الكريات البيضاء شوق تتفاعل مع خلايا الأوعية الدموية والصفائح الدموية بعد إصابة الجدار السفينة أو أثناء التهاب. وهنا يصف لنا تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تجنيد الكريات البيضاء عند الإصابة أو التهاب للمواقع من ضرر أو تلف الأنسجة حققت خلال العقود الأخيرة، وقد أدى مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض لا بعد تماما حددت. التوظيف الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال العدوى والتهاب (السيارات) محصنة والبحوث، فإننا نعرض تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، و التهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. يمكن استخدام التحليل في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. ويصف هذا البروتوكول تحليل القائم على التدفق الصفحي استخدام دائرة التوازي-تدفق و مقلوب مجهر تباين المرحلة متصلة بكاميرا لدراسة التفاعلات بين الكريات البيضاء وخلايا بطانية أو الصفائح الدموية، التي يمكن أن تصور وتسجل ثم تحليل دون اتصال. يمكن pretreated خلايا بطانية أو الصفائح الدموية أو الكريات البيضاء مع مثبطات أو الأجسام المضادة لتحديد دور جزيئات محددة أثناء هذه العملية. شروط القص، أي الشرياني أو الوريدي القص الإجهاد، يمكن تكييفها بسهولة من اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة.
المقدمة
عند الإصابة أو الالتهاب أو العدوى، الكريات البيضاء بسرعة الاستجابة الممرض أو الأضرار-المرتبطة بالجزيئات أنماط (بامبس، دامبس)، تغيير في حالة نشطة، والانتقال من مجرى الدم إلى مواقع لتلف الأنسجة والتهاب. قدرة الكريات البيضاء على التفاعل مع بيئتها الخلوية والجزيئية ضروري لوظيفتها الصحيحة كالخلايا المناعية، كما أبرزت الاضطرابات الوراثية مثل نقص التصاق الكريات البيض1. التصاق الكريات البيض خضعت لتحقيقات مكثفة خلال العقود الماضية وأسفر ذلك عن مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض في أوائل التسعينات2،3. التصاق الكريات البيض تبدأ بإلقاء القبض على سيليكتين بوساطة الكريات البيضاء إلى البطانة، مما تسبب ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها الأخلاقية الطبية ومجالس الأخلاقية الحيوان في جامعة ماستريخت.
1-تدفق على أساس مقايسة مع الخلايا البشرية
-
عزل الصفائح الدموية من الدم البشري
- سحب الدم الوريدي في تخثر سترات (3.2 في المائة).
- إضافة إلى حجم 1/15 من "حمض سترات الدكستروز" (حوار التعاون الآسيوي: سترات صوديوم 80 مم، وحمض الستريك 52 مم والجلوكوز 183 مم) في الدم.
- الطرد المركزي في 350 x ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
- نقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة المجلد 1/20 من حوار التعاون الآسيوي.
- الطرد المركزي في 1,110 ز دون ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
دراسة التصاق غشائي الكريات البيض، كانت perfused المسمى فلوريسسينتلي THP-1 خلايا أكثر TNFα-أو غير-حفز غشائي أحادي الطبقة لمدة 2 دقيقة في 3 داين/سم2. العدد الإجمالي للخلايا مونوسيتيك ملتصقة تحددها بعد 2 دقيقة من نضح التقاط 6 حقول مستقلة على مدى فترة من 2-6 دقيقة. تم قياس كمية الخلايا ملتصقة بالصور على الأقل 6 أسر مع مجهر تباين/فلورية مرحلة مقلوب (مثلاً، أفوس-فلوريدا) استخدام التكبير X 10 متصل بكاميرا CCD أو CMOS رقمية وأعرب المتوسط كخلايا ملتصقة/ مم2. عند تحفي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا التحليل في المختبر وسيلة مباشرة للتحقيق في الآليات الأساسية للتوظيف الكريات البيض أثناء التهاب الأوعية الدموية، ولكن هناك بعض النقاط الحرجة للإشارة إلى. الشرط الأول لنجاح إجراء هذا الفحص هو نضح من الكريات البيضاء حالها والمتلاقية الأوعية الدموية أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية. هذا يمكن أن يتحقق بطلاء المسبقة للسطوح مع نوع الكولاجين أنا. بشكل عام، عند العمل مع الخلايا والأوعية الدموية الأولية، من المهم أن لطف فصل الخلايا باستخدام الحل الموصى به مفرزة المحتوية على كولاجيناز (انظر الجدول للمواد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر الدكتور مارتن م. شميت وخط فرايموهس. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة هولندا" "البحث العلمي" (زونمو على 016.126.358 اندشتاينر مؤسسة بحوث نقل الدم (Nr. 1638) والألمانية الأوقيانوغرافية (SFB1123/A2) منحت إلى R.R.K.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المجهر الفلوري المقلوب على سبيل المثال EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump على سبيل المثال < / em> الموديل: 210-CE | & nbsp ؛ أدوات الدقة العالمية | 78-9210W | |
| Falcon 35 مم TC المعالجة سهلة الإمساك بنمط صحن ثقافة الخلية | corning | 353001 | |
| 50 مل حقنة | Becton Dickinson | 300137 | |
| أنابيب سيليكون ؛ | VWR | 228-0700 | |
| الكوع لور موصل ذكر | Ibidi | 10802 | |
| أنثى Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| غرفة التدفق | مستشفى الجامعة RWTH Aachen | براءات الاختراع DE10328277A1: Baltus T ، Dautzenberg R ، Weber CPD. Str & ouml ؛ mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgä ngen an Zelloberfl & auml; تشين. 2005. | |
| Ibidi لزجة الشريحة السادس 0.4 | نفس المرجع | 80608 | |
| أغطية للشرائح اللاصقة | نفس المصدر | 10812 | |
| الكولاجين النوع الأول ، ذيل الفئران | تقنيات الحياة أوروبا bv | A1048301 | |
| مؤتلف إنسان نخر الورم الوراء- & ألفا ؛ | Peprotech | 300-01A | |
| منشط مستقبلات الثرومبين للببتيد 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 صبغة الحمض النووي الفلوري الأخضر | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks' محلول ملح متوازن 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| محلول عازلة HEPES 1M ، سائل | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin ، 25٪ & nbsp ؛ | باكستر | 60010 | |
| ماء للحقن | B. براون | 3624315 | |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | Merck | 102382 | |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| الخلايا البطانية للوريد السري البشري الأولي (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| وسط نمو الخلايا البطانية (جاهز للاستخدام) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| الخلايا البطانية الأبهرية البشرية الأولية (HAoEC) | ATCC | & nbsp ؛ PCS-100-011 | |
| الوعائية القاعدية المتوسطة | ATCC | PCS-100-030 | |
| مجموعة نمو الخلايا البطانية-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| خلايا العضلات الملساء الأبهري البشري الأولية (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| مجموعة نمو خلايا العضلات الملساء الوعائية | ATCC | PCS-100-042 | |
| خط الخلايا البطانية البشرية ، EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's خط الخلايا البطانية للفأر المتوسط المعدل (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| ، SV 40 محول (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| خط الخلايا البشرية الأحادية ، THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 مع Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F / U1 | |
| أحادي الخلية / البلاعم RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، ارتفاع نسبة الجلوكوز | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD أنابيب جمع الدم البلاستيكية بالفراغ مع هيبارين الصوديوم | بيكتون ديكنسون | 367876 | |
| أنبوب VACUETTE 9 مل 9NC سيترات الصوديوم التخثر 3.2٪ ؛ | خليط Greiner Bio | 455322 | |
| حمض الهيدروكلوريك / EtOH (1.2 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك و 50٪ إيثانول) في الماء | Sigma-Aldrich Chemie | تحضير عن طريق خلط 0.3 لتر حمض الهيدروكلوريك (4 مول / لتر) مع 0.7 لتر من 70٪ من الإيثانول في غطاء |
المراجع
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leuko....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
