مقالة منهجية

قياس متزامنة من بيروكسيد الهيدروجين فائق أكسيد/وإنتاج NADH Dehydrogenases المتقدرية المحتوية على فلافين

DOI:

10.3791/56975

⸱

فبراير 24, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي الميتوكوندريا على إنزيمات فلافين-تعتمد على عدة يمكن أن تنتج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس). رصد روس الإصدار من المواقع الفردية في الميتوكوندريا صعبة بسبب التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها. نقدم طريقة سهلة وغير مكلفة للتقييم المباشر لأسعار الأصلي للإفراج عن روس باستخدام فلافونزيميس المنقي والميكروسكوبيه فلوروميتري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأفيد أن الميتوكوندريا يمكن أن تحتوي على مصادر الانزيمية يصل إلى 12 للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس). وتشمل أغلبية هذه المواقع مجمعات فلافين-تعتمد على الجهاز التنفسي و dehydrogenases التي تنتج خليط أكسيد فائق (س2●-) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). دقيقة التحديد الكمي لإمكانات إنتاج روس من المواقع الفردية في الميتوكوندريا المعزولة يمكن أن تكون صعبة بسبب وجود أنظمة الدفاع المضادة للأكسدة وردود الفعل الجانبية التي تشكل أيضاس2●-/H2س2. يمكن أن تمس استعمال مثبطات غير محدد يمكن أن تعطل الاستقلاب المتقدرية أيضا قياسات بتغيير الإصدار روس من مواقع أخرى للإنتاج. نقدم هنا، طريقة سهلة لقياس إنتاج نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH) وحاء2يا2 الإفراج المتزامن المنقي dehydrogenases فلافين مرتبطة. لأغراضنا هنا، استخدمنا بيروفات المنقي نازعة مجمع (بدك) و α-كيتوجلوتاراتي نازعة معقدة (كجدهك) من أصل قلب الخنزير كأمثلة. يسمح هذا الأسلوب لمقياس دقيق الأصلية ح2س2 الإفراج عن معدلات من خلال المواقع الفردية للإنتاج عن طريق القضاء على المصادر المحتملة الأخرى لنظم روس ومضادات الأكسدة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يسمح بإجراء مقارنة مباشرة للعلاقة بين حاء2يا2 الإفراج ونشاط إنزيم وفحص فعالية والانتقائية لمثبطات لإنتاج روس. عموما، يمكن أن يسمح هذا النهج للتقييم المتعمق لمعدلات الأصلي للإفراج عن روس للإنزيمات الفردية قبل إجراء تجارب أكثر تطورا مع الميتوكوندريا المعزولة أو الألياف العضلية بيرميبيليزيد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن الهدف النهائي الأيض المغذيات جعل الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). في خلايا الثدييات، وهذا يحدث في الميتوكوندريا، العضيات مزدوجة-ميمبرانيد أن تحويل الطاقة المخزنة في الكربون إلى ATP. ويبدأ إنتاج ATP عندما الكربون كومبوستيد من الميتوكوندريا تشكيل حاملتي الإلكترون NADH وفلافين الأدنين dinucleotide (القوات المسلحة الهايتية2)1. NADH والقوات المسلحة الهايتية2 ثم تتأكسد بالمجمعات الرئوي وحدة فرعية متعددة الأول والثاني، على التوالي، ويجري نقل الإلكترونات المحررة إلى محطة طرفية إلكترون يقبلون الجزيئية الأكسجين (O2) في مجمع الرابع1. [ثرمودنميكلي] مواتي "انحدار" نقل الإلكترونات إلى س2 في نهاية السلسلة يقترن بتصدير البروتونات في إينتيرميمبراني الفضاء بمجمعات الأول والثالث والرابع. يؤدي هذا إلى إنشاء تدرج الكهروكيميائية transmembrane البروتونات (بروتون--دافع القوة)، نموذج مؤقتة من طاقة جيبس الحرة التي يتم استغلالها من قبل الخامس المعقدة جعل ATP2. تفاعلات نقل الإلكترونات في الميتوكوندريا لا تقترن تماما لإنتاج ATP. في نقاط مختلفة في دورة كريبس وسلسلة التنفس، قبل الأوان يمكن أن تتفاعل الإلكترونات مع س2 على شكل روس3. روس الأكثر بيولوجيا ذات الصلة التي تم إنشاؤها بواسطة الميتوكوندريا هي س2●- وح2س2. على الرغم من أن س2●- كثيرا ما يعتبر روس الدانية التي شكلتها الميتوكوندريا، من الواضح الآن أن مواقع الإنتاج تشكل مزيجاً من س2●- وح2س2، الذي يرتبط مع الحر المجموعات الراديكالية كيمياء فلافين الاصطناعية4،5. في المستويات العليا، روس يمكن أن تكون خطيرة، إتلاف المكونات البيولوجية اللازمة لوظيفة الخلية الناتجة في الشدة الأكسدة6. ومع ذلك، تفي بروس المتقدرية عند كميات منخفضة، الوظائف إرسال الإشارات الحيوية. على سبيل المثال، قد تورط حاء2يا2 الإفراج من الميتوكوندريا في السيطرة على تنشيط خلايا تي، إشارات الإجهاد (مثلاً، تنظيم دورات تعريفية لمسارات إشارات Nrf2)، تحريض من تكاثر الخلايا وتمايزها، إشارات الأنسولين والإصدار، وتغذية السلوك7. أحرز تقدم كبير في فهم إشارات مهمة روس. ومع ذلك، هامة لا تزال هناك أسئلة فيما يتعلق بالذي الإنزيمات في الميتوكوندريا بمثابة أهم المصادر وكيفية التحكم في الإنتاج.

الإصدار روس بموقع الإنتاج يعتمد على عدة عوامل: 1) تركز التبرع بالكترون للموقع، 2) حالة الأكسدة الموقع التبرع الإلكترون، 3) الوصول إلى الأكسجين، وتركيز 4) ونوع أكسدة الركازة3، 8 , 9-في الميتوكوندريا، عوامل أخرى مثل تركيز القوة المحتملة NADH والغشاء أيضا التأثير روس إنتاج8،10. على سبيل المثال، يزيد معدل س2●-/H2س2 إنتاج المنقي بدك أو كجدهك مع تزايد NADH توافر5،11. في هذا السيناريو، تتدفق الإلكترونات إلى الوراء من NADH إلى مركز المؤسسة في وحدة فرعية3 ه بدك أو كجدهك، الموقع لس2●-/H2س2 إنتاج12. وبالمثل، قد توفير نادٍ+ تأثير معاكس، تتناقص روس الإصدار من كجدهك12. وهكذا، يمكن أن يغير المسيطر من الدخول أو الخروج من الإلكترونات من مواقع الإنتاج روس تتشكلكم س2●-/H2س2 . على سبيل المثال، حظر فرعية2 ه من بدك أو كجدهك مع مؤشر أسعار المستهلك-613، حمض ليبويك تناظرية، ينتج تقريبا 90% انخفاض في س2●-/H2س2 إنتاج13. يمكن الحصول على نتائج مماثلة مع المواد الكيميائية S-جلوتاثيونيليشن المواد الحفازة ودياميدي وديسولفيرام، التي تلغي تقريبا س2●/H2س2 إنتاج بدك أو كجدهك عن طريق تصريف الجلوتاثيون ه 2 وحدة فرعية14. المفاضلة لعرقلة تدفق الإلكترون عن طريق فرعية2 ه بدك وكجدهك هو انخفاض في إنتاج NADH مما يقلل تكوين روس بسلسلة نقل الإلكترون (مثلاً، ثالثا المعقدة). هذا أيضا تقليل إنتاج ATP بسلسلة نقل الإلكترون. عموما، يمكن حظر دخول إلكترون إلى مواقع الإنتاج روس وسيلة فعالة للغاية لمراقبة س2●/H2يا2 الإنتاج.

يمكن أن تحتوي الميتوكوندرياتصل إلى 12 المحتملة س2●-/H2س2 مصادر6. معظم هذه المواقع المحتوية على فلافين الإنزيمات التي تولد مزيجاً من س2●- وح2س2. وقد يسمح باستخدام الركيزة مختلفة وتركيبات المانع لتحديد منها مجمعات الجهاز التنفسي و dehydrogenases المتقدرية بمثابةعالية السعة س2●-/H2س2 تشكيل مواقع في 3من أنسجة مختلفة. قد ثبت بمثابة عالية السعةس2●-/H2س2 المواقع التي ينبعث منها قدر في العضلات والكبد الميتوكوندريا13،15بدك وكجدهك. ومع ذلك، تبقى بعض الصعوبات فيما يتعلق بالنظر في س2●-/H2س2 تشكيل المحتملة من المواقع الفردية في الميتوكوندريا، والأثر أن الركازة مختلفة وتركيبات مثبط على أنشطة الإنزيمات. هذا هو سبب وجود تفاعلات جانبية غير مرغوب فيها (مثلاً، تشكيلس2●-/H2س2 بالمواقع عدا الإنزيم للفائدة)، تلويث المواد الغذائية المحلية (مثلاً،الدهنية الأحماض) أو العضيات (مثل، بيروكسيسوميس التي تشكل أيضاس2●-/H2س2)، واستخدام الموانع التي تفتقر إلى الانتقائية، و/أو استخدام المركبات التي تحول دون إنتاج روس ليس كاملا. يمكن أيضا تغيير بعض مثبطات الاستقلاب mitochondrial واتجاه تدفق الإلكترونات، وهذا يغير الإصدار روس من مواقع أخرى للإنتاج ويفند النتائج. معدلات المطلقة س2●-/H2يا2 الإفراج عن المواقع الفردية في الميتوكوندريا أيضا يصعب قياسها كمياً بسبب ارتفاع تركيز O2●- وح2س2 القضاء على الإنزيمات في الفضاء intermembrane ومصفوفة. ولذلك، يمكن القضاء على أي ردود الفعل المتضاربة التي يمكن أن تتداخل مع2س●-/H2يا2 الإفراج عن قياسات مفيدة عند تحديد سعة عالية س2●-/H2س2 تشكيل مواقع.

نقدم هنا، أسلوب بسيط يسمح للنظر المتزامن في س2●/H2س2 إنتاج وتكوين NADH بتنقية فلافين-تعتمد على ديهيدروجيناسيس. باستخدام الإنزيمات النقية، روس تشكيل ردود الفعل الجانبية غير المرغوب فيها وروس اللاإنسانية الإنزيمات يمكن القضاء على السماح لتدبير أكثر دقة من الأم س2●-/H2س2 معدلات الإنتاج للفرد فلافونزيميس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مباشرة س2●-/H2س2 تشكيل قدرة dehydrogenases المنقي مختلفة أو مثبطات الشاشة الخاصة بالموقع المحتمل س2●-/H2س الإصدار 2 . وأخيراً، قياسس2●-/H2يا2 والإنتاج NADH في وقت واحد يمكن أن تسمح لإجراء تقييم في الوقت الحقيقي للعلاقة بين نشاط الإنزيم وروس الإفراج عن القدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-المواد الكيميائية وتنقية الإنزيمات

  1. شراء المواد التالية: بدك وكجدهك الأصل قلب الخنزير (أو آخر المنقي فلافونزيمي الميتوكوندريا)؛ ح2س2 (محلول 30%)، بيروفات، α-كيتوجلوتاراتي NAD+، NADH، كوش، بيروفوسفات الثيامين (TPP)، المانيتول، حبيس، السكروز، عطا، 3-الميثيل-2-أوكسو حمض فاليريك (كمف)، دسموتاز الفاءق (الأحمق)، الفجل البيروكسيديز (HRP)، 10-أسيتيل-3.7-ديهيدروكسيفينوكسازيني كاشف (أور)، ومؤشر سعر المستهلك-613.

2-التخطيط للتحليل وإعداد كاشف

  1. إعداد المقايسة وفقا الجدول 1 في لوحة 96-جيدا.
    ملاحظة: الحجم الإجمالي لكل رد فعل 200 الأسهم تركيزات ميليلتر. يتم ضبط مثل أن يتم إضافة 20 ميليلتر من كاشف لكل بئر. وهذا ما يضمن إضافة العوامل المساعدة وركائز لكل رد فعل جيدا قبل البدء الفحص السريع.
  2. إعداد رد فعل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 220 مم المانيتول، السكروز 70 ملم، 1 عطا، و 20 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4 مع HCl).
    ملاحظة: هذا يمكن أن تتغير تبعاً للخصائص الفيزيائية للإنزيمات المنقي مختلفة.
  3. دراسة المنقي كجدهك أو بدك للتلوث باستخدام إنزيم نشاط فحوصات14،،من1617 أو إيمونوبلوت أو أخذ وصمة عار5.
  4. تحضير جميع المواد الكاشفة في المخزن المؤقت لرد الفعل وفقا للعامل وتركيزات الحل في الجدول 1.
  5. تخزين جميع المواد الكاشفة كمختبرين 1 مل في-20 درجة مئوية. تخزين بيروفات و α-كيتوجلوتاراتي في-80 درجة مئوية في مختبرين 100 ميليلتر لمنع تدهور العفوية بسبب السيارات الأكسدة وتجميد أذاب المتكررة.
  6. تحضير الكاشف أور الأسهم الرئيسية في 1 مل من [دمس] وتمييع ثم إلى 100 ميكرومتر في رد فعل المخزن المؤقت. مخزن محمية من الضوء.
    ملاحظة: هنا، الحل العامل 100 ميكرومتر طازجة كل 2 إلى 3 أسابيع، ومحمية من الضوء.

3-إعداد القالب بالانزيم

  1. قم بإعداد إجراءات الفحص على قارئ ميكروسكوبية أحادية اللون مع قدرات القياس المزدوج.
  2. قم بتعريف الإجراء القراءة عن طريق تحديد "بروتوكول". ثم انقر فوق "إجراء".
  3. تعيين "درجة الحرارة" إلى 25 درجة مئوية (الشكل 1A).
  4. انقر فوق "بدء تشغيل الحركية" لتعيين شروط القراءة (الشكل 1A). تعيين الوقت وعدد فترات القراءة/التجارب.
  5. انقر فوق "قراءة" (الشكل 1B).
    ملاحظة: يتم قراءة عينات من موقف الأعلى مع مكسب 50. الوقت: 5 دقائق، قراءة في فترات 30-s. قناة 1: ريسوروفين fluorescence-الإثارة/الانبعاثات = 565 nm:600 نانومتر، الطول الموجي عرض 13.5 نانومتر. قناة 2: NADH أوتوفلوريسسينسي-الإثارة/الانبعاثات = 376 nm:450 نانومتر، عرض 20 الطول الموجي نانومتر.
  6. تحت "القراءة"، حدد آبار لمراقبة (مثلاً، A1-A4 و B1 B4).
  7. حدد "إنهاء الحركية".

4-معيار المنحنيات

  1. ذوبان الجليد في الكواشف وتخزينها على الجليد حتى حاجة.
  2. NADH المنحنى المعياري (الشكل 2A)
    1. إعداد الحلول العامل ل NADH بتركيز يتراوح بين 0.5-10 مم في رد فعل المخزن المؤقت.
    2. إضافة 20 ميليلتر مختبرين من NADH كل العمل تركيز الحل إلى الآبار التي تحتوي على ميليلتر 180 رد فعل المخزن المؤقت. كذلك هو تركيز NADH النهائي في كل 0.05-1 ملم.
    3. انقر فوق "قراءة" وتعيين الإثارة/الانبعاثات = 376 nm:450 نانومتر، عرض 20 الطول الموجي نانومتر.
      ملاحظة: هذا نقطة نهاية للقراءة فقط--معلمات الحركية غير مطلوبة.
  3. أور المنحنى المعياري (الشكل 2)
    1. إعداد الأرصدة العامل من بيروكسيد الهيدروجين في رد فعل المخزن المؤقت؛ الأسهم تركيزات تتراوح بين 200-4,000 شمال البحر الأبيض المتوسط.
    2. إضافة 120 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت لكل بئر.
    3. إضافة 20 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية (العامل تركيز المخزون = 30 U/mL، التركيز النهائي في البئر = 3 U/mL)، 20 ميليلتر من الهيئة العامة للسدود (العامل تركيز المخزون = 250 U/mL، التركيز النهائي في البئر = 25 يو/مليلتر)، و 20 ميليلتر من أور (العامل تركيز المخزون = 100 ميكرومتر ، التركيز النهائي في البئر = 10 ميكرون) لكل المخزن المؤقت رد الفعل الذي يتضمن أيضا.
    4. إضافة 20 ميليلتر لكل2س ح2 يعمل حل الأسهم لكل جيد يحتوي على الكواشف المخزن المؤقت والمقايسة. حجم رد الفعل النهائي هو 200 ميليلتر وتركيز النهائي ح2س2 في كل بئر 20-400 نانومتر.
    5. احتضان لوحات لمدة 1 دقيقة في قارئ لوحة عند 25 درجة مئوية.
    6. انقر فوق "قراءة" وتعيين الإثارة/الانبعاثات = 565 نيوتن متر/600 نانومتر، الطول الموجي عرض 13.5 نانومتر. لاحظ أن هذه نقطة نهاية للقراءة فقط--معلمات الحركية غير مطلوبة.

5-قياس س2● /H2 يا2 الإفراج وإنتاج NADH كجدهك وبدك

  1. انظر الجدول 1 للنظام لإضافة الكواشف المختلفة، تركيز كل حل عملي، والحجم المضافة لكل بئر.
  2. إضافة 40 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت لكل بئر. لفحوصات باستخدام كمف أو مؤشر أسعار المستهلك-613، إضافة 20 ميليلتر من المخزن المؤقت لكل بئر.
  3. إضافة 20 ميليلتر من بدك أو كجدهك (الأسهم العامل 1 يو/مل، التركيز النهائي للبئر الواحد = 0.1 U/mL) لكل بئر.
  4. احتضان بدك وكجدهك عند 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  5. إضافة 20 ميليلتر من كمف (الأسهم العامل = 100 مم، تركيز النهائية = 10 ملم) أو 20 ميليلتر من مؤشر أسعار المستهلك-613 (العامل تركيز المخزون = 1.5 ملم، التركيز النهائي = 150 ميكرون) (الجدول 2).
    ملاحظة: يمكن استبعاد هذه الخطوة إذا لم تستخدم مثبطات لفحوصات.
  6. احتضان لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استبعاد هذه الخطوة إذا لم تستخدم مثبطات لفحوصات.
  7. إضافة 20 ميليلتر من برنامج الصحة الإنجابية (العامل تركيز المخزون = 30 وحدة/مل، التركيز النهائي في البئر = 3 وحدات/مل) و 20 ميليلتر من الهيئة العامة للسدود (العامل تركيز المخزون = 250 وحدة/مل، التركيز النهائي في البئر = 25 وحدة/مل) لكل بئر.
  8. إضافة 20 ميليلتر لأنزيم (العامل تركيز المخزون = 1 مم، التركيز النهائي = مم 0.1)، 20 ميليلتر لبرنامج النقاط التجارية (العامل تركيز المخزون = 3 مم، التركيز النهائي = 0.3 مم)، و 20 ميليلتر لند+ (يعمل تركيز المخزون = 10 مم، التركيز النهائي = 1 مم) لكل ث خبرني.
  9. إزالة الكاشف أور من تغطية واقية ورق ألمونيوم وإضافة 20 ميليلتر لكل بئر.
  10. إضافة 20 ميليلتر من بيروفات (العامل المخزون تركيز تتراوح بين 1-100 مم، التركيز النهائي لفحوصات = مم 0.1-10) إلى الآبار التي تحتوي على بدك و α-كيتوجلوتاراتي (العامل المخزون تركيز تتراوح بين 1-100 مم، التركيز النهائي لفحوصات = 0.1-10 مم) إلى الآبار التي تحتوي على كجدهك.
  11. انقر فوق "قراءة" لبدء القياس الحركية.

6-بيانات التحليل

  1. اضغط باستمرار على زر 'CTRL' على لوحة المفاتيح وانقر فوق الآبار لإنشاء رسم بياني واحد يحتوي على جميع القياسات الحركية المقابلة للقناة 1 (الشكل 3A).
  2. انقر فوق "بيانات" في طريقة عرض الرمز في الركن الأيمن العلوي للقيم الخام للأسفار النسبية وحدات (رفو) تقاس في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 3B).
  3. تصدير القيم للتحليل (الجدول 3).
  4. انقر فوق "الرسم البياني" المنسدلة القائمة في أعلى اليمين (الشكل 3B) الوصول إلى قيم رفو المرتبطة بقناة الأسفار 2.
  5. كرر الخطوات من 6، 1 إلى 6.3 للقناة الثانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الشكل 3A تتبع ممثل رفو جمعتها كجدهك المنقي أثناء أخذ القياس المتزامن حاء2يا2 والإنتاج NADH. ويرد في الشكل 3Bرفو البيانات الخام لكل الفاصل الزمني. ثم يتم تصدير البيانات رفو الأولية للتحليل. باستقراء من المنحنيات القياسية المعروضة في الشكل 2، يمكن تحديد المبلغ المطلق من NADH و H2O2 شكلت في كل فاصل زمني للقياس على مدى فترة 5-دقيقة. ويرد مثال على هذا الحسا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول مفيد منذ، 1) فإنه يلغي أي ردود الفعل المتضاربة التي قد تتداخل مع الكشف عن ح2س2 (مثلاً، والنظم المضادة للأكسدة أو مصادر أخرى لروس)، وإلا 2) يقدم تقييما مباشرا لمعدل أصلي إطلاق سراح روس من نازعة المتقدرية المحتوية على فلافين، مع 3) يسمح المقارنة بين الأم روس الإفراج عن معدلات اثنين أو أكثر تنقية المستندة إلى فلافين dehydrogenases, 4) يمكن أن تسمح بإجراء مقارنة مباشرة لمعدل النشاط الصحفي وإنزيم روس، و 5) يسمح فحص مثبطات انتقائية تنافسية للإفراج عن روس. مجموعتنا وغيرها قد استخدمت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد شيء للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). إنتاج الفيديو أجريت بالتعاون مع مركز الابتكار في التدريس والتعلم (المعاملات) في "جامعة ميموريال في نيوفاوندلاند".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مركب نازعة هيدروجين البيروفاتSIGMAP7032-10UN
مركب نازعة هيدروجين ألفاSIGMAK1502-20UNمنقى إنزيم فلافو
30٪ محلول بيروكسيد الهيدروجينكاشف SIGMAHX0640-5، منحنيات قياسية
NAD +SIGMAN0632-1Gكاشف ، مقايسة
إطلاق النشاط / ROSكاشف NADHSIGMAN4505-100MGالمنحنيات القياسية
البيروفاتSIGMAP2256-5G، مقايسة إصدار النشاط / ROS
ألفا كيتوجلوتاراتSIGMA75892-25Gكاشف ، مقايسة إطلاق النشاط / ROS
CoASHSIGMAC3019-25MG، مقايسة إطلاق النشاط / ROS
الثيامين بيروفوسفاتSIGMAC8754-1Gالكاشف ، مقايسة إصدار النشاط / ROS
مانيتولSIGMAM4125-100Gمكون العازلة
HepesSIGMAH3375-25Gمكون العازلة
السكروزSIGMAS7903-250Gمكون العازلة
EGTASIGMAE3889-10Gمكون العازلة
KMVSIGMA198978-5Gكاشف ، مثبط إطلاق ROS
CPI-613سانتا كروزكاشف sc-482709، كاشف مثبط إطلاق
ROS SODSIGMAS9697-15KU، كاشف كشف إطلاق
ROS بيروكسيداز الفجل الحارSIGMAP8375-1KU، كشف إطلاق ROS
Amplex Ultra RedThermofisherA36006، كشف إطلاق ROS
قارئ صفيحة دقيقة Biotech Synergy 2BioTek Instrumentsقارئ الألواح الدقيقة لبرامج الفحوصات
Gen5BioTek Instruments، المستخدم لجمع برامج RFU
Graphpad PrismGraphpadالخام ، تحليل البيانات
Microsoft EXCEL، Microsoft، تحليل البيانات
كيتوجلوتارات المنقى ، كاشف كواشفكاشف برنامج ، برامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
  2. Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
  3. Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
  4. Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
  5. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  6. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
  7. Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
  8. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
  9. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
  10. Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
  11. Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
  12. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
  13. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  14. O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
  15. Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
  16. Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
  17. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  18. Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
  19. Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
  20. Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
  21. Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
  22. Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
  23. Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Amplex Ultrared NADH

مقالات ذات صلة