مقالة منهجية

تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان

9.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

فبراير 27, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف أسلوب لتجزئة الأنواع هونتينجتين متحولة قابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من الماوس المخ والخلية والثقافة. الطريقة الموصوفة مفيدة للتوصيف والتحديد الكمي للتمويه البروتين هونتينجتين والإيدز في تحليل البروتين التوازن في منشأ المرض ووجود اضطرابات

الملخص

تراكم البروتينات تجمعات المركزية لعلم الأمراض في مرض هنتنغتون (HD) والعديد من اضطرابات الأعصاب الأخرى. على وجه التحديد، من السمات مرضية رئيسية هد الشاذة تراكم متحولة HTT (مت) البروتين في مجمعات عالية الوزن الجزيئي وداخل الخلايا إدراج هيئات مؤلفة من شظايا وغيرها من البروتينات. الأساليب التقليدية قياس وفهم وتشمل المساهمات المقدمة من مختلف أشكال المجاميع المحتوية على مت fluorescence مجهرية وتحليل لطخة غربية، وتصفية فخ فحوصات.

بيد أن معظم هذه الطرق هي تكيف محددة ولذلك قد لا تحل الدولة كامل مت البروتين التمويه نظراً للطبيعة المعقدة للذوبان الكلي والقرار.

لتحديد هوية مهتت مجمعة ومختلف أشكال معدلة والمجمعات، الانفصال و solubilization المجاميع الخلوية وشظايا إلزامي. هنا يصف لنا طريقة لعزل وتصور مهتت القابلة للذوبان، مونومرات، ليغومرات، والشظايا، وتراكم وزن الجزيئي عالية غير قابلة للذوبان (همو) الأنواع مهتت. مت حمو المسارات مع تطور المرض، يتوافق مع قراءات سلوك الماوس، وقد تم الاندماج عن طريق التضمين بعض التدخلات العلاجية1. هذا النهج يمكن استخدامها مع الماوس المخ والأنسجة المحيطية، وثقافة الخلية ولكن يمكن أن تتكيف مع نظم نموذجية أو المرض السياقات الأخرى.

المقدمة

تعطيل شبكات مراقبة جودة البروتين التي تكفل طي السليم وتدهور البروتينات الخلوية هو الوسطى المرجح لعلم الأمراض في مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، والأخرى "ميسفولدينج البروتين" اضطرابات2،3. ولذلك فهم مفصل لمكونات شبكة الاتصال بروتيوستاسيس ومساهماتها في علم الأمراض تعتبر حاسمة لتطوير تحسين التدخلات العلاجية. بسبب التوسع الشاذة من تكرار كاج داخل الجينات هد نتج عنه امتداد موسعة من بوليجلوتامينيس (polyQ) في هونتينجتين (HTT) البروتين4HD. ميزة مرضية متسقة في إمراضية عالية الدقة هو ميسفولدينج الناجمة عن ذلك، التراكم، وتجميع HTT في مناطق الدماغ والأنسجة المحيطية، التي أظهرت أن تتدخل في عدة طرق التوازن الخلية الطبيعية ووظيفة 5 , 6. HTT حين يتم التعبير عن أوبيكويتوسلي، والخلايا العصبية شوكي متوسطة في المخطط انتقائية الضعيفة والمتأثرة الأكثر صراحة مع ضمور القشرية الجديرة بالذكر أيضا المرتبطة بهد المرضية.

عادة خدمت تشكيل مجاميع HTT في الدماغ للمرضى عالية الدقة ونماذج حيوانية كعلامة وكيل لتطور المرض والسلبية المهيمنة للحصول على وظيفة مت7. على الرغم من أن آليات دقيقة من البروتين التي ميسفولدينج والتجميع قد تسهم السمية التي يسببها مت لا تزال غير واضحة، تشكيل هذه الإدراجات في الدماغ المرضى عالية الدقة ومختلف نماذج حيوانية سمة ثابتة ولا مفر منه. تضمينات تظهر أن تتألف إلى حد كبير من الشظايا HTT المتراكمة التي تحتوي على N--المحطة الطرفية توسيع polyQ، مشيراً إلى أن بروتيوليسيس وتجهيز كامل طول HTT فضلا عن بديل ذو8،وقد لعب9 قد تشكل دوراً هاما في الآلية المرضية للشظايا HTT ن hd.--المحطة الطرفية شكل باثولوجي HTT التي يمكن تجميع سريعاً، نوكلياتي، والتعجيل أو نشر عملية تجميع10.

ومع ذلك، وجود هذه تضمينات لا يرتبط بالضرورة مع السمية التي يسببها HTT أو خلية الموت11. واقترح للخضوع لعملية تجميع من مركب قابل لذوبان من خلال الأنواع القابلة للذوبان أوليجوميريك وييفات β-ورقة للمجاميع غير قابلة للذوبان وتضمينات12HTT. وقد حل هذه الأنواع المختلفة من البروتين عن طريق فحوصات الكيمياء الحيوية القياسية تحديا في الميدان نظراً لاستقرارها في المخزن المؤقت لتحلل منخفضة-المنظفات وصعوبة في تصور استخدام الاختبارات البيوكيميائية القياسية. وهكذا، الاعتبارات المنهجية الحاسمة في الكشف عن درجة ونمط مت المتراكمة ومجمعة.

وينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لتصور وسيطة العديد من HTT، على وجه التحديد تشكيل أنواع HTT حمو تستعصي على الحل الذي يظهر لتتبع عن كثب مع هد المرضية والأمراض التقدم1،13 ،14. التمكن من حل وتتبع الأنواع المتعددة من مت يوفر الباحثين أداة بيوكيميائية دراسة منشأ المرض وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة عن طريق التحوير وأثر على منشأ المرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان أخلاقيات الحيوان-أجريت تجارب صارمة وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة"، وبحوث حيوانية معتمدة لبروتوكول (لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية IACUC) في جامعة كاليفورنيا في إيرفين، معتمدة آآلاك المؤسسة. قدمت جميع الجهود المبذولة لتقليل معاناة الحيوانات.

1-إعداد المخازن المؤقتة لتحلل

  1. إعداد "القابلة للذوبان" المخزن المؤقت لتحلل (10 ملم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 1% تريتون العاشر 100، 150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪) وتصفية عقيمة خلال 0.22 ميكرومتر تصفية.
    1. عامل "القابلة لذوبان" تحلل من المخزن المؤقت، قياس N-اثيلماليميدي (NEM) ودقة تذوب في 100 مم فينيلميثيسولفونيل الفلوريد (بمسف) المذابة في 100% EtOH.
      ملاحظة: تحلل مثبطات المخزن المؤقت: (ط) 20 مم ن-اثيلماليميدي (NEM)؛ (ثانيا) 0.2 مم بمسف؛ (ثالثا) 1 مم أورثوفاناداتي الصوديوم (Na3فو4)؛ (رابعا) 1 ميكروغرام/مل ليوبيبتين؛ (ت) 1 ميكروغرام/مل أبروتينين؛ (سادسا) 20 مم فلوريد الصوديوم (NaF).
      تنبيه: ارتداء قناع لوجه عند العمل مع NEM في جميع أنحاء البروتوكول. ويجب بذل العمل تحلل المخزن المؤقت الطازجة لضمان مثبطات النشطة.
    2. تحلل القابلة للذوبان من المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز، إضافة مثبطات بالترتيب التالي: فلوريد الصوديوم (NaF)، ما يصل إلى حجم المخزن المؤقت لتحلل البارد، أورثوفاناداتي الصوديوم (Na3فو4) و Aprotinin وليوبيبتين.
  2. "غير قابلة للذوبان" تحلل من المخزن المؤقت، تكملة للحزب الديمقراطي الصربي 4% بإضافة 500 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 20% إلى 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل "سولوبلي". تترك في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: الحزب الديمقراطي الصربي سوف يعجل بها عندما أبقى على 4 درجة مئوية؛ الحفاظ على هذا في غرفة درجة الحرارة. التكوين "المخزن المؤقت لتحلل" النهائي: 10 ملم تريس (درجة الحموضة 7.4)؛ 1% Triton X-100؛ 150 مم كلوريد الصوديوم؛ والغليسيرول 10%؛ SDS 4% (غير قابلة للذوبان فقط).

2. بروتوكول تجزئة الذوبان/غير قابلة للذوبان

ملاحظة: انظر الشكل 1 لتخطيطي.

  1. قم بتسمية مجموعتين من أنابيب لكل عينة: "سولوبلي" و "تستعصي على الحل".
  2. إضافة ميليلتر X المثلج المخزن المؤقت القابلة للذوبان تحلل العامل تستكمل مع مثبطات البروتياز (انظر 1.1.1) للأنسجة.
    ملاحظة: X = حجم يختلف اعتماداً على كمية الأنسجة؛ انظر الجدول 1.
  3. للماوس أنسجة المخ (أي، المخطط)، دونس المسمى ببطء 30 مرة في الزجاج 1 مل دونسير وبيبيت في "الذوبان" أنبوب (الحفاظ على الجليد).
    ملاحظة: أن يكون حريصا على عدم كسر سطح السائل بعد بدء دونسينج، كما سوف تشكل فقاعات وقد تسفر عن التجانس غير مكتملة.
  4. للخلايا (أي، هيلا، HEK293T)، شطف خلايا مرة واحدة مع الباردة، 1 x PBS. إزالة برنامج تلفزيوني وتطبيق حد أدنى حجم المخزن المؤقت لتحلل الخلايا ورفع مع مكشطة الخلية.
    ملاحظة: لفوق خطوط الخلايا، خلايا مطلي في 5 × 105 خلايا كل لوح جيدا 6 ونمت بالقرب من كونفلوينسي. واحد أيضا مماثل لوحدات التخزين المستخدمة للمخطط الماوس.
  5. نقل هوموجيناتي أو خلية في المسمى، أنابيب "قابلة للحل" وعلى الجليد ح 1 (ساعة بدء بعد معالجة أنبوب النهائي).
    ملاحظة: للخلية ليساتيس، تريتوراتي عدة مرات لتفريق كتل الخلايا قبل ابتداء من الحضانة. تجنب تشكيل الفقاعات. باختصار دوامة النبض كل عينة ل 1 ثانية في منتصف الطريق من خلال ليسينج.
  6. الطرد المركزي عينات من 4 درجة مئوية في 15,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
  7. استعادة المادة طافية كجزء "سولوبلي".
    1. إزالة مع بيبيت، يجب الحرص على عدم تعكير طبقة بيليه/غائم كهذا سوف تلوث الكسر. كسر بيبيت القابلة للذوبان في "سولوبلي" المسمى الأنبوب. الحفاظ على الجليد.
  8. أغسل بيليه مع 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (x2) وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق بعد كل غسل؛ فلا بأس إذا كان بعض طبقة غائم هو بيبيتيد قبالة.
  9. بعد الغسيل النهائي، قم بإزالة جميع العازلة غسيل المتبقية تاركة فقط بيليه الأنسجة.
    ملاحظة: من هذه النقطة، عينات غير قابلة للذوبان ينبغي الآن أن يوضع في درجة حرارة الغرفة.
  10. ريسوسبيند بيليه مع المخزن المؤقت لتحلل X-ميليلتر وتستكمل مع الحزب الديمقراطي الصربي 4% (يمكن ضبط حجم اعتماداً على حجم بيليه؛ انظر الجدول 1).
  11. Sonicate كل عينة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة مع سونيكاتور مسبار (125 واط، 20 كيلوهرتز، النبض، السعة 40%، انظر الجدول للمواد).
  12. يغلي عينات (المتداول يغلي) لمدة 30 دقيقة؛ الطرد المركزي بإيجاز (15 ق) في 6,000 ز العاشر فيما يتعلق بعدم فقدان أي عينة.
  13. إجراء مقايسة البروتين DC (المنظفات متوافقة) (انظر الجدول للمواد) أو البروتين لوري قياس تركيز البروتين (أوصى بتخفيف بدأت من 1/5 للعينة في المخزن المؤقت لتحلل كل منهما لثقافة الخلية و 1/10 للأنسجة ليساتيس).
    ملاحظة: سيكون تركيزات البروتين قراءتها باستخدام مقايسة DC أو لوري بسبب ارتفاع تركيز المنظفات.
  14. الكوة عينات إلى 50 ميليلتر دفعات لتفادي تجميد أذاب القضايا.
    ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا قبل إجراء مزيد من التحليلات الكيميائية الحيوية عن طريق تخزين الكسور سواء عند-20 درجة مئوية.

3-الغربية وصمة عار والتقدير الكمي

  1. إجراء البقع الغربية كما ورد في مكان آخر1،13 بتمييع ميكروغرام 30 من عينة 1:1 في تحميل المخزن المؤقت (1.6 × تحميل صبغ، 1 x الحد).
    ملاحظة: 30 ميكروغرام من البروتين للكسر غير كافية، ولكن يمكن تعديلها للقرار الأمثل. 3-8% تريس-اسيتات بولي اكريلاميد الجل ينبغي أن تستخدم للكسر غير قابلة للذوبان. 4-وأوصت الجل تريس مكررا 12% للكسر القابلة للذوبان.
  2. يغلي عينات (المتداول يغلي) لأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي بإيجاز (15 ق) في 6,000 ز x لجمع العينة.
  3. تحليل الكسور جانب لطخة غربية، والحزب الديمقراطي الصربي-صفحة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة للحصول على نماذج انخفاض.
    ملاحظة: يحل أفضل عند نقلها على 0.45 ميكرومتر النيتروسليلوز الغشاء جزء غير قابل للذوبان. يمكن استخدام 0.45 أو 0.2 ميكرون النيتروسليلوز للكسر القابلة للذوبان، تبعاً لحجم بروتين الفائدة. قد تكون بعض التحسين المطلوبة لنقل أفضل المواد حمو.
  4. وصمة عار الغشاء مع البروتين كلها وصمة عار (مثلاً، ميمكودي، انظر الجدول للمواد) لتصور البروتين تحميل الكفاءة.
    ملاحظة: يمكن تحليل البقع الغربية بكثافة بكسل يعني. يمكن تطبيعها قابلة للذوبان لبروتين حفظ البيت أفضل ملاءمة للنظام التجريبي. تم التحقق من كسور غير قابلة للذوبان كوفرة البروتين النسبية تلطيخ البروتين عكسها أو تطبيع 3 هيستون على اسطوانة منفصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن الكشف عن قرار ليساتيس الخلية القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان بعد تجزئة استخدام فحوصات تأخر التحليل وتصفية الغربية (الشكل 2). على سبيل مثال، تم transfected الخلايا HEK293T استخدام كاشف تعداء (مثلاً، ليبوفيكتاميني 2000) ومع إكسون HTT يكرر كدنا ترميز 1 يحتوي على الجلوتامين 9715 تليها منطقة بولي برولين الغنية وسمح لهذه الخلايا إلى صريحة لتعامل الخلايا 44 h. مع أما مكم 5 MG132 حظر بروتوزوم أو [دمس] كعنصر تحكم ل 18 ساعة قبل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بعض الاحتياطات اللازمة للبروتوكولات المذكورة أعلاه لضمان تحقيق نتائج متسقة والكمية. أولاً، مت في كلا كسور عفوية ستشكل المجاميع مع مرور الوقت على عدة دورات ذوبان التجميد، لا سيما عندما تكون في تركيزات عالية. وبالتالي من الضروري تجميد مختبرين محضرات البروتين، وذوبان الجليد فقط حجم اللازمة قبل أن يعمل في التحليل كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. علاوة على ذلك، إذا كان جزء غير قابل للذوبان غلة مرسب الأبيض عند ذوبان الجليد، يلزم إعادة تشكيل s 5 إضافية sonication نبض، ويغلي مدة 5 دقائق، وإعادة كوانتيتاتيون قبل التحليل عن طريق ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-NS090390). ونود أيضا أن نشكر الدكتور جوان ستيفانفور المساعدة التقنية والمناقشة أثناء وضع هذا التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فلتر معقمMilliporeSCGP505REغطاء لولبي ، فلتر فراغ معقم
1 مل طاحونة مناديل ، DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModel Q125
DC فحص البروتينBiorad5000111 يمكن مقارنته
بمحلول عازلة Lowry Assay Tris 1MAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M حلTeknovaS0251
GlycerolFisherBP229-1
حل SDS 20٪TeknovaS0295
N-ethylmaleimideSigmaE1271
Phenylmethylsulfony flourideSigmaP7626إنشاء محلول مخزون 100 ملي متر بنسبة 100٪ EtOH ، مخزن في 4 درجات ؛ C
orthovanadate الصوديومSigmaS6508قم بإنشاء محلول مخزون 0.5M في الماء
LeupeptinSigmaL2884إنشاء محلول مخزون 10 مجم / مل في الماء
أبروتينينسيجماA1153إنشاء محلول مخزون 10 مجم / مل في الماء
فلوريد الصوديومSigmaS4504إنشاء محلول مخزون 500 ملي في الماء
مضاد ل HTTMilliporeMAB5492استخدم 1: 1000 للبقعة الغربية ، 1: 500 لمقايسة تأخر المرشح
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875استخدم 1: 1000 للبقعة الغربية القابلة للذوبان

المراجع

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة