Method Article

إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

DOI:

10.3791/56981

⸱

October 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health Sciences, Università del Piemonte Orientale & IRCAD, Novara, Italy, 2Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Segrate, Milan, Italy, 3Institute of Biomedical Technologies, National Research Council, Bari, Italy, 4Department of Life Sciences, University of Trieste, Italy, 5Institute of Genetic and Biomedical Research, National Research Council, Rozzano, Milan, Italy, 6Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milan, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح البروتوكولات وصف البناء والتوصيف والتحديد (مقابل الهدف المفضل) من مكتبة "دوماينومي" من أي مصدر الحمض النووي. يتحقق ذلك من خلال خط أنابيب بحث الذي يجمع بين التكنولوجيات المختلفة: عرض بالعاثية، مراسل للطي وتسلسل الجيل القادم مع أداة ويب لتحليل البيانات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصحفيين للطي هي بروتينات مع تعمل يمكن تحديدها بسهولة، مثل مقاومة المضادات الحيوية، الذي قابلة للطي والدالة للخطر عندما تنصهر فيها سيئة لطي البروتينات أو إطارات عشوائية القراءة المفتوحة. قمنا بتطوير استراتيجية فيها، باستخدام ال-1 β-lactamase (الإنزيم منح المقاومة الأمبيسلّين) على نطاق الجينوم، علينا تحديد مجموعات من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح من ترميز جزء من الحمض النووي لأي الجينوم إينترونلس. سوف تكون الشظايا البروتين التي حصل عليها هذا النهج، ما يسمى "دومينومي"، كذلك أعرب عنه وقابل للذوبان، يجعلها مناسبة للدراسات الهيكلية/الوظيفية.

عن طريق الاستنساخ، وعرض "دوماينومي" مباشرة في نظام عرض بالعاثية، لقد أظهرنا أنه من الممكن لتحديد مجالات محددة من البروتين مع خصائص الربط المطلوبة (مثلاً، إلى غيرها من البروتينات أو الأجسام المضادة)، وبالتالي توفير أساسي المعلومات التجريبية لتحديد الجينات الشرح أو مستضد.

يمكن تحديد المستنسخين المخصب الأكثر في عدد سكان [بولكلونل] محدد باستخدام تقنيات رواية الجيل التالي التسلسل (خ ع). لهذه الأسباب، فنحن نقدم تحليل تسلسل عميق المكتبة نفسها والنواتج التحديد تقديم معلومات كاملة عن التنوع والوفرة ورسم خرائط دقيقة لكل من الجزء المحدد. وتظهر البروتوكولات المقدمة هنا الخطوات الرئيسية لبناء المكتبة، وتوصيف، والتحقق من الصحة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للبناء واختيار المكتبات من نطاقات البروتين مطوية وقابل للذوبان من أي مصدر انطلاق الجينية/الجينوم. النهج الذي يجمع بين ثلاث تقنيات مختلفة: عرض بالعاثية، واستخدام مراسل قابلة للطي وتسلسل الجيل القادم (خ ع) مع أداة ويب محددة لتحليل البيانات. الأساليب التي يمكن استخدامها في العديد من السياقات المختلفة للبحث القائم على البروتين، لتحديد الهوية والشرح من البروتينات/البروتين من المجالات الجديدة، وتوصيف الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتينات المعروفة، فضلا عن تعريف شبكة التفاعل البروتين.

العديد من الأسئلة المفتوحة لا تزال موجودة في البحوث القائمة على البروتين وتطوير أساليب لإنتاج البروتين الأمثل ضرورة هامة لعدة مجالات للتحقيق. على سبيل المثال، على الرغم من توافر الآلاف من مورثات بدائية وحقيقية النواة1، خريطة مقابلة من بروتيوميس النسبية مع تعليق توضيحي مباشرة من الببتيدات والبروتينات المكوده مازال مفقوداً للغالبية العظمى من الكائنات الحية. فهرس بروتيوميس كاملة يبرز بوصفه هدفا صعبة التي تتطلب جهدا ضخما من حيث الوقت والموارد. يبقى المعيار الذهبي للشرح التجريبية استنساخ جميع "المفتوحة قراءة الإطارات" (Orf) الجينوم، بناء ما يسمى "أورفيومي". عادة ما يتم تعيين وظيفة الجينات استناداً إلى التماثل للجينات المتصلة النشاط المعروفة ولكن هذا النهج دقيقة ضعيفة بسبب وجود العديد من الشروح غير صحيحة في مرجع قواعد البيانات2،،من34، 5. وعلاوة على ذلك، حتى بالنسبة للبروتينات التي تم تحديدها والمشروح، دراسات إضافية مطلوبة لتحقيق الوصف من حيث الوفرة، وأنماط التعبير في السياقات المختلفة، بما في ذلك الخصائص الهيكلية والوظيفية، وكذلك شبكات التفاعل.

وعلاوة على ذلك، نظراً للبروتينات تتألف من نطاقات مختلفة، كل منها عرض ميزات محددة، والإسهام بشكل مختلف وظائف البروتين، الدراسة والتعريف الدقيق لهذه المجالات يمكن أن تسمح صورة أكثر شمولاً، كلاهما في الواحد الجينات والجينوم الكامل على الصعيد. كل هذه المعلومات ضرورية يجعل البحث القائم على البروتين حقلاً واسعاً وتحديا.

من هذا المنظور، يمكن إعطاء مساهمة هامة بأساليب غير متحيزة والفائق لإنتاج البروتين. بيد أن نجاح هذا النهج، إلى جانب الاستثمارات الكبيرة المطلوبة، يعتمد على القدرة على إنتاج البروتين للذوبان/مستقرة بنيات. وهذا يشكل الحد من عامل نظراً لأنها قدرت أن فقط حوالي 30% بروتينات يمكن أن أعرب بنجاح وأنتجت على مستويات كافية لتكون مفيدة تجريبيا6،،من78. ويستند نهج للتغلب على هذا القيد استخدام الحمض النووي مجزأة عشوائياً لإنتاج البروتينية المختلفة، التي توفر معا متداخلة تمثيل جزء من الجينات الفردية. نسبة صغيرة فقط من أجزاء الحمض النووي تم إنشاؤه عشوائياً هي Orf الفنية بينما الغالبية العظمى منهم غير وظيفية (بسبب وجود stop codons داخل تسلسل بهم) أو ترميز للأمم المتحدة الطبيعية (ORF في إطار خلاف الأصلي) البروتينية مع لا معنى البيولوجية.

لمعالجة جميع هذه القضايا، وضعت مجموعتنا بروتين الفائق التعبير والتفاعل تحليل منصة التي يمكن استخدامها على نطاق الجينوم9،10،،من1112. هذا البرنامج يدمج التقنيات التالية: 1) طريقة تحديد مجموعات من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح من ترميز جزء من الحمض النووي من أي كائن حي؛ 2) بالعاثية عرض التكنولوجيا لتحديد شركاء تفاعلات؛ 3 خ ع) تماما تميز إينتيراكتومي كلها قيد الدراسة وتحديد المستنسخين الاهتمام؛ و 4) أداة ويب لتحليل البيانات للمستخدمين دون الحاجة إلى مهارات البرمجة أو المعلوماتية الحيوية لإجراء تحليل Seq إينتيراكتومي بطريقة سهلة وسهلة الاستعمال.

استخدام هذا البرنامج يوفر مزايا هامة أكثر استراتيجيات بديلة للتحقيق؛ قبل كل شيء الأسلوب تماما غير متحيزة والفائق، ووحدات للدراسة تتراوح بين مورثة واحدة تصل إلى جينوم كله. الخطوة الأولى من خط الأنابيب هو إنشاء مكتبة من الحمض النووي عشوائياً مجزأة تحت الدراسة، ثم تميزت خ ع عميق. يتم إنشاء هذه المكتبة باستخدام المتجهات هندسيا حيث يتم استنساخ الجينات/شظايا اهتمام بين تسلسل إشارة لإفراز البروتين في الفضاء بيريبلاسميك (أي، زعيم ثانية) والجين β-lactamase TEM1. سوف تمنح البروتين الانصهار الأمبيسلّين المقاومة والقدرة على البقاء على قيد الحياة تحت ضغط الأمبيسلّين إلا إذا كانت الشظايا المستنسخة في الإطار مع كل من هذه العناصر والبروتين الانصهار الناتج هو مطوية بشكل صحيح10،13 ،14. جميع النسخ إنقاذهم بعد اختيار المضادات الحيوية، ما يسمى "استنساخ تصفيته"، Orf، وغالبية العظمى منهم (أكثر من 80 في المائة)، مستمدة من الجينات الحقيقية9. علاوة على ذلك، تكمن قوة هذه الاستراتيجية في النتائج أن جميع الحيوانات المستنسخة ORF تصفيتها يتم ترميز للبروتينات بشكل صحيح مطوية/الذوبان/المجالات15. كما لدى الكثير من استنساخ، موجودة في المكتبة ورسم الخرائط ذات الصلة في نفس المنطقة/المجال، مختلفة في البداية والنهاية نقطة، يسمح هذا تحديد غير منحازة، وخطوة واحدة من الشظايا الدنيا التي من المحتمل أن يؤدي إلى منتجات قابلة للذوبان.

ويرد مزيد من تحسن في التكنولوجيا باستخدام خ ع تميز المكتبة. المزيج من هذه المنصة، وأداة ويب محددة لتحليل البيانات يعطي معلومات هامة غير منحازة على تسلسل النوكليوتيدات الدقيق وعلى موقع Orf المحدد على مرجع الحمض النووي قيد الدراسة دون الحاجة إلى المزيد من التحليلات الواسعة أو الجهد التجريبي.

ويمكن نقلها في سياق تحديد مكتبات دومينومي وتستخدم كأداة عالمية لإجراء الدراسات الفنية. البروتين الفائق التعبير والتفاعل تحليل المنهاج أن نحن متكاملة وأن طالبنا Seq إينتيراكتومي يستفيد من تكنولوجيا العرض بالعاثية بتحويل ORF المصفاة إلى ناقل فاجيميد وخلق بالعاثية-ORF مكتبة. إعادة استنساخ مرة واحدة في سياق عرض بالعاثية، بروتين مجالات يتم عرضها على سطح جسيمات M13؛ وبهذه الطريقة يمكن تحديد مكتبات دومينومي مباشرة للشظايا الجينات ترميز المجالات مع الأنشطة الانزيمية محددة أو ربط خصائص، يسمح للشبكات إينتيراكتومي التنميط. وقد وصف هذا النهج في البداية زاكتشي et al. 16 واستخدمت فيما بعد في عدة أخرى السياق13،،من1718.

بالمقارنة مع غيرها من التكنولوجيات المستخدمة لدراسة التفاعل البروتين-بروتين (بما في ذلك نظام هجين اثنين الخميرة والطيف الكتلي19،20)، ميزة رئيسية واحدة هي التضخيم الشريك الملزم الذي يحدث أثناء بالعاثية عرض جولات متعددة من التحديد. وهذا يزيد من حساسية الاختيار مما يسمح بتحديد المجالات ملزم وفيرة منخفضة البروتينات الموجودة في المكتبة. هو زيادة كفاءة اختيار المنفذ مع ارف تصفية مكتبة بسبب غياب استنساخ غير وظيفية. أخيرا، تسمح هذه التقنية التحديد التي يتعين القيام بها ضد كل من البروتين والبروتين غير الطعم21،،من2223،24،25.

بالعاثية التحديدات باستخدام مكتبة دومينومي-بالعاثية يمكن أن يؤديها باستخدام الأجسام المضادة قادمة من الأمصال للمرضى الذين يعانون من الحالات المرضية المختلفة، مثل أمراض المناعة الذاتية13أو السرطان أو العدوى من الأمراض كطعم. يتم استخدام هذا النهج للحصول على ما يسمى "جسم التوقيع" هذا المرض قيد الدراسة مما يسمح على نطاق واسع في تحديد وتوصيف المستضدات/[ابيتوبس] تعترف على وجه التحديد بأجسام المرضى في نفس الوقت. مقارنة بالأساليب الأخرى الاستخدام بالعاثية يسمح العرض تحديد [ابيتوبس] مستضدي الخطي وكونفورماشونال على حد سواء. تحديد توقيع محدد يمكن أن يكون لها تأثير هام لفهم الآلية المرضية، وتصميم لقاح جديد، تحديد أهداف علاجية جديدة واستحداث أدوات تشخيصية وتشخيصية جديدة ومحددة. وعلاوة على ذلك، عند الدراسة تركز على الأمراض المعدية، ميزة كبيرة أن اكتشاف البروتينات مكسبه ومستقلة عن زراعة الممرض.

نهجنا ويؤكد أن الصحفيين قابلة للطي يمكن استخدامها على نطاق الجينوم لتحديد "دومينومي": عبارة عن مجموعة من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح، وكذلك أعرب، القابلة للذوبان من ترميز جزء من الحمض النووي و/أو كدنا من أي كائن حي. مرة معزولة شظايا البروتين مفيدة لأغراض كثيرة، توفير معلومات تجريبية أساسية للشرح الجينات، وكذلك فيما يتعلق بالدراسات الهيكلية، جسم حانمه رسم الخرائط، مستضد تحديد الهوية، إلخ. اكتمال البيانات الفائق المقدمة من خ ع يتيح تحليل العينات معقدة للغاية، مثل بالعاثية عرض المكتبات، ويحمل إمكانات للتحايل على الانتقاء شاقة التقليدية واختبار فردية بالعاثية إنقاذ الحيوانات المستنسخة.

في الوقت نفسه بفضل ميزات المكتبة التي تمت تصفيتها والحساسية المفرطة والقوة لتحليل خ ع، فمن الممكن لتحديد المجال البروتين مسؤولة كل التفاعل مباشرة شاشة أولى، دون الحاجة إلى إنشاء مكتبات إضافية لكل ملزمة البروتين. خ ع يتيح الحصول على تعريف شامل دومينومي كله من أي مصدر انطلاق الجينية/الجينوم وأداة ويب تحليل البيانات يمكن الحصول على توصيف محددة للغاية كلا من نوعية وكمية من وجهة نظر المجالات للبروتينات إينتيراكتومي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-بناء المكتبة ORF (الشكل 1)

  1. إعداد إدراج الحمض النووي
    1. إعداد شظايا من الحمض النووي التركيبية أو الجينوم
      1. استخراج/تنقية الحمض النووي باستخدام الأساليب القياسية26.
      2. تفتيت الحمض النووي قبل sonication. إذا كان استخدام سونيكاتور قياسية، كبداية اقتراح عام مع البقول s 30 في 100% إنتاج الطاقة.
        ملاحظة: تجارب رائدة، وينبغي أن يتم مع طاقة مختلفة وأوقات سونيكيشن لتعيين الشروط المثلى لإعداد الحمض النووي. بعد كل اختبار تحديد حجم الشظايا من الحمض النووي من [اغروس] هلام التفريد.
      3. تحميل الحمض النووي سونيكاتيد على 1.5% [اغروس] هلام، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي bp 100. إجراء التفريد قصيرة تشغيل الساعة 5 الخامس/سم لمدة 15 دقيقة وقطع جزء جل يحتوي على اللطاخة من الحمض النووي مجزأة.
      4. تنقية الحمض النووي إدراج مع مجموعة أدوات استخراج هلام المستندة إلى عمود وقياس تركيز استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية.
        ملاحظة: على الأقل 500 نانوغرام إدراج المنقي ينبغي الحصول عليها بعد هذه الخطوة، لتكون متصلة مع 1 ميكروغرام من ناقلات هضمها، كما هو موضح في الخطوة 1، 3. التحقق من جودة لإعداد الأجزاء عن طريق تقييم &/A260nm280nm ونسب230nm &/A260nmنظراً لتدني نوعية العينة سوف تؤثر على كفاءة عملية ربط.
      5. علاج تصل إلى 5 ميكروغرام من إدراج مع 1 ميكروليتر من هذا المزيج إنزيم "السريع طقم المعقولة"، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إلغاء تنشيط الإنزيمات بتدفئة في 70 درجة مئوية ليمكن تخزينها كحد أدنى 10 عينات في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. إعداد الشظايا من كدنا
      1. استخراج الحمض النووي الريبي بالأساليب القياسية (مثل استخدام تريزول أو الكواشف مماثلة).
      2. جزء مرناً بتدفئة قبل إجراء النسخ العكسي. ويسيطر طول جزء الحمض النووي نهائياً وقت الغليان مرناً وتركيز التمهيدي عشوائي. على سبيل المثال، الحرارة في العينة لمدة 6 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
      3. إعداد كدنا استخدام كبسولة تفجير عشوائية مع أي مواد متاحة بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      4. تستنفد كدنا ذيول بولي-dT بالتهجين مع بيوتينيلاتيد بولي--دا ح 3 في 37 درجة مئوية، ومنفصلين في ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز كما هو موضح من كارنينسي et al. 13
      5. استرجاع المواد غير منضم وتنقية مع مجموعة تنقية الحمض النووي القائم على عمود اتباع إرشادات الشركة المصنعة. قياس تركيز استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية. راجع الملاحظة في الخطوة 1.1.1.4.
  2. إعداد ناقلات التصفية
    1. خلاصة 5 ميكروغرام لاستنساخ المنقي ناقل pFILTER312 مع 10 إنزيم التقييد "يو اكورف"، البروتوكول الشركة المصنعة التالية.
    2. تحميل 2 ميليلتر (200 نانوغرام) ناقل هضمها، جنبا إلى جنب مع 100 نانوغرام من ناقلات عسر الهضم و 1 ك bp الواسمات الجزيئية، على 1% [اغروس] هلام، للتحقق من الهضم السليم. الحرارة إلغاء تنشيط إنزيم التقييد.
    3. إضافة إلى حجم 1/10 من 10 x الفوسفاتيز المخزن المؤقت و 1 ميليلتر (5 U) من الفوسفاتيز واحتضان في 37 درجة مئوية لإلغاء تنشيط 15 دقيقة الحرارة لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية.
    4. تنقية بلازميد هضمها بالاستخراج من [اغروس] هلام، وقياس تركيز استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. ربط وتحويل
    1. إجراء عملية ربط كما يلي: 1 ميكروغرام من بلازميد هضمها إضافة 400 نانوغرام إدراج فوسفوريلاتيد (بلازميد: إدراج المولى نسبة 1:5)، 10 ميليلتر من 10 x المخزن المؤقت ل T4 الحمض النووي ليجاسى، 2 ميليلتر من ليجاسى الحمض النووي T4 عالية التركيز في حجم نهائي 100 ميليلتر. احتضان رد فعل في أوفيرني 16 درجة مئوية مين. إلغاء تنشيط الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. يعجل عملية ربط المنتج بإضافة المجلد 1/10 من حل خلات الصوديوم (م 3، 5.2 درجة الحموضة) وحجم 2.5 من الإيثانول 100%. خلط وتجميد في-80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    4. إضافة 500 ميليلتر من البرد 70% إيثانول بيليه وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    5. الهواء الجاف بيليه. ريسوسبيند الحمض النووي سرع في 10 ميليلتر من الماء.
    6. أداء انهانسر الخلايا البكتيرية.
      ملاحظة: استخدام الخلايا ذات الكفاءة العالية (فوق 5 × 109 ترانسفورمانتس كل ميكروغرام للحمض النووي) مطلوب. ونحن نقترح استخدام الإشريكيّة القولونية DH5αF '(و'/endA1 hsd17 (− ر mK +) supE44 ثي 1recA1 غيرا (نالر) relA1 دير U169 (لاكزيا-أرجف) (F80dlacD-(lacZ)M15) المنتجة في المنزل أو تم شراؤها من العديد من الشركات المصنعة.
      1. ضع العدد المناسب من الأنابيب ميكروسينتريفوجي و 0.1 سم انهانسر الترعة على الجليد. إضافة 1 ميليلتر من حل ربط المنقي (في المياه دي) إلى 25 ميليلتر من الخلايا ونفض الغبار الأنبوبة عدة مرات.
      2. نقل خليط خلايا الحمض النووي ومبومو الباردة، اضغط على كونترتوب 2 x، مسح المياه من السطح الخارجي ومبومو، وضع في نبض انهانسر الوحدة النمطية والصحافة.
      3. أداء انهانسر مع جهاز اليكتروبوراتور قياسية باستخدام 25 µF، 200 Ω و 1.8 كيلو فولت. يجب أن يكون وقت ثابت 4-5 مللي ثانية.
    7. إضافة 1 مل من السائل 2xYT المتوسطة دون أي المضادات الحيوية فورا ونقل إلى أنبوب 10 مل والسماح لتنمو في 37 درجة مئوية، تهز 220 لفة في الدقيقة ح 1.
    8. لوحة تحويل DH5αF ' 2xYT 15 سم لوحات أجار تستكمل مع 34 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول (المقاومة بفيلتير) والامبيسلين 25 ميكروغرام/مل (العلامة الانتقائي ل Orf) واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
    9. تخفيف لوحة المكتبة على 10 سم 2xYT أجار لوحات تستكمل مع الكلورامفينيكول + الأمبيسلّين ومع الكلورامفينيكول فقط، لإجراء المعايرة المكتبة. تبني بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  4. بفيلتير--ORF مكتبة التحقق من الصحة
    1. اختبار المستعمرات 15-20 من كلا الكلورامفينيكول وإدراج لوحات الكلورامفينيكول/الأمبيسلّين لتقدير حجم التوزيع. اختيار واحدة من مستعمرات مع تلميح وتمييع لهم بشكل منفصل في 100 ميليلتر من متوسطة 2xYT دون المضادات الحيوية. استخدام 0.5 ميليلتر لهذا الحل كقالب الحمض النووي لرد فعل بكر، مع أي بوليميراز تاقدنا القياسية التالية البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    2. إجراء دورات 25 التضخيم باستخدام T الصلب من 55 درجة مئوية وفترة تمديد 40 ثانية عند 72 درجة مئوية. وترد في الجدول للموادمتواليات التمهيدي.
    3. تحميل منتجات PCR على 1.5% [اغروس] هلام، جنبا إلى جنب مع بي بي سلم الحمض النووي وتشغيل 100.
  5. مجموعة مكتبة بفيلتير-ORF
    1. جمع البكتريا من لوحات 150 مم بإضافة 3 مل متوسطة 2xYT الطازجة وحصاد لهم مع مكشطة عقيمة، مزيج دقيق وتكمل لهم مع 20% والغليسيرول العقيمة وتخزين في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة.
    2. تنقية الحمض النووي بلازميد من قاسمة واحدة من المكتبة (قبل إضافة الجلسرين) استخدام مجموعة أدوات استخراج بلازميد المستندة إلى عمود، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    3. قياس التركيز مع جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى يستخدمها خ ع لإعداد مكتبة فاجيميد و/أو وصف.

2-سوبكلونينغ من Orf المصفاة في ناقل فاجيميد (الشكل 2)

  1. إعداد ORF تصفية شظايا من الحمض النووي
    1. إعداد الهضم إنزيم التقييد من 5 ميكروغرام من ناقلات المنقي من ناقلات مكتبة بفيلتير-ORF إضافة 10 U من بسشيي وتفرخ وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إلغاء تنشيط الإنزيم وهضم مع 10 ش في ني.
    2. تحميل الحمض النووي هضمها على 1.5% [اغروس] هلام، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي bp 100. إجراء التفريد قصيرة تشغيل 5 الخامس/سم لمدة 15 دقيقة أو ما يكفي تميز اللطاخة قصت الشظايا وقطع جزء جل التي تحتوي عليها.
    3. تنقية الحمض النووي إدراج مع مجموعة أدوات استخراج هلام قاعدة العمود وقياس تركيز استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية.
  2. إعداد فاجيميد الحمض النووي
    1. قم بإعداد قيود إنزيم هضم 5 ميكروغرام من pDAN5 المنقي27 أما بالنسبة إدراج.
    2. تنقية بلازميد هضمها بالحمض النووي هضمها قيد التشغيل على [اغروس] هلام 0.75 في المائة، ويستخرج من جل مع مجموعة يستند إلى العمود.
    3. قياس تركيز استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. ربط مكتبة والتحول وجمع
    1. إجراء عملية ربط والتحول كما هو موضح لمتجه بفيلتير.
    2. لوحة تحويل DH5αF ' على 150 مم 2xYT أجار لوحات تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
    3. لوحة تخفيف للمكتبة على لوحات أجار 2xYT 100 مم وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين لتحديد حجم المكتبة.
    4. إجراء التحقق من صحة مكتبة ببكر من الحيوانات المستنسخة انتقاؤها عشوائياً كما هو موضح في الخطوة 1، 4.
    5. جمع مكتبة فاجيميد-ORF بحصاد البكتيريا من لوحات 150 مم، ومزيج دقيق، الملحق لهم مع 20% والغليسيرول العقيمة ومخزن في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة.
    6. تنقية بلازميد الحمض النووي من قاسمة واحدة من المكتبة باستخدام مجموعة أدوات استخراج بلازميد المستندة إلى عمود، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    7. قياس التركيز في جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى باستخدامه لتوصيف خ ع.

3-بالعاثية المكتبة إعداد وإجراء الاختيار

  1. إنتاج بالعاثية
    1. تضعف من قاسمة أسهم في مكتبة فاجيميد في 10 مل مرق 2xYT السائلة وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين كي يكون OD600nm = 0.05.
    2. تنمو المكتبة المخفف في قارورة معقمة 5-10 مرات أكبر من الحجم الأصلي، في 37 درجة مئوية مع الهز 220 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى OD600nm = 0.5.
    3. تصيب البكتيريا مع مساعد بالعاثية (مثل M13K07) في عدد وافر إصابة 20:1. ترك في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع الانفعالات العرضية (كل 10 دقائق).
    4. الطرد المركزي البكتيريا في 4000 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه البكتيريا في 40 مل مرق 2xYT السائلة وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 50 ميكروغرام/مل كاناميسين وتنمو في 28 درجة مئوية مع الهز 220 لفة في الدقيقة لبين عشية وضحاها.
    5. اليوم التالي، البكتيريا للطرد المركزي في ز 4000 x لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية المحتوية على فاجيس.
  2. شماعة-هطول الأمطار فاجيس.
    1. إضافة 1/5 حجم مكم 0.22 تصفية الحل الوتد/كلوريد الصوديوم (20% w/v ربط 6000، 2.5 م كلوريد الصوديوم) إلى فاجيس المطهرة واحتضان على الجليد لمدة 30-60 دقيقة.
      ملاحظة: الحل أصبح الدخان بعد بضع دقائق، مما يدل هطول الأمطار بالعاثية ناجحة. التغيم الحل ستزيد خلال فترة الحضانة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وستشكل بيليه صغيرة بيضاء من فاجيس.
    3. ريسوسبيند أنه في 1 مل PBS العقيمة. نقل إلى أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة ممكنة لإزالة البكتيريا الملوث. وستشكل بيليه براون.
    4. نقل فاجيس طاف تحتوي على أنبوب جديد. تبقى فاجيس على الجليد لاختيار المعايرة وبالعاثيه المتعاقبة.
  3. معايرة بالعاثية
    1. إعداد تخفيف المسلسل الحل بالعاثية. وضع 10 ميليلتر من الحل بالعاثية ميليلتر 990 من برنامج تلفزيوني للحصول على 10-2 إضعاف. تمييع مرة أخرى هذا الإعداد لجعل 10-4 ومن ذلك الحصول على إضعاف 10-6 .
    2. تنمو DH5αF ' خلايا البكتيريا في المتوسط 2xYT السائلة في 37 درجة مئوية مع الهز حتى OD600nm = هو التوصل إلى 0.5. نقل 1 مل بكتيريا المعدة إلى أنبوب 1.5 مل وتصيب فورا مع 1 ميليلتر لتمييع بالعاثية 10-4 . احتضان دون تهتز عند 37 درجة مئوية ل 45 دقيقة تكرار نفس الإجراء للتخفيف 10-6 .
    3. لوحة تخفيف البكتيريا المصابة إلى لوحة 2xYT 100 مم. وضع اللوحة عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. لوحة 100 ميليلتر من DH5αF مصابة ' على طبق أجار 2xYT وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين للتحقق من عدم وجود تلوث في الإعداد.
    5. بعد يوم من حساب عدد المستعمرات وحساب عيار بالعاثية. التعبير عن عيار كرقم فاجيس/مل. عيار المتوقع 1012-13 فاجيس مليلتر.
  4. اختيار بالعاثية
    1. تنقية التحديد بالعاثية تستخدم كطعم الأجسام المضادة
      1. تشبع فاجيس بتمييع ميليلتر 200 من إعداد بالعاثية المساواة إلى حجم اللبن المقشود PBS-4% واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في دوران بطيء. تسمح هذه الخطوة عرقلة فاجيس للربط غير محدد. نقل 30 ميليلتر من البروتين-ز الخرز المغناطيسي المغلفة بأنبوب 1.5 مل.
      2. تغسل مرتين على النحو التالي: إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني واحتضان على عجلة دوران بطيئة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ورسم الخرز إلى جانب واحد من الأنبوب باستخدام مغناطيس وإزالة المادة طافية.
      3. احتضان فاجيس المشبعة مع الخرز غسلها مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع استدارة بطيئة.
      4. رسم الخرز إلى جانب واحد باستخدام حقل مغناطيسي. جمع المادة طافية المحتوية على فاجيس التي ستستخدم لتحديد الخطوة.
      5. إعداد حبات المغناطيسي أثناء أداء الخطوة السابقة، قبل التصريف الأجسام المضادة النقية. أغسل 30 ميليلتر من البروتين-ز المغلفة المغناطيسي الخرز كما هو موضح أعلاه. تمييع 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة المنقاة في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، إضافة إلى الخرز غسلها واحتضان في دوران بطيء في درجة حرارة الغرفة ل 45 دقيقة يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: إجراء استعدادات مختلفة اثنين من حبات مغناطيسية: أحدهما مع الأجسام المضادة للفائدة والآخر مع مراقبة الأجسام المضادة، مثل الأجسام المضادة تنقيته من المانحين صحي. تسلسل المستضدات المحددة مع عنصر التحكم يتم طرح الأجسام المضادة أثناء الخطوة تحليل النواتج. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الخرز المغناطيسي محملة بمراقبة الأجسام المضادة القيام بخطوة التخليص المسبق من فاجيس (يتبع البروتوكول للاحتضان مع الخرز مترافق الأمم المتحدة).
      6. اختيار بالعاثية: رسم الخرز إلى جانب واحد من الأنبوب باستخدام مغناطيس، وإزالة الغسيل الأخير، وإضافة فاجيس واحتضان مع دوران بطيء في درجة حرارة الغرفة ل 90 دقيقة أغسل 5 مرات مع 500 ميليلتر من PBS-0.1% توين-20 و 5 مرات مع برنامج تلفزيوني.
      7. الوتي فاجيس المنضم، يمثل الناتج من عملية الاختيار، بمزج الخرز مع 1 مل DH5αF ' الخلايا نمت OD600 = 0.5. احتضان البكتيريا مع حبات لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية مع عرضية تهز (كل 10 دقائق). لوحة الإخراج على طبق أجار 2xYT 150 مم وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
      8. لوحة 100 ميليلتر غير مخفف وتخفيف مختلفة للإخراج (10-1 إلى 10-5) لإجراء المعايرة. بعد يوم من تجمع البكتيريا من لوحات 150 مم بإضافة 3 مل من 2xYT الطازجة المتوسطة وحصاد لهم مع مكشطة عقيمة، مزيج دقيق وتكمل لهم مع 20% والغليسيرول العقيمة وتخزين في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة.
      9. تنمو قاسمة واحد مرة أخرى لأداء ثانية جولة للتحديد. كرر كل إجراء الغسل كما هو موضح أعلاه باستثناء شروط الغسل. في هذه الحالة يغسل 10 مرات مع برنامج تلفزيوني-1 ٪ توين-20 (من أجل حل في الأنبوب وصب مرة أخرى على الفور). ثم إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، وتبني على أساس التناوب في درجة حرارة الغرفة لإجراء 10 دقيقة أخرى يغسل 10 مع برنامج تلفزيوني. الانتقال إلى الخطوة شطف أما بالنسبة للجولة الأولى من التحديد.
      10. استخراج الحمض النووي بلازميد من قاسمة واحد للإخراج باستخدام مجموعة تستند إلى عمود، اتباع تعليمات الشركات المصنعة. تخزين بلازميد في-20 درجة مئوية حتى أنها ستستخدم لتسلسل عميق.
    2. التحديد بالعاثية باستخدام كالبروتينات المؤتلف الطعم
      1. تشبع فاجيس بتمييع ميليلتر 200 من إعداد بالعاثية المساواة إلى حجم اللبن المقشود PBS-4% واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في دوران بطيء.
      2. إضافة 100 ميليلتر من حبات ستريبتافيدين المغناطيسي. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة لتحديد فاجيس streptavidin الملزمة. إزالة فاجيس streptavidin زمنياً بالرسم الخرز على جانب واحد باستخدام مغناطيس. تأخذ طافية من الخطوة السابقة وإضافة البروتين بيوتينيلاتيد (بتركيز 100-550 نيوتن متر) واحتضان في دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى ح 1.
      3. إعداد حبات مغناطيسية: أثناء أداء الخطوة السابقة، يغسل 100 ميليلتر من حبات ستريبتافيدين المغناطيسي مع برنامج تلفزيوني، وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني 2% الحليب المقشود واحتضان مع التناوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى ح 1.
      4. اختيار بالعاثية: رسم الخرز إلى جانب واحد من الأنبوب باستخدام مغناطيس وإزالة برنامج تلفزيوني-2% الحليب وريسوسبيند الخرز مع مزيج بالعاثية بالبروتين. احتضان مع دوران بطيء في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
      5. رسم الخرز إلى جانب واحد من الأنبوب باستخدام مغناطيس، وتجاهل المادة طافية وغسلها بعناية خمس مرات مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 0.1% توين-20. تنفيذ شطف كما هو موضح في الدورة السابقة.

4-بالعاثية مكتبة تسلسل عميق منصة (الشكل 3)

  1. الحمض النووي بإدراج الانتعاش من مكتبة-بفيلتير-ORF، pDAN5-ORF-مكتبة أو مكتبات بالعاثية مختارة
    1. ذوبان الجليد قاسمة واحدة من المكتبة، كمياً فإنه باستخدام جهاز المطياف الضوئي استرداد إدراج الحمض النووي بالتضخيم مع الإشعال محددة.
      ملاحظة: ترتبط الإشعال المستخدمة للإنقاذ يدرج في نهايتها 5 ' إلى تسلسل محولات، مما يسمح لفهرسة المتعاقبة من حمامات أمبليكون التي تم الحصول عليها واستردادها مباشرة يسلسل من إدراج الحمض النووي باستخدام التعاقب. يتم تسلسلها في الجدول للمواد. يتم الإشارة إلى المحولات في غامق، والإشعال محددة ترد بحروف مائلة.
    2. استخدام ميليلتر 2.5 من المكتبة (بفيلتير/فاجيميد/المحدد-بالعاثية) كقالب الحمض النووي لفعل PCR.
    3. استخدم البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 25 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، 55 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 30 ق؛ 72 درجة مئوية لعقد 5 كحد أدنى في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عند هذه النقطة من المستحسن تشغيل 1 ميليلتر من المنتج بكر على بيواناليزير أو تابيستاتيون للتحقق من حجم أمبليكونس والتحقق من أن تكون في النطاق الصحيح.
  2. تنظيف بكر
    1. إحضار الخرز المغناطيسي (مثلاً، أمبوري) إلى درجة حرارة الغرفة. نقل المنتج بكر كامل من الأنبوب PCR إلى أنبوب 1.5 مل. دوامة الخرز المغناطيسية لمدة 30 ثانية للتأكد من أن الخرز موزعة بالتساوي. إضافة 20 ميليلتر من حبات مغناطيسية لكل أنبوبة تحتوي على المنتج بكر، مزيج من قبل بيبيتينج برفق. احتضان في درجة حرارة الغرفة دون المصافحة لمدة 5 دقائق.
    2. وضع اللوحة على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة أو حتى أزال المادة طافية. مع منتجات PCR على الوقوف المغناطيسي، إزالة وتجاهل المادة طافية.
    3. تغسل الخرز مع الإيثانول 80% طازجة، مع منتجات PCR الوقوف المغناطيسي، على النحو التالي: إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% طازجة لكل عينة جيدا؛ احتضان لوحة على موقف المغناطيسي 3 s; بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
    4. أداء يغسل إيثانول ثانية، مع منتجات PCR على الوقوف المغناطيسي؛ في نهاية الغسيل الثاني بعناية إزالة جميع الإيثانول وتسمح الخرز أيردري لمدة 10 دقائق.
    5. إزالة منتجات PCR من موقف المغناطيسية وإضافة 17.5 ميليلتر من 10 ملم تريس pH 8.5 إلى كل أنبوبة، بلطف "الماصة؛" حتى وأسفل 10 مرات، تأكد من أن يتم حراكه الخرز تماما. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    6. ضع الأنبوب على الوقوف المغناطيسية لمدة 2 دقيقة أو حتى أزال المادة طافية، نقل بدقة 15 ميليلتر من المادة طافية التي تحتوي على منتجات بكر المنقي لأنبوب 1.5 مل جديدة. تخزين المنتجات بكر المنقي في-15 درجة مئوية إلى-25 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع إذا كنت لا تقم بالمتابعة فورا إلى فهرس PCR.
  3. فهرس PCR
    ملاحظة: بعد تنظيف بكر، إجراء PCR الفهرس. استخدام مجموعة "نيكستيرا XT مؤشر"؛ وبالتالي سيكون من الممكن لتسلسل المكتبات المفهرسة مزدوجة الناتجة عن ذلك في إطار متعدد إيلومينا يعمل.
    1. نقل كل ميكروليتر 15 يحتوي على كل منتج تنقيته في أنبوب بكر جديدة وإعداد الرد التالي الذي يتضمن: 15 ميليلتر amplicon تنقية المنتج، 5 ميليلتر من الفهرس التمهيدي 1 و 5 ميليلتر من الفهرس التمهيدي 2، 25 ميليلتر من مزيج x PCR 2؛ الحجم النهائي من 50 ميليلتر.
    2. أداء بكر على cycler حرارية باستخدام البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 3، 8 دورات 95 درجة مئوية لمدة 30 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ق؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
  4. بكر تنظيف 2
    1. اتبع نفس البروتوكول الموضحة في القسم 4.2 لبكر تنظيف مع التغييرات التالية: في الخطوة الأولى إضافة ميليلتر 56 من حبات مغناطيسية لكل ميليلتر 50 منتج PCR.
    2. ريسوسبيند الخرز في ميليلتر 27.5 من 10 ملم تريس pH 8.5 في الخطوة النهائية لتنقية ونقل 25 ميليلتر لأنبوب جديد (هذا هو المنقي المكتبة النهائية جاهزة للقياس الكمي وثم التسلسل).
    3. تخزين اللوحة في-15 درجة مئوية إلى-25 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع إذا لم نشرع في "مكتبة القياس الكمي".
  5. التقييم النوعي والكمي للمكتبة التسلسل
    1. بعد تنقية، تشغيل 1 ميليلتر من 01:10 تمييع مكتبة بيواناليزير للتحقق من الحجم وقياس ذلك تحديد منطقة تتبع مكتبة النهائي النهائي.
    2. بالتوازي مع إجراء التقدير الكمي مكتبة قبل PCR الوقت الحقيقي باستخدام مجموعة أدوات القياس الكمي مكتبة الواحدة والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  6. مكتبات التسلسل
    1. تجمع المكتبات المفهرسة المزدوج أنتج جنبا إلى جنب مع مكتبات أخرى يسلسل المفهرسة المزدوج. ما يلي تسلسل يقرأ هذا النوع من المكتبة عن طريق توليد منذ فترة طويلة، على الأقل 250 bp نهاية المقترنة باستخدام في Hiseq2500 أو في الصكوك مسك للحصول على في بي 250bp القضية الأولى ما يلي: وفي الثانية حالة 300 شركة بريتيش بتروليوم PE.

5-تحليل البيانات بيوينفورماتيك باستخدام أداة ويب Seq إينتيراكتومي

  1. تحليل القراءات نشأت من تسلسل مكتبة بفيلتير/فاجيميد/المحدد-بالعاثية مع خط الأنابيب تحليل البيانات seq إينتيراكتومي. أداة الشبكة متاحة بحرية على العنوان التالي: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن النهج التصفية هي المخططة في الشكل 1. ويمكن استخدام كل نوع من الحمض النووي إينترونلس. في الشكل 1 (أ) يمثل الجزء الأول من نهج تصفية: بعد التحميل [اغروس] هلام أو بيواناليزير، يظهر تجزئة جيدة من الحمض النووي للفائدة كمسحة من الشظايا بتوزيع طول في الحجم المطلوب من 150-750 شركة بريتيش بتروليوم. وتعطي صورة تمثيلية جل ظاهري لتجزئة الحمض النووي التي تم الحصول عليها. هي الأجزاء المحملة على [اغروس] هلام ثم المستردة وإصلاحه نهاية وفوسفوري...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء مكتبة عالية الجودة التي تمت تصفيتها Orf درجة عالية من التنوع هو الخطوة الأولى الحاسمة في الإجراء برمته نظراً لأنه سوف يؤثر على جميع الخطوات اللاحقة من خط الأنابيب.

سمة هامة مفيدة لأسلوبنا أن أي مصدر للحمض النووي (إينترونلس) (كدنا، الحمض النووي، وبكر مشتقة أو الحمض النووي التركيبية) مناسبة لبناء مكتبة. المعلمة الأولى التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار أن طول أجزاء الحمض النووي المستنسخة في ناقلات بفيلتير ينبغي أن توفر تمثيل لمجموعة كاملة من المجالات جينوم أو الترنسكربيتوم، ما يسمى "دومينومي"....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان يؤيد هذا العمل بمنحه من وزارة التربية والتعليم الإيطالية وجامعة (2010P3S8BR_002 لحزب المحافظين).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الخالط بالموجات فوق الصوتية SonopulsBandelinHD2070أو ما يعادله
GeneRuler 100 نقطة أساس بالإضافة إلى سلم الحمض النوويالحراري العلميSM0321أو ما يعادله
GeneRuler 1 كيلو بايت سلم الحمض النوويThermo Fisher ScientificSM0311أو ما يعادله
من البيولوجيا الجزيئية AgaroseBioRad161-3102أو ما يعادله
Green Gel Plusفيشر للبيولوجيا الجزيئيةFS-GEL01أو ما يعادلها
6x DNA تحميل صبغةThermo Fisher ScientificR0611أو ما يعادلها
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704أو ما يعادلها
Quick Blunting KitNew England BiolabsE1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis مقياس الطيفالضوئي الحراري فيشر العلميND-2000
طقم النسخ العكسي (cDNA) عالي السعةThermo Fisher Scientific4368813
Streptavidin Magnetic BeadsNew England BiolabsS1420Sأو ما يعادله
QIAquick PCR KitQiagen28104أو ما يعادله
EcoRVNew England BiolabsR0195L
Antarctic PhosphataseNew England BiolabsM0289S
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202T
أسيتات الصوديوم 3M pH5.2المختبر العام
الإيثانول للبيولوجيا الجزيئيةSigma-AldrichE7023أو ما يعادلها
DH5AF 'خلايابكتيريا Thermo Fisher Scientific
0,2 مل أنابيبمورد المختبرالعام
1,5 مل أنابيبالمختبر
0,1 سم كوفيت التثقيب الكهربائيBiosigma4905020
Electroporator 2510Eppendorf
2x YT متوسطSigma-AldrichY1003
ملح الصوديوم أمبيسلينسيجما ألدريتشA9518
كلورامفينيكولسيجما ألدريتشC0378
DreamTaq DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificEP0702
Deoxynucleotide (dNTP) مزيج محلولنيو إنجلاند BiolabsN0447S
96 جيدا (مع غطاء ساخن)مورد
150 مم موردالمختبر
100 مم لوحاتالمختبرالعام
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516
BSSHIIنيو إنجلاند بيولابسR0199L
NheIنيو إنجلاند بيولابسR0131L
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104أو ما يعادلها
M13KO7 Helper PhageGE Healthcare Life Sciences27-1524-01 
كبريتات كاناميسين من Streptomyces kanamyceticusSigma-AldrichK1377
بولي إيثيلين جلايكول (PEG)سيجما ألدريتشP5413
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيجما ألدريتشS3014
موردالمختبر
PBS Dynabeads بروتين G للترسيب المناعيThermo Fisher Scientific10003Dأو ما يعادل
رف الفصل المغناطيسي MagnaRackThermo Fisher ScientificCS15000أو ما يعادله
Tween 20Sigma-AldrichP1379
مسحوق الحليب المجفف الخالي من الدسمEuroCloneEMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix  Kapa Biosystems ، Fisher Scientific7958935001
AMPure XP BeadsAgencourt ، Beckman CoulterA63881
Nextera XT Dual Index PrimersIlluminaFC-131-2001 أو FC-131-2002 أو FC-131-2003 أو FC-131-2003 أو FC-131-2004
MiSeq أو Hiseq2500Illumina
SpectrophotomerNanodrop
Agilent محلل حيوي أو TapeStationAgilent
Forward PCR التمهيديالمختبر العام5 ' TACCTATTGCCTACGGCA
GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'
عكس PCR التمهيديالمختبر العام5 ' TGGTGATGGTGAGTACTA
TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3'
التمهيدي الأمامي لموردالمختبر العام5 ' TCGTCGGCAGCGTCAGA
TGTGTATAAGAGACAGGCA
GCAAGCGGCGCGCATGC 3';
التمهيدي العكسي لموردالمختبر العام5 ' GTCTCGTGGGCTCGGAGA
TGTGTATAAGACAGG
ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';
مورد مورد العامالمختبر العامالعام مورد العام مورد مورد NGS NGS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loman, N. J., Pallen, M. J. Twenty years of bacterial genome sequencing. Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).
  2. Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations. BMC Bioinformatics. 8 (1), 170(2007).
  3. Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach. BMC Bioinformatics. 8 (1), 284(2007).
  4. Wong, W. -C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology. PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867(2010).
  5. Bioinformatics, B., et al. Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases. BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).
  6. Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).
  7. DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome. J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).
  8. Nordlund, P., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  9. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  10. Di Niro, R., et al. Rapid interactome profiling by massive sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (9), e110(2010).
  11. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).
  12. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).
  13. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).
  14. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).
  15. Heger, A., Holm, L. Exhaustive enumeration of protein domain families. J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).
  16. Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. Selecting open reading frames from DNA. Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).
  17. Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection. Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).
  18. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  19. Collins, M. O., Choudhary, J. S. Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).
  20. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).
  21. Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif. J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).
  22. Deng, S. J., et al. Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display. J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).
  23. Danner, S., Belasco, J. G. T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).
  24. Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).
  25. Patrucco, L., et al. Identification of novel proteins binding the AU-rich element of α-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome). RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).
  26. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Mol Biol. 1 (2), 146(2003).
  27. Sblattero, D., Bradbury, A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).
  28. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  29. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10 (1), 421(2009).
  30. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Curr Protoc Bioinforma. , (2014).
  32. Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. JBrowse: A next-generation genome browser. Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).
  33. Gourlay, L. J., et al. Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).
  34. D'Angelo, S., et al. Filtering "genic" open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation. BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5(2011).
  35. Di Niro, R., et al. Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display. Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).
  36. D'Angelo, S., et al. Profiling celiac disease antibody repertoire. Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Domainome LibraryPhage DisplayNext Generation SequencingORF Library ConstructionGel ElectrophoresisDNA LigationElectroporationAntibiotic SelectionPlasmid PurificationNGS Analysis

Related Articles