.
    1. أولاً، سحب الشعيرات الدموية البورسليكات (1,000/500 ميكرومتر قطرها الداخلي/الخارجي) في ساحبة المشتعلة-براون من نوع شعري مع الإعدادات التالية: الحرارة = 355؛ سحب 65، السرعة = = 80؛ الوقت = 150.
    2. بعد ذلك، توقف غيض ميكروبيبيتي سحبت باستخدام زوج من غرامة الملقط حادة للحصول على نصيحة شعرية القطر الخارجي من ~ 20 ميكرومتر. تنفيذ هذه الخطوة تحت ستيريوميكروسكوبي للمساعدة على الدقة وإمكانية تكرار نتائج.
      ملاحظة: الشعيرات الدموية مع تلميح صغيرة عرضه لانسداد أثناء التطلع للزوجة السيتوبلازم. بينما يساعد الشعيرات الدموية مع تلميح أكبر بالتأكيد تجنب انسداد ونضح أكثر من المحتوى الخلوية، قد تطرح تحديات أثناء أخذ عينات خلايا أصغر كبيرة تحمل الشعيرات الدموية، وربما تلف الخلية لأخذ العينات اللاحقة. التعديل الدقيق للضغط والوقت تطلع قد تخفف جزئيا من هذه التحديات. أننا نجد ميكروبيبيتيس مع ~ 20 ميكرومتر القطر الخارجي مثالية للعمل المقدمة هنا.

2-ميكروسامبلينج واحد الخلايا واستخراج المستقلب

  1. الحصول على الأجنة (بيضة مخصبة) عن طريق المستحثة تروج التزاوج الطبيعي للكبار ليفيس النمو أو عن طريق الإخصاب في الأنابيب كما هو موضح في البروتوكولات في أماكن أخرى33،34.
    ملاحظة: التزاوج الطبيعي يضمن أن مراحل النمو الجنيني هي متداخلة بينما الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق الإخصاب في الأنابيب أكثر موثوقية في العرض. ومع ذلك، يتطلب الإخصاب في الأنابيب التضحية الضفدع الذكور البالغين.
  2. تعد طازجة 2% سيستين ديجيليينج الحل بإذابة 4 جم سيستين في 200 مل الماء عالي النقاوة و dropwise ضبط الحل على درجة الحموضة 8 استخدام حل هيدروكسيد الصوديوم N 10.
  3. إزالة المعاطف جيلي المحيطة الأجنة لأنها تبدأ تنشق إلى مرحلة 2-خلية على النحو التالي: اسمحوا الأجنة الراحة في الحل ديجيليينج لمدة 2 دقيقة، ثم بلطف دوامة لهم 2 دقيقة إضافية لمنع الأجنة من الانضمام إلى السطح لجمع الطبق.
  4. بلطف صب محتويات الطبق في كوب نظيف وصب بسرعة حل ديجيليينج من الكأس. فورا وتغطي البيض مع 0.1 x SS شطف المتبقية ديجيليينج الحل، بلطف دوامة، وصب ثم الحل. كرر هذه الخطوة أربع مرات دقة تغسل الأجنة.
    ملاحظة: الحد من التعرض للأجنة في حل ديجيليينج إلى 4 دقيقة لضمان السلامة. بروتوكولات شاملة لإزالة المعاطف جيلي متوفرة في أي مكان آخر33.
  5. نقل الأجنة ديجيليد إلى 1 x س في طبق بتري. لتقليل الازدحام داخل اللوحات، وضع الأجنة ~ 100 الواحدة 100 مم طبق33.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق التي تحتوي على الأجنة بين 14-18 درجة مئوية إلى إبطاء التنمية والحصول على الأجنة في مراحل تنموية متعاقبة من نفس الوالدين. يتم نشر المزيد من المبادئ التوجيهية في الاعتماد على درجة الحرارة للنمو والتنمية في إكسينباسي وفي أماكن أخرى33،35،،من3637.
  6. فرز ناهضة الأجنة في المرحلة 2-خلية في صحن منفصل في التي تصبغ النمطية ثقة يمثل المحور الظهري البطني، مع الإشارة إلى خلية المنشأة مصير خرائط38،،من3940.
    1. تحديد الأجنة بشكل صحيح ناهضة بضمان أن تقسم ثلم الانقسام الأول، الذي ديماركس الطائرة ميدساجيتال، حزن (البطني) واستخفاف (الظهرية) مصطبغة القطب الحيوان أن النصفي صور معكوسة41.
  7. جبل ميكروبيبيتي ملفقة على ميكرومانيبولاتور المتعددة المحاور (يدوي أو التحكم عن بعد). الاتصال ميكروبيبيتي ميكروينجيكتور.
  8. استخدام ماصة نقل بلاستيك لنضح ~ 5 من 8 خلايا الأجنة ونقلها إلى طبق العينات المحتوية على 0.5 x SS.
باستخدام حلقة شعر، وضع الجنين أخذ عينات في بئر فردية، والتأكد من أن الخلية التي تم تحديدها بشكل صحيح لمصلحة تواجه ميكروبروبي في زاوية ~ 90°.
ملاحظة: تحديد الخلايا استناداً إلى تصبغ والموقف في الجنين، مع الإشارة إلى خلية مصير خرائط38،،من3940.
  • بينما كان يعمل تحت ستيريوميكروسكوبي (في التكبير X 20-30)، دليل غيض من ميكروبيبيتي في خلية واحدة فقط التي تم تحديدها داخل الجنين يعيش كما هو مبين في الشكل 1 (انظر أخذ عينات من نقاط على الخلايا في لوحة ب والأجهزة في لوحة ج).
  • الانسحاب المطلوب جزء من محتوى الخلية بتطبيق نبضات الضغط السلبي على ميكروكابيلاري استخدام ميكروينجيكتور ('وضع التعبئة').
    ملاحظة: على سبيل المثال، نحن بشكل روتيني نضح ~ 10-15 وحدة التخزين nL من الخلية عن طريق تطبيق نبضات ~ 3-30 psi لشعري. هذا كله خطوة يدوم ~ 5 s لتطلع30.
  • بلطف سحب ميكروبروبي من الخلية ونقل في تلميح إلى 4 ميليلتر من المذيب المستقلب استخراج مبردة (4 درجة مئوية) في قنينة صغيرة الحجم. المقبل، تطبيق موجه ضغط من psi + 80 1 s لشعري استخدام ميكروينجيكتور ('الوضع واضح') تطرد في أسبيراتي إلى المذيب.
    1. أحكام إغلاق القنينة لمنع التبخر ومكان القنينة مرة أخرى في دلو الجليد 4 درجات مئوية حتى اكتمال أخذ العينات. تجاهل ميكروبيبيتي المستخدمة في حاوية الأدوات الحادة لمنع خطر على مخاطر.
      ملاحظة: لتحديد حجم محتوى الخلية يستنشق، حقن أسبيراتي في الزيوت المعدنية، حيث يحصل على شكل كروي. ويمكن قياس القطر من هذا المجال باستخدام مجهر. حساب حجم يستنشق: V = 4/3 π ص3، الخامس هو وحدة التخزين، حيث r هو نصف قطر الكرة.
  • لأخذ عينات مرة أخرى في نفس الخلية أو الخلايا الأخرى للجنين، كرر الخطوات من 2.7-2.11 (الشكل 1 ج). لتجنب احتمال تحمل أكثر من بين العينات على التوالي، استخدام ميكروبيبيتي جديدة لتحليل كل خلية مختلفة.
  • وبمجرد الانتهاء من أخذ العينات، دوامة ميكس قارورة ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على نموذج ل ~ 1 دقيقة للتعجيل باستخراج والايضات، ثم الطرد المركزي في × 8,000 ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الحطام الخلوية والجسيمات الأخرى.
  • تخزين مقتطفات الخلية مع خلية الحطام والمواد سرع في-20 درجة مئوية لمدة يوم أو في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر حتى القياس قبل CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد.

    • 3-قياس م-أي إس أي-MS

    1. إعداد المعايير والحلول ل CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد
      1. إعداد اﻻلكتروﻻيت الخلفية (بج) تتكون من 1% حمض الفورميك في المياه الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
      2. إعداد حل غمد تحتوي على الميثانول 50% في الصف LC-MS المياه و 0.1% حمض الفورميك.
      3. إعداد 50 نانومتر أستيل الحل في الحل غمد للتقييم اليومي لأداء نظام CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد.
      4. إعداد الحل كلوريد الصوديوم 150 مم ككتلة-المعايرة القياسية للنطاق المنخفض m/z في وضع أيون إيجابية. كتلة (m/z) دقة < ويوصي 10 أجزاء من المليون. اتبع إرشادات المورد مطياف الشامل القيام بهذه الخطوة.
        ملاحظة: بدلاً من ذلك، المعايير الأخرى مع القيم المعروفة m/z يمكن استخدام كتلة معايرة المطياف الشامل.
    2. بناء منصة CE-ESI
      1. بناء منصة حقن CE قادرة على ترجمة الرأسي السريع من مرحلة عقد القنينة بج والعينة تحميل ميكروفيال. لتشييد وتشغيل النظام الأساسي، الرجوع إلى التفاصيل في المراجع31.
      2. تجميع واجهة CE-ESI (الشكل 1 ج) على النحو التالي. جبل باعث اليكتروسبراي معدنية (130/260 ميكرومتر الداخلي/الخارجي ~ 35 مم وقطرها الطول) إلى المنفذ 3 تي-اتحاد. تغذية شعري فصل CE (40/105 ميكرون الداخلي/الخارجي ~ 100 سم وقطرها الطول) عن طريق باعث اليكتروسبراي السماح لها نتا ~ 40-100 ميكرومتر خارج الحافة الباعث. العمل في إطار ستيريوميكروسكوبي للمساعدة في دقة.
        1. قم بتوصيل الشعرية الحل غمد (75/360 ميكرومتر الداخلي/الخارجي ~ 100 سم وقطرها الطول) المنفذ المتبقية لتوريد حل اليكتروسبراي. استخدام الأكمام المناسبة والإصبع-تشديد اتصالات لعملية خالية من تسرب واجهة CE-دليل الاستدامة الاقتصادية. الإشارة إلى البروتوكولات السابقة31،32 للحصول على تفاصيل في الجمعية العامة، وحل المشاكل لهذه الواجهة.
          ملاحظة: يؤثر الأبعاد الشعرية نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N) ومدة الانفصال. على سبيل المثال، تيسير الشعيرات تحمل ضيقة وقصيرة سريعة نسخ فصل الألوان باستخدام أعلى فصل الفولتية42،43. بالإضافة إلى ذلك، استناداً إلى أنواع الجزيئات التي موضع اهتمام في دراسة، قد تكون مغلفة فصل الشعيرات الدموية للتقليل من تجنب التفاعلات غير المرغوب فيها شعري جزيء الجدار44.
      3. باستخدام لوحة حامل، تحميل واجهة CE-دليل الاستدامة الاقتصادية إلى مرحلة ترجمة ثلاثة محاور وموقف نصيحة باعث اليكتروسبراي ~ 2 مم من الفوهة مطياف كتلة (الشكل 1 ج).
      4. لتنظيف مكونات الواجهة، الشطف بإمداد بجي عن طريق فصل CE الشعرية والحل غمد اليكتروسبراي عن طريق باعث اليكتروسبراي في 1 ميليلتر/دقيقة. استخدام المحاقن مضخات لتغذية المذيبات بمعدل ثابت.
      5. تدفق شعري فصل CE قبل كل قياس عن طريق توصيل حقنه نهاية مدخل الشعرية. استخدام المحاقن كبيرة بما يكفي للتقليل من إعادة الملء وفتيلة من خطوط الإمداد بالمذيبات.
        ملاحظة: تجارب عادة استخدام المحاقن 1 مل الغاز محكم لتوريد المذيب غمد اليكتروسبراي وحقنه 500 ميليلتر لمسح شعري الانفصال.
    3. التحقق من صحة من منصة CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد وقياس نواتج الأيض
      ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة لتأكيد حساسية تحليلية الصك CE-أي إس أي-مللي يوميا قبل تحليل مقتطفات خلية واحدة.
    استخدام منصة CE ESI الموصوفة هنا، يمكننا إنجاز حد أدنى للكشف على 60 أمول استخدام متعامد تسريع وقت الطيران مطياف كتلة الرباعي16.
    1. بعد الشطف نقل فصل الشعرية ~ 5 دقيقة، لها مدخل إلى الحل بج يقع في قنينة الفولاذ المقاوم للصدأ.
    2. ضع طرف باعث اليكتروسبراي ~ 2 مم من الفوهة مطياف كتلة وغرامة في ضبط هذه المسافة باستخدام مرحلة ترجمة لتوليد اليكتروسبراي في نظام مخروط النفاثة مستقرة أثناء مراقبة الرش باستخدام ستيريوميكروسكوبي (انظر المراجع 31،45). رصد استقرار أيون المجموع الحالي (عرة) ~ 30-45 دقيقة لضمان تشغيل مستقر.
    3. تطبيق ~ 20 كيلوفولت إلى القنينة بجي بتكثف تدريجيا إمكانية ما يزيد على 15 ~ s، عادة توليد ~7.5 µA الحالي عبر الشعرية فصل استخدام حمض الفورميك 1% كما بجي. قبل كل قياس، وضمان استقرار النظام عن طريق رصد الشخصية عرة ~ 5-10 دقيقة، ومن ثم المجوعات انخفاض إمكانية الانفصال (CE) 0 الخامس (الأرض).
      ملاحظة: لشبه أتمتة هذه العملية، ونحن استخدام برنامج مخصص مكتوب للتحكم عن بعد في إمدادات الطاقة عالية الجهد م31. إذا كان النظام الأساسي CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد غير مستقرة، بعناية تقييم مصدر عدم الاستقرار عن طريق اختبار منهاج CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد أولاً في وضع دليل الاستدامة الاقتصادية فقط وثم في وضع التشغيل CE-دليل الاستدامة الاقتصادية الموصى بها في أماكن أخرى31. بإيجاز، لاختبار منهاج العمل في وضع دليل الاستدامة الاقتصادية فقط، إيقاف في CE عالية الجهد ورصد عرة ~ 30 دقيقة في نظام الرش مخروط النفاثة. إذا لزم الأمر، المضي قدما على النحو التالي لمعالجة الأخطاء: (ط) تفقد اتصالات للتسربات؛ (ثانيا) تنظيف باعث اليكتروسبراي مع الميثانول؛ والمياه، المياه والايزوبروبانول (ثالثا) الغاز إزالة المذيبات؛ (رابعا) تدفق الباعث ل ~ 25 دقيقة قبل إجراء الاختبار مرة أخرى. إذا كان النظام الأساسي CE-إيسي هو العثور على مستقر في وضع دليل الاستدامة الاقتصادية فقط ولكن يصبح غير مستقر خلال فصل CE، تفقد النظام الجول التدفئة و/أو التحليل الكهربائي: (ط) تدفق شعري الانفصال مع بجي ~ 25 دقيقة وكرر التجربة؛ (ثانيا) استخدام إمكانات فصل أقل للحفاظ على استجابة المقاومها خطية (أي، CE الخطي الحالية مقابل منحنى الجهد الفاصل)؛ (ثالثا) تفقد الشعرية CE للأضرار المحتملة، مثل الشقوق، واستبدالها شعري إذا لزم الأمر.
    4. تحليل ~ 6 nL العينة على النحو التالي:
      1. "الماصة؛" 1 ميليلتر من الحل القياسية أستيل إلى القنينة الحقن.
      2. نقل الشعرية الانفصال من القنينة بجي إلى القنينة الحقن.
      3. رفع مرحلة الحقن CE 15 سم في 1s.
      4. عقد المرحلة مرتفعة 60 ثانية لحقن هيدروديناميكالي ~ 6 nL العينة إلى فصل الشعرية.
      5. وفي وقت لاحق، ترجمة مرحلة العودة إلى ابتداء من المستويات (تمشيا مع منفذ الشعرية).
      6. تحرك بلطف نهاية مدخل الشعرية إلى بجي.
      7. بعد ذلك مباشرة، تكثيف الجهد CE لبدء فصل الغرواني الكهربي.
      8. الحصول على البيانات MS ابدأ.
        ملاحظة: قد اتسم أداء النظام باستخدام أي معيار من المعايير الكيميائية. يسلم CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد خلية واحدة أدنى حدود الكشف في ~ 10 نانومتر (أمول ~ 60) أستيل والحامض الأميني الميثيونين16. حجم حقن (Vاينج)، إلى الشعرية في هولندا، يعتمد على الفرق الارتفاع (H، سم) أثناء الحقن، الكثافة (ρ, سم ز-3) واللزوجة (η, كغ م-1ق-1) من بجي، الطول (L، m) ونصف قطرها (r, ميكرومتر) من CE الشعرية، ومدة الحقن (تياينج، s). يتم التعبير عن هذه العلاقة بالمعادلة التالية، حيث يتم ز (m s-2) تسارع الجاذبية:
        figure-protocol-1
    5. متى تم الكشف عن المعيار، التوقف عن الحصول على البيانات، وانخفاض تدريجي إلى 0 V الجهد الفاصل (الأرض)، ثم استرداد الباعث على 2 سم من الفوهة. تدفق شعري الانفصال لمدة 5 دقائق قبل تحليل استخراج الخلية.
    6. NL تدبير 10 من خلية واحدة استخراج بتكرار الخطوات 3.3.1-3.3.5 استخدام 90 s لحقن هيدروديناميكالي العينة.
  • تجهيز البيانات
    ملاحظة: هو الهدف المتمثل في تجهيز البيانات لتحديد وتقدير حجم المركبات بين الخلايا المفردة. ينشئ البروتوكول CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد خلية واحدة قمم اليكتروفيروجرافيك ضيقة بعرض قاعدة نموذجية لبضع ثوان. عن طريق إجراء تحليل البيانات شبه يدوياً، فمن الممكن العثور على ميزات الجزيئية (قيم فريدة من نوعها m/z مع أوقات الهجرة فريدة من نوعها) باستخدام الخطوات التالية. يتم إظهار انفصال الممثل لتحديد نواتج الأيض التي تم تحديدها في الشكل 2 ألف.
    1. ملفات البيانات الخام معايرة الكتلة بعد الحصول على البيانات.
      ملاحظة: نحن نستخدم إشارات من الصوديوم فورمات المجموعات التي يتم إنشاؤها أثناء فصل أيونات الصوديوم وفيرة من العينة، التي أصلاً موجودة في الخلايا أو المستخرجة من وسائط الثقافة الجنين. والهدف من هذه الخطوة تعزيز هوية المستقلب في خطوات لاحقة بكفالة دقة عالية كتلة (m/z)، ويفضل أن يكون < 5 نجمة داود الحمراء، أو < 10 أجزاء من المليون، بين m/z 50-1، 000. هنا، وظيفة معايرة اقتناء البيانات يجعل من الممكن عادة الحصول على دقة الشامل < 1 جمعية نجمة داود الحمراء، أو < 2 جزء في المليون ل m/z 50-500.
    2. استخدام برنامج نصي لتجهيز، البحث عن السمات الجزيئية على نطاق جماعي تم الكشف عنها. متوسط الأطياف الشامل عبر كل ذروة لتحديد كتلة دقيقة، ويدون أوقات الهجرة المقابلة الخاصة بهم. للتعرف على نواتج الأيض منخفضة الكتلة في نطاق m/z 50-500، استخدم نافذة خطوة 500 جمعية نجمة داود الحمراء لرصد السمات الجزيئية مع S/N > 3.
    3. دمج الذروة المنطقة-تحت--المنحنى لكل ميزة الجزيئية يدوياً أو تلقائياً. وتستخدم قيم المجال الناتجة كمقياس لوفرة المستقلب.
    4. تحديد الخصائص الجزيئية للفائدة بثقة عالية على النحو التالي (انظر الشكل
    • 2 باء).
    1. أولاً، مقارنة كتلة دقيقة من السمات الجزيئية ضد قاعدة المستقلب (مثلاً، ميتلين46 و47من همدب) بدقة 10 أجزاء من المليون للحصول على قائمة بالتطابقات الجماعية المفترضة.
    2. وبعد ذلك، تقييم هذه المباريات الجماعية بمقارنة الطيف الشامل جنبا إلى جنب على الحصول عليها من الخلية تقاس مقتطفات مع البيانات المتاحة في قواعد البيانات المستقلب أو الطيف الشامل جنبا إلى جنب للمادة الكيميائية المقابلة القياسية.
    3. وأخيراً، التحقق من صحة هذه التعيينات بمقارنة وقت الترحيل من السمات الجزيئية المسجلة في مقتطفات الخلية مع المعايير الكيميائية المتصلة بتحليلها من قبل نفس الصك CE-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد.
      ملاحظة: لتعزيز الإنتاجية التجريبية، نحدد عادة فقط السمات الجزيئية مختلفة شكل يعتد به إحصائيا بين الظروف التجريبية أو أنواع الخلايا. تظهر تعريفات الممثل في الشكل 2. لتحديد نواتج الأيض مع درجة عالية من الدقة الشامل، نوصي خارجياً معايرة مطياف كتلة يوميا، إجراء تقويم في الوقت الحقيقي أثناء كل قياس استخدام معيار داخلية و/أو خارجياً الجماهيري معايرة كل قياس ينصح باقتناء البيانات بعد انتهاء الملف (مثلاً، لمجموعات فورمات الصوديوم هنا).
  • لمقارنة إنتاج جزيء صغير بين الخلايا المفردة، استخدام الذروة المنطقة-تحت--المنحنى في اليكتروفيروجرامس أيون المحدد (من الخطوة 3.4.3) كالمقاييس النسبية لوفرة مجمع.
    ملاحظة: في تجاربنا، استخدمت منصات البرمجيات على الإنترنت47 للقيام بكافة الخطوات لتحليل البيانات اللاحقة، بما في ذلك الخطوات التالية: أنا) تصفية السمات الجزيئية بالتواجد في 50 في المائة على الأقل من كل مجموعة العينات (مثلاً، الخلية نوع)؛ ثانيا) تطبيع البيانات؛ ثالثا) الإحصائية (مثل، تي-اختبار) وتحليل بيانات متعددة المتغيرات، مثل تحليل العنصر الرئيسي (PCA) وتحليل مجموعة هرمية (HCA). نحن نستخدم ف < 0.05 (الطالب t-اختبار) الاحتفال بدلالة إحصائية وتجليد-تغير ≥ 1.5 ملاحظة الأهمية البيولوجية.
  • لتحديد تركيز المطلقة من جزيء صغير في خلية واحدة، تنفيذ الأساليب الكلاسيكية للمعايرة (مثلاً، والمعايرة الخارجية أو إضافة قياسي) استخدام الذروة المنطقة-تحت--منحنى في المجمع لفائدة16.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    استخدمنا مؤخرا خلية واحدة ميكروبروبي CE أي إس أي-مللي ثانية لتوصيف نواتج الأيض في الخلايا الفردية التي تم تحديدها في تطوير بحرية النمو laevis الأجنة29،30. يمكن ميكروبروبي سريع (~ 5 ثانية/الخليوي)، في الموقع تطلع ~ 10 nL من خلية مفردة، وتطلعات متعددة من نفس الخلية، أو عدة خلايا مختلفة ضمن مراحل تطور الجنين يعيش (الشكل 1b) نفسه أو في وقت لاحق. يتم استخراج المحتوى الخلوية يستنشق استخدام...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    ميكروبروبي CE-ESI-MS يمكن وصف مباشر من نواتج الأيض في الخلايا المفردة في لايف، بحرية وتطوير الأجنة. في صميم النهج هي المكونات الفرعية التقنية اثنين، هما في الموقع ميكروسامبلينج الشعرية وحساسية عالية CE-ESI-السيدة "بالمقارنة" بتشريح كامل الخلية، ميكروسامبلينج الشعرية في استفادة عملية سريعة (بضع ثوان مقابل 5 دقيقة والخلية بتشريح)، التوافق مع مورفولوجية ثلاثية الأبعاد المعقدة للأجنة، وقابلية للخلايا الصغيرة التي تشكل في مراحل لاحقة من التنمية. خلافا للتشريح، أخذ العينات ميكروبروبي يترك الخلايا الأخرى الموجودة في ال...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    شكر وتقدير

    هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح GM114854 (إلى ب. ن.) ومنح CA211635 (إلى ب. ن.) وارنولد بيكمان مابل مؤسسة بيكمان الشباب المحقق (إلى ب. ن.)، جائزة أستاذ الشباب دوبون (إلى ب. ن.)، "الجمعية الأمريكية" للإعلام جائزة بحوث قياس الطيف الكتلي (إلى ب. ن.)، و "مؤسسة نادي" كوزموس زمالة (R.M.O. و E.P.P.). الآراء والاستنتاجات الواردة في هذا المنشور هي فقط تلك التي المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لمصادر التمويل.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    < قوية > الكواشف لوسائط زراعة الأجنة < / قوية >
    كلوريد البوتاسيومفيشر ScientificBP 366-1
    كبريتات المغنيسيومفيشر ScientificM 65-3
    نترات الكالسيومSigma AldrichC1396
    CysteineMP Biomedicals101444
    Trizma هيدروكلوريدسيجما ألدريتشT3253
    قاعدة تريزماسيجما ألدريتشT1503
    كلوريد الصوديومفيشر العلمي5641-212
    <قوي>الاسم<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات
    ><قوي>مستقلب مذيبات الاستخراج< / قوي>
    الأسيتونيتريل (LC-MS-grade) فيشرScientificA955
    الميثانول (LC-MS-grade)فيشر ScientificA456
    المياه (LC-MS-grade)فيشر ScientificW6
    nameالشركة< قوي><قوي>رقم الكتالوج< / قوي >< قوي > تعليقات < / قوي
    > < قوي > المذيبات ومعايير CE-ESI-MS < / قوي >
    حمض الفورميك (LC-MS الصف) فيشرScientificA11710X1-AMP
    الميثانول (LC-MS الصف) فيشرScientificA456-4
    الماء (LC-MS-grade)فيشر ScientificW6
    كلوريد الصوديومفيشر العلمي5641-212
    كلوريد الأسيتيل كولينأكروس العضوية159170050
    <قوي>الاسم<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات
    ><قوي>إعداد تصنيع المجهر الدقيق
    مجتذب Micropippetteشركة Sutter Instrument Co.P-1000
    الشعيرات الدموية البورسليكاتشركة سوتر للأدواتB100-50-10
    ملقط حاد ناعم: Dumont # 5 ، Biologie / DumoxelFine Science Tools (USA) Inc11252-30مقاوم للتآكل وقابل للتعقيم.
    <قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
    Microprobe Sampling Setup
    MicromanipulatorEppendorf, Hauppauge, NYTransferMan 4r
    StereomicroscopeNikonSMZ18يجب أن تكون معزولة بالاهتزاز.
    مضيئة مثل GoosenecksNikonC-FLED2
    MicroinjectorWarner Instrument، Handem، CTPLI-100A
    ماصات نقل (بلاستيك ، يمكن التخلص منها)طبق بتري فيشر Scientific13-711-7M
    60 مم و 80 ممفيشر ScientificS08184
    ماصات باستور زجاجية (بورسليكات ، يمكن التخلص منها)فيشر ساينتفيك13-678-20A
    الطرد المركزيالحرارية العلميةSorvall Legend X1R
    NameCompany Catalog NumberComments
    CE-ESI-MS Setup High الجهد
    امدادات الطاقةSpellmanCZE1000Rيمكن التحكم في HVPS عن بعد باستخدام برنامج الجهد المنخفض الذي تم إنشاؤه بواسطة جهاز كمبيوتر شخصي. تحذير: يمثل الجهد العالي خطر حدوث صدمة كهربائية. يجب تأريض جميع الأجزاء الضامة أو حمايتها بعناية لمنع المستخدمين من التعرض العرضي.
    مضخات الحقن (2)جهاز هارفارد704506
    مجهر مجسمAmscopeSM-3BZZمجهر مجسم قادر على التكبير 4.5 مرات ، ومجهز بإضاءة لمراقبة وضع الرش لواجهة CE-ESI.
    مرحلة الترجمة XYZThorlabsPT3
    XYZ مرحلة الترجمةمصممة خصيصاهذه المنصة قادرة على تحميل كميات نانولتر من العينة في الشعيرات الدموية للفصل عن طريق الحقن الهيدروديناميكي وتزويد BGE ل CE. تمكنت كلتا الواجهتين الموصوفتين في هذا العمل من حقن 6 – 10 نانولتر من العينة في غضون 1 دقيقة في فصل 1 متر الفصل قوارير
    عينة من الفولاذ المقاومقارورة
    الفولاذ المقاوم للصدأ BGEشعرية
    (40 وميكرو ؛ م / 105 وميكرو ؛ م معرف / OD ؛ 100 سم)تقنيات PolymicroTSP040105
    السيليكا الشعرية المنصهرة (75 & micro; م / 360 & ميكرو ؛ م معرف / OD ؛ 100 سم)تقنيات PolymicroTSP075375
    باعث من الفولاذ المقاوم للصدأ مع أطراف حادة (130/260 & micro; م ID / OD) شركةهاميلتون21031Aللحصول على أداء أفضل ، قم بشق الليزر وتلميع طرف الباعث بدقة.
    المحاقن (محكمة الغلق للغاز): 500 - 1000 وميكرو ؛ شركة إلهاميلتون1750TTL
    مقياس رقمي متعددFlukeFluke 117
    مطياف كتلة عالي الدقةBruker DaltonicsMaxis Impact HDمطياف كتلة ترادفي عالي الدقة مزود بواجهة ضغط جوي تم تكوينها ل ESI
    خليط ضبط لمعايرة مطياف الكتلةتقنيات AgilentESI-L G1969-85000
    تحليل البيانات الإصدار 4.3 البرمجياتBruker Daltonics
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Anciliary Equipment
    Vacuum concentrator قادر على التشغيل عند 4 & ndash; 10 درجة ؛ CLabconco7310022
    الميزان الجزئي التحليلي (XSE105DU)01911005من فيشر Scientific
    (-20 & deg; ج)فيشر Scientific97-926-1
    فريزر (-80 درجة ؛ ج)فيشر ساينتفيك88300ASP
    حاضنة مبردةفيشر 11475126
    خلاطمعياريBS-VM-1000
    للصدأ BGE مصنوعة حسب الطلب من السيليكا المنصهرة حسب الطلب فريزر علمية دوامة

    المراجع

    1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
    2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
    3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
    4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
    5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
    6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
    7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
    8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
    9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
    10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259(2013).
    11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003(2012).
    12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
    13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012(2017).
    14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
    15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
    16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
    17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
    18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
    19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
    20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
    21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
    22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
    23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
    24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
    25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
    26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
    27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
    28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
    29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
    30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
    31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
    32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
    33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
    34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
    35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
    36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
    37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
    38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
    39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
    40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
    41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
    42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
    43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
    44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
    45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
    46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
    47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
    48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
    49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
    50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
    51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    مقالات ذات صلة