يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57009

⸱

أبريل 9, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Department of Vascular Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

الكريات البيضاء شوق تتفاعل مع خلايا الأوعية الدموية والصفائح الدموية بعد إصابة الجدار السفينة أو أثناء التهاب. وهنا يصف لنا تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية.

الملخص

تجنيد الكريات البيضاء عند الإصابة أو التهاب للمواقع من ضرر أو تلف الأنسجة حققت خلال العقود الأخيرة، وقد أدى مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض لا بعد تماما حددت. التوظيف الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال العدوى والتهاب (السيارات) محصنة والبحوث، فإننا نعرض تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، و التهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. يمكن استخدام التحليل في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. ويصف هذا البروتوكول تحليل القائم على التدفق الصفحي استخدام دائرة التوازي-تدفق و مقلوب مجهر تباين المرحلة متصلة بكاميرا لدراسة التفاعلات بين الكريات البيضاء وخلايا بطانية أو الصفائح الدموية، التي يمكن أن تصور وتسجل ثم تحليل دون اتصال. يمكن pretreated خلايا بطانية أو الصفائح الدموية أو الكريات البيضاء مع مثبطات أو الأجسام المضادة لتحديد دور جزيئات محددة أثناء هذه العملية. شروط القص، أي الشرياني أو الوريدي القص الإجهاد، يمكن تكييفها بسهولة من اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة.

المقدمة

عند الإصابة أو الالتهاب أو العدوى، الكريات البيضاء بسرعة الاستجابة الممرض أو الأضرار-المرتبطة بالجزيئات أنماط (بامبس، دامبس)، تغيير في حالة نشطة، والانتقال من مجرى الدم إلى مواقع لتلف الأنسجة والتهاب. قدرة الكريات البيضاء على التفاعل مع بيئتها الخلوية والجزيئية ضروري لوظيفتها الصحيحة كالخلايا المناعية، كما أبرزت الاضطرابات الوراثية مثل نقص التصاق الكريات البيض1. التصاق الكريات البيض خضعت لتحقيقات مكثفة خلال العقود الماضية وأسفر ذلك عن مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض في أوائل التسعينات2،3. التصاق الكريات البيض تبدأ بإلقاء القبض على سيليكتين بوساطة الكريات البيضاء إلى البطانة، مما تسبب في الخلايا للفة فوق سطح الأوعية الدموية. هذا المتداول تمكن الكريات البيضاء المسح الضوئي لربط البطانة المهاجرة العظة، مثلاً، المستقطبات، والحث على تفعيل إينتيجرينس. وفي وقت لاحق، التوسط integrins المنشط الربط إلى يغاندس بطانية، أسفرت عن اعتقال الكريات البيض وطيد. في وقت لاحق قد تعد الكريات البيضاء اكسترافاساتي بالزحف والانتشار، قبل اختراق أحادي الطبقة البطانية وترانسميجراتينج إلى الأنسجة الكامنة. المفهوم الأساسي لسلسلة الكريات البيض المتعارف عليه قد يتغير إلى حد كبير منذ إطلاقها، مع بعض الخطوات الوسيطة وأضاف4. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة وأدوار العديد من اللاعبين المتورطين في تجنيد الكريات البيض لم توضح حتى الآن، وتجنيد الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال الإصابة بالتهاب و (السيارات-) محصنة ضد البحث.

على سبيل المثال، أثناء أمراض التهاب الأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين، زيادة تجنيد الكريات البيض في وضع اللوحة محركات الأقراص الجدار السفينة. قد تمزق لويحات تصلب الشرايين غير مستقرة، مما يؤدي إلى تنشيط واسعة النطاق لنظام التخثر والصفائح الدموية، وفيما بعد انسداد السفينة5. قد ينتج هذا عن نتائج القلب والأوعية الدموية الشديدة مثل احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية. وباﻹضافة إلى ذلك، تعرية غشائي كما يحدث سريرياً، مثلاً بعد الدعامات للشريان التاجي، يؤدي إلى العديد من التفاعلات من الكريات البيضاء والصفائح الدموية إلى داخل الجدار سفينة مكشوفة (مثلاً، عناصر المصفوفة وسلس خلايا العضلات) والكريات البيضاء مع الصفائح الدموية تغطي إصابة الأوعية الدموية. هذه التفاعلات تعتبر هامة لمواصلة تطوير هذا المرض كما قد تدفع التفاعلات الوحيدات-الصفائح الدموية نيوينتيما تشكيل6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، توسط التفاعلات الكريات البيض الصفيحات الكريات البيض إنتغرين ماك-1 (α βم2) والصفائح الدموية GPIbα قد حددت مؤخرا كسائقين رواية تجلط الدم في الفئران8.

ونظرا لتوافر الدم البشري والحيواني على نطاق واسع كمصدر للكريات البيضاء والصفائح الدموية للبحوث، وطائفة واسعة من الجزيئات مصفوفة معزولة وخطوط الخلية مخلدة الكريات البيض ومنشأ الأوعية الدموية، أنه من الممكن لمحاكاة الكريات البيض التفاعلات تحت التدفق في مختبر للإعداد، باستخدام الدوائر نضح تدفق مصممة خصيصا. وقد صممت العديد من المتغيرات العقود الماضية، بدءاً من يحركها الفراغ إلى الدوائر نضح ذاتية اللصق. كافة المتغيرات تشترك في هذا الجزء غير متحركة (مثلاً، واستزراع خلايا الأوعية الدموية أو مصفوفة البروتينات) يتم تجميعها إلى غرفة مانعة للتسرب أكبر مزودة بقناة معرفة مسبقاً تمكين نضح السوائل فوق الجزء غير متحرك. وباﻹضافة إلى ذلك، مكن التقدم في صب التكنولوجيا وضع حلول مخصصة استناداً إلى السليكا البوليمرات9. اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة أساسا تحديد خصائص القص إجهاد الجهاز نضح تدفق10. في هذه المقالة، نقدم الأسلوب في المختبر لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، والتهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. استفادة الأساليب المقدمة هنا هو أنها يمكن أن يؤديها باستخدام مجهر الأسفار كاميرا متصلة مشتركة، ولا تتطلب من المجربون أن تمتلك الكفاءة التقنية العالية. الفحص في المختبر يمكن التلاعب بطرق عديدة (مثلاً، عن طريق إضافة مثبطات أو حجب الأجسام المضادة)، وهكذا قابلاً للتطبيق في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية ويسمح التحقيق في التصاق وظائف البروتين أو تقييم لمركبات معينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها الأخلاقية الطبية ومجالس الأخلاقية الحيوان في جامعة ماستريخت.

1-تدفق على أساس مقايسة مع الخلايا البشرية

  1. عزل الصفائح الدموية من الدم البشري
    1. سحب الدم الوريدي في تخثر سترات (3.2 في المائة).
    2. إضافة إلى حجم 1/15 من "حمض سترات الدكستروز" (حوار التعاون الآسيوي: سترات صوديوم 80 مم، وحمض الستريك 52 مم والجلوكوز 183 مم) في الدم.
    3. الطرد المركزي في 350 x ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
    4. نقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة المجلد 1/20 من حوار التعاون الآسيوي.
    5. الطرد المركزي في 1,110 ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة للحصول على البلازما الفقيرة الصفائح الدموية (تعادل القوة الشرائية).
    6. تجاهل المادة طافية. قطع نهاية طرف بيبيت (1000 ف)، يجعلها واسعة تتحمل، فيها الإيدز في منع تنشيط الصفائح الدموية، وتعليق بيليه الصفائح الدموية بعناية في نفس وحدة التخزين كالحزب الثوري في الصفيحات المخزن المؤقت pH 6.6 (PB: 136 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم هيبيس ، 2.7 مم بوكل، 2 مم مجكل2والبومين المصل البقري 0.1% والجلوكوز 0.1%). إضافة إلى حجم 1/20 من حوار التعاون الآسيوي وتخلط برفق.
    7. بيليه الصفائح الدموية في 1,110 ز دون الفرامل لمدة 15 دقيقة.
    8. تجاهل المادة طافية وتعليق الصفائح الدموية أعلاه بعناية في المخزن المؤقت للصفائح الدموية 1 مل (درجة الحموضة 7.5).
    9. قياس تركيز الصفائح الدموية في تمييع 1/10 مع محلل الدم الآلي.
    10. ضبط حجم الصوت مع المخزن المؤقت للصفائح الدموية (درجة الحموضة 7.5) لتحقيق عد من 2 × 107/mL.
  2. عزل خلايا النوى من الدم البشري (مقتبس من برينكمان et al. 11 )
    1. رسم 24 مل دم في الهيبارين (10 U/mL) تخثر الدم.
    2. إضافة 6 مل من كثافة 1.077 غ/مل بوليسوكروسي الصوديوم دياتريزواتي المتوسطة (انظر الجدول للمواد) إلى الأنبوبة المخروطية 15 مل، وعناية الطبقة 5-6 مل الدم كله على أعلى.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز دون الفرامل.
    4. نضح وتجاهل الطبقة العليا مصفر واضح ونقل في مرحلة المحمر السفلي يحتوي على المحببة إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل جديدة. تغسل الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 2 مم أدتا إلى وحدة تخزين نهائي 14 مل، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل.
    5. وفي الوقت نفسه، تعد وسيلة تدرج في كثافة (مثلاً، بركل، انظر الجدول للمواد) حل عملي بخلط 18 مل الكثافة المتوسطة التدرج مع 2 مل 10 × الحل مخزون برنامج تلفزيوني. تمييع هذا الحل العمل مع برنامج تلفزيوني (س 1) للحصول على مل 4.25 كل حل من الحلول المتوسطة التدرج 85%، 80%، 75%، 70%، و 65%.
    6. إعداد أنابيب مخروطية 2 مع التدرج كثافة من طبقات 2 مل من كل نسبة مئوية متوسطة فوق بعضها البعض. بدء تشغيل مع أعلى تركيز والاستمرار في ترتيب تنازلي. علامة الطبقات في الأنبوب مع علامة الماء.
    7. الطبقة 2 مل تعليق خلية على كل من التدرجات استعداد اثنين بعناية.
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 800 x ز دون الفرامل في أجهزة الطرد مركزي متوازنة بعناية.
    9. بعد الطرد المركزي، إزالة الطبقة العليا وأكثر من 65% طبقة (الحلقة الأولى) مع ببمكس، وجمع في أنابيب جديدة الأبيض الباقية إينتيرفاسيس حتى الطبقة 85% (الدائري الثاني، المجنحة).
    10. تغسل الخلايا عن طريق ملء أنابيب مع برنامج تلفزيوني 2 مم يدتا، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل.
    11. إزالة المادة طافية وتعليق الخلايا رسابة (عادة % إيه ناين فايف هي المجنحة) في 1 مل من المخزن المؤقت في هانك (pH 7.45)، التي تحتوي على 10 ملم الزلال البشري حبيس و 0.2 في المائة (مقايسة المخزن المؤقت).
    12. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتعليق الخلايا في/mL61 x 10.
    13. تواصل مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3).
  3. إعداد ملتصقة الصفائح الدموية وخلايا الأوعية الدموية-مونولاييرس
    1. إعداد طبق ثقافة الخلية (الخلايا المستزرعة)
      1. قبل معطف أطباق الثقافة خلية 35 ملم مع 1 مل الكولاجين ذيل الجرذ المخفف (30 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني تصفيتها عبر فلتر 0.2 ميكرون).
      2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتجاهل الحل الكولاجين، وغسل الطبق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    2. ثقافة خلايا الأوعية الدموية في أطباق الثقافة
      1. فصل الابتدائي (مثلاً، هوفيك, هاويك, هاوسمك) أو خلايا الأوعية الدموية مخلدة (مثلاً، عصام. Hy926، سفيك) ارتفع إلى التقاء في قارورة T75 مع 1.5 مل الخلية المفرزة الحل (مثلاً، أككوتاسي). إضافة 4.5 مل متوسط النمو المناسبة لتحييد الحل مفرزة الخلية وتحديد تركيز الخلية مع خلية العد الدائرة. تعليق الخلايا في 0.5 × 105 خلايا/مل في المتوسطة النمو المناسب (مثلاً، الخلية البطانية كاملة النمو المتوسطة).
      2. إضافة 2 مل تعليق خلية لكل طبق 35 ملم. ثقافة الخلايا في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى التقاء (أخذ ح 24 – 48، تبعاً لنوع الخلية).
    3. إعداد ساترة زجاجية (ملتصقة الصفائح الدموية)
      1. تزج ساترة زجاجية مرة في HCl-EtOH (1.2 متر/50% v/v).
      2. شطف ساترة 2 مرات في الماء عالي النقاوة.
      3. جاف ساترة تحت ن2.
      4. معطف قبل ساترة زجاجية مع 100 ميليلتر، وفقا لموقف القناة الدائرة نضح الفئران المخفف الذيل الكولاجين النوع الأول (30 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني تصفيتها عبر فلتر 0.2 ميكرون).
      5. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت وتجاهل الحل الكولاجين، وتغسل ساترة 3 x مع برنامج تلفزيوني.
      6. كتلة ساترة الكولاجين المغلفة مع جيش صرب البوسنة 1% في حبيس ح 0.5 في الرايت
      7. تغسل والجاف ساترة وجبل في قاعة التروية. عزل الصفائح الدموية من البشر أو الدم الماوس كما هو موضح في الخطوة 1، 1 أو 2-1، على التوالي.
    4. التثبيت من الصفائح الدموية
      1. إضافة 70 ميليلتر من 2 × 107/mL الصفائح الدموية تعليق كل قناة، واحتضان ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
      2. عناية استبدال الصفائح الدموية غير ملتصقة بعرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في حبيس) مدة 30 دقيقة على الأقل في متابعة الرايت مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3).
    5. تنشيط خلايا الأوعية الدموية أحادي الطبقة
      1. تنشيط الخلايا والأوعية الدموية بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة التي تحتوي على 10 α عامل نخر الورم نانوغرام/مليلتر (TNFα) ح 4 في 37 درجة مئوية و 5% CO2.

2-القائم على التدفق المقايسة مع خلايا موريني

  1. عزل الصفائح الدموية من الدم الماوس
    1. تخديره من سحب الدم من ثقب القلب باستخدام إبرة ز 21 (~ 1 مل) من (الكيتامين 80 ملغ/كغ وميديتوميديني 0.3 مغ/كغ) الأسبوع 6-8-الفئران القديمة (C57Bl/6) في سترات (3.2 في المائة) تخثر الدم.
    2. إضافة إلى حجم 1/6 لحوار التعاون الآسيوي.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 220 س ز، والفرامل متوسطة لمدة 5 دقائق للحصول على البلازما الغنية الصفائح الدموية (PRP).
    4. نقل المادة طافية (~ 600 ميليلتر) بالإضافة إلى 1/3 خلايا الدم الحمراء إلى أنبوب جديد
    5. الطرد المركزي في 95 ز العاشر دون الفرامل لمدة 6 دقائق.
    6. نقل المادة طافية (PRP) وقياس تركيز الصفائح الدموية في 1/10 إضعاف في المخزن المؤقت تيرودي (TH المخزن المؤقت: 136 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم هيبيس، 2.7 مم بوكل، 0.42 مم NaH2بو4* ح2س، 2 مم مجكل2، ألبومين المصل البقري 0.1% و 0.1% الجلوكوز) مع محلل الدم الآلي.
    7. تغسل الصفائح بإضافة المجلد 1/25 لحوار التعاون الآسيوي + 0.1 مليلتر يو أبيراسي، والطرد المركزي في 2,870 ز، فرامل متوسطة لمدة 2 دقيقة.
    8. تجاهل المادة طافية وإضافة 600 ميليلتر TH العازلة، المجلد 1/10 لحوار التعاون الآسيوي، وأبيراسي U/mL 0.1. قطع الحافة بيبيت (1000 ف)، يجعلها واسعة تتحمل، مما يساعد في منع تنشيط الصفائح الدموية، وتعلق بلطف بيليه.
    9. أجهزة الطرد المركزي في 2,870 ز، والفرامل متوسطة لمدة 2 دقيقة
    10. تجاهل المادة طافية وتعليق الصفائح بلطف في المخزن المؤقت لل.
    11. ضبط حجم الصوت بال المخزن المؤقت لتحقيق عد من 2 × 107/mL.
  2. إعداد مونولاييرس الصفائح الدموية ملتصقة
    1. إعداد ساترة زجاجية (الصفائح الدموية ملتصقة) حسب 1.3.3.
  3. التثبيت من الصفائح الدموية
    1. إضافة 100 ميليلتر من 2 × 107/mL الصفائح الدموية تعليق كل قناة، واحتضان ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    2. استبدال بعناية الصفائح الدموية غير ملتصقة بعرقلة الحل (5% جيش صرب البوسنة في هيبيس) مدة 30 دقيقة على الأقل في متابعة الرايت مع وضع العلامات الفلورية ونضح من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3)
  4. تنشيط ماوس الصفيحات أحادي الطبقة
    1. قبل التروية من الكريات البيضاء (الخطوة 3، 3)، حفز الصفائح نضح ثرومبين (0.5 nM) في المخزن المؤقت حصصة لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.

3. فلوري وسم ونضح من الكريات البيضاء (المجنحة أو THP-1 للإنسان و RAW264.7 أو وحيدات الماوس الأساسي للتحليل القائم على التدفق مورين)

  1. وسم نيون
    1. قم بتسمية الكريات البيضاء (1 × 106/mL) مع الحمض النووي الفلورية الخضراء خلية بيرمينت وصمة عار (1 ميكرومتر). احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. وقف الخلايا بتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل (5 مل كل شرط الاختبار، تبعاً لمعدل التدفق) في المخزن المؤقت للمقايسة، وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
  2. تدفق إعداد المقايسة الدائرة
    1. لالتصاق الكريات البيض في أحادي الطبقة خلية، تجاهل مستنبت الخلية من الطبق، وجمع في قاعة تدفق. قم بتوصيل أنابيب المحاقن. لالتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المعطل تداولها، قم بتوصيل الشريحة مايكرو المحاقن. قبل الحارة حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
    2. تأخذ حقنه التروية (50 مل)، المحاقن التثبيت على حامل حقنه، ومجموعة سحب المضخة على الوضع. تعيين حجم مضخة لمل 0، وتعيين القطر إلى 26.70 مم لحقنه 50 مل.
    3. قم بتوصيل موصل اللوير كوع واحدة من نهاية الأنبوب. ضع مقرنة قفل اللوير للمحاقن وتوصيل الأنابيب مع موصل اللوير الكوع المقرنة قفل اللوير. قم بتوصيل نهاية الأنابيب مجاناً إلى الدائرة تدفق.
  3. نضح الكريات البيض والالتصاق
    1. لالتصاق الكريات البيض في أحادي الطبقة خلية، تجاهل مستنبت الخلية من الطبق، وجمع في قاعة تدفق. قم بتوصيل أنابيب المحاقن. لالتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المعطل تداولها، قم بتوصيل الشريحة مايكرو المحاقن.
    2. لنضح الكريات البيض والالتصاق أكثر الأوعية الدموية-أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية، وضع الأنبوب الثاني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمقايسة وملء الأنابيب مع 1 مل بيبيت، ثم الضغط الأنابيب وتوصيله إلى دائرة تدفق.
    3. قبل التروية الكريات البيض، إضافة 3 مم كاكل2 و 2 مم مجكل2 إلى تعليق خلية واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. نتخلل الإنزيم المخزن المؤقت قبل التروية للخلايا لإزالة جوية محتملة من الدائرة والأنابيب.
    5. أغلق أنبوب ينتهي بالضغط على ضيق وتبديل الأنابيب من المخزن المؤقت للمقايسة إلى تعليق خلية، منع فقاعات الهواء من الوقوع. نتخلل الخلايا مع الإجهاد القص/معدل التدفق المناسب حتى تصل الخلايا الأولى.
    6. نتخلل الخلايا مع الإجهاد القص/معدل التدفق المناسب لمدة 2 دقيقة، والتقاط صور على الأقل 6 بين دقيقة 2-6 خلايا متجددة وملتصقة مجهر تباين/فلورية مرحلة مقلوب (مثلاً، أفوس-فلوريدا) استخدام التكبير X 100 متصل أن كاميرا رقمية CCD أو CMOS.
      ملاحظة: إجهاد القص/معدل التدفق يعتمد على تدفق الدائرة الأبعاد واللزوجة من بيرفوساتي. لنضح الدائرة المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: إجهاد القص (1 داين/سم2)
      Η: اللزوجة (0.015 داين * s/سم2)
      Φ: معدل التدفق (0.67 مل/دقيقة)
  4. التصاق الكريات البيض دي
    1. دياديسيون، تبديل الأنابيب من تعليق خلية إلى المخزن المؤقت للفحص بالضغط في الأنابيب، الحيلولة دون أن تصبح المحاصرين فقاعات الهواء.
    2. فصل الخلايا من نضح مع المخزن المؤقت للمقايسة مع التأكيد على معدل/قص تدفق مناسب (انظر 3.3.7 الملاحظة).
  5. التهجير الكريات البيض
    1. للتهجير الكريات البيض، نتخلل الكريات البيضاء (الخطوة 3) حتى تنضم كمية كافية من الكريات البيضاء (~ 50 عرض الخلايا/حقل).
    2. استبدال تعليق الكريات البيض مع المخزن المؤقت للمقايسة.
    3. سجل خلايا ترانسميجراتينج بواسطة الفاصل الزمني كل 10 – 15 ثانية لمدة 30 – 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

دراسة التصاق غشائي الكريات البيض، كانت perfused المسمى فلوريسسينتلي THP-1 خلايا أكثر TNFα-أو غير-حفز غشائي أحادي الطبقة لمدة 2 دقيقة في 3 داين/سم2. العدد الإجمالي للخلايا مونوسيتيك ملتصقة تحددها بعد 2 دقيقة من نضح التقاط 6 حقول مستقلة على مدى فترة من 2-6 دقيقة. تم قياس كمية الخلايا ملتصقة بالصور على الأقل 6 أسر مع مجهر تباين/فلورية مرحلة مقلوب (مثلاً، أفوس-فلوريدا) استخدام التكبير X 10 متصل بكاميرا CCD أو CMOS رقمية وأعرب المتوسط كخلايا ملتصقة/ مم2. عند تحفي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا التحليل في المختبر وسيلة مباشرة للتحقيق في الآليات الأساسية للتوظيف الكريات البيض أثناء التهاب الأوعية الدموية، ولكن هناك بعض النقاط الحرجة للإشارة إلى. الشرط الأول لنجاح إجراء هذا الفحص هو نضح من الكريات البيضاء حالها والمتلاقية الأوعية الدموية أو أحادي الطبقة الصفائح الدموية. هذا يمكن أن يتحقق بطلاء المسبقة للسطوح مع نوع الكولاجين أنا. بشكل عام، عند العمل مع الخلايا والأوعية الدموية الأولية، من المهم أن لطف فصل الخلايا باستخدام الحل الموصى به مفرزة المحتوية على كولاجيناز (انظر الجدول للمواد

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر الدكتور مارتن م. شميت وخط فرايموهس. هذا العمل كان تدعمه "مؤسسة هولندا" "البحث العلمي" (زونمو على 016.126.358 اندشتاينر مؤسسة بحوث نقل الدم (Nr. 1638) والألمانية الأوقيانوغرافية (SFB1123/A2) منحت إلى R.R.K.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المجهر الفلوري المقلوب على سبيل المثال EVOS-FLLife Technologies Europe bv
Pump على سبيل المثال < / em> الموديل: 210-CE& nbsp ؛ أدوات الدقة العالمية78-9210W
Falcon 35 مم TC المعالجة سهلة الإمساك بنمط صحن ثقافة الخليةcorning353001
50 مل حقنةBecton Dickinson300137
أنابيب سيليكون   ؛VWR228-0700
الكوع لور موصل ذكرIbidi10802
أنثى Luer Lock CouplerIbidi10823
غرفة التدفقمستشفى الجامعة RWTH Aachenبراءات الاختراع DE10328277A1: Baltus T ، Dautzenberg R ، Weber CPD. Str & ouml ؛ mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgä ngen an Zelloberfl & auml; تشين. 2005. 
Ibidi لزجة الشريحة السادس 0.4نفس المرجع80608
أغطية للشرائح اللاصقة نفس المصدر10812
الكولاجين النوع الأول ، ذيل الفئرانتقنيات الحياة أوروبا bvA1048301
مؤتلف إنسان نخر الورم الوراء- & ألفا ؛Peprotech300-01A
منشط مستقبلات الثرومبين للببتيد 6 (TRAP - 6)Anaspec / Eurogentec24191
SYTO 13 صبغة الحمض النووي الفلوري الأخضرLife Technologies Europe bvS7575
Hanks' محلول ملح متوازن 10xSigma-Aldrich ChemieH4641
محلول عازلة HEPES 1M ، سائلLife Technologies Europe bv15630049
BUMINATE Albumin ، 25٪ & nbsp ؛باكستر60010
ماء للحقنB. براون3624315
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتMerck102382 
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم Sigma-Aldrich ChemieM2670
ApyraseSigma-Aldrich ChemieA6535
الخلايا البطانية للوريد السري البشري الأولي (HUVEC)Promocell GmbHC-12203
وسط نمو الخلايا البطانية (جاهز للاستخدام)Promocell GmbHC-22010
الخلايا البطانية الأبهرية البشرية الأولية (HAoEC)ATCC& nbsp ؛ PCS-100-011
الوعائية القاعدية المتوسطة  ATCCPCS-100-030
مجموعة نمو الخلايا البطانية-BBEATCCPCS-100-040
خلايا العضلات الملساء الأبهري البشري الأولية (HAoSMC)ATCCPCS-100-012
مجموعة نمو خلايا العضلات الملساء الوعائيةATCCPCS-100-042
خط الخلايا البطانية البشرية ، EA.hy926ATCCCRL-2922
Dulbecco's خط الخلايا البطانية للفأر المتوسط المعدل (DMEM)ATCC30-2002
، SV 40 محول (SVEC4-10)ATCCCRL-2181
خط الخلايا البشرية الأحادية ، THP-1DSMZACC-16
RPMI 1640 مع Ultra-GlutamineLonzaBE12-702F / U1
أحادي الخلية / البلاعم RAW264.7ATCCTIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، ارتفاع نسبة الجلوكوزGibco11965092
AccutasePromocell GmbHC-41310
PercollSigma-Aldrich ChemieP1644
Histopaque 1119Sigma-Aldrich Chemie11191
10x PBSLife Technologies Europe bv14200075
BD  أنابيب جمع الدم البلاستيكية بالفراغ مع هيبارين الصوديومبيكتون ديكنسون367876
أنبوب VACUETTE 9 مل 9NC سيترات الصوديوم التخثر 3.2٪   ؛خليط Greiner Bio455322
حمض الهيدروكلوريك / EtOH (1.2 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك و 50٪ إيثانول) في الماءSigma-Aldrich Chemieتحضير عن طريق خلط 0.3 لتر حمض الهيدروكلوريك (4 مول / لتر) مع 0.7 لتر من 70٪ من الإيثانول في غطاء
الخلايا الدخان

المراجع

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559(2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مقايسة التدفق الصفائحيعزل الصفائح الدمويةغرفة التدفقإجهاد القصالخلايا البطانيةالمجهر الفلوريالتصاق الخلاياعامل نخر الورمتحفيز TRAP-6
القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.