العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

ملخص

قد أعيقت الجهود المبذولة لفهم الدالة ميكروجليال بالتفصيل بعدم وجود نماذج الثقافة ميكروجليال أن الخص خصائص ناضجة في فيفو microglia. ويصف هذا البروتوكول نهج العزلة والثقافة تهدف إلى المحافظة على بقاء قوية من microglia الفئران الناضجة متشعب جداً في ظل الظروف المحددة والمتوسطة.

الملخص

Microglia تمثل 5-10% من جميع خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) وهي تزداد لفت الانتباه نظراً لمساهماتها خلال التنمية، والتوازن، والمرض. على الرغم من أن قد درست بالتفصيل الضامة لعقود، وميزات متخصصة من microglia، الضامة المقيم في الأنسجة من الجهاز العصبي المركزي، فقد ظلت غامضة إلى حد كبير، جزئيا بسبب أوجه القصور في القدرة على تلخيص microglial ناضجة خصائص في الثقافة. نحن هنا، لتوضيح إجراءات واضحة لعزل السريع microglia نقية من الدماغ القوارض ناضجة. كما يصف لنا ثقافة خالية من المصل الظروف التي تدعم مستويات عالية من السلامة ميكروجليال على مر الزمن. معرض Microglia المزروعة تحت هذه الشروط المعرفة المتوسطة وضع العمليات متشعب ومراقبة ديناميكية السلوك. علينا توضيح بعض آثار التعرض للمصل على microglia مثقف ومناقشة كيف يمكن مقارنة هذه الثقافات خالية من المصل لكل الثقافات المعرضة للمصل، فضلا عن microglia فيفو.

المقدمة

الضامة حمة الجهاز العصبي المركزي، microglia التفاعل مع مجموعة واسعة من الدوائر العصبية والشبكات مما يشير إلى الدبقية. أنها تلعب دوراً حيويا في التنمية والتوازن في الدماغ من خلال تشذيب متشابك وإزالة الخلايا أبوبتوتيك وتفاعلات عابرة مع العمليات العصبية^1،2. Microglia هم أوائل المستجيبين للإصابات العصبية، توسيع نطاق عملياتها طويلة ورقيقة إلى مواقع الآفة لتنسيق الاستجابات التحريضية وتحد من النزيف^3،4. التغييرات في مورفولوجيا microglial ووظيفتها في كل مكان في إصابات الجهاز العصبي المركزي الحادة والمزمنة، ومعرض microglia تتغير مورفولوجيا، والترجمة، والتعبير عن وسطاء التهابات في مجموعة متنوعة من الأمراض الدول¹. وتشير الدراسات الجينية البشرية إلى أن الطفرات التي تغير من خطر الإصابة بأمراض الأعصاب وكثيراً ما يغلب أو حصرا يعرب عنها ميكروجليا في الجهاز العصبي المركزي سليمة، مشيراً إلى دور حاسم ل microglia في إمراضية المرض أو التقدم⁵ . ونظرا لشهرتهم في الإصابة والمرض، الفهم للبيولوجيا ميكروجليال أولوية عالية لتطوير النهج العلاجية الجديدة.

نشأت العديد من التطورات الهامة لفهم علم الأحياء ميكروجليال باستقراء التقنيات والآليات التي اكتشفت في الدراسات المتعلقة بالسكان بلعم الأخرى بما في ذلك تعريفات وظيفية وملامح التعبير الجيني وأساليب الثقافة /المورفولوجية الدول. على الرغم من أن تعميم بلعم وظائف غالباً ما تلعب بها بطرق مفاجئة داخل المشهد الجهاز العصبي المركزي، ميكروجليا هم أنفسهم درجة عالية من التخصص، نستعرض مورفولوجيا متشعب وتوقيع تعبير جينات فريدة أن مجموعات منهم إلى جانب غيرها من النسيج الضامة⁶. وقد Microglia نسب التي تختلف عن معظم الأنسجة الضامة؛ أنها استعمار في الجهاز العصبي المركزي خلال موجه جنينية مبكرة من هيماتوبويسيس البدائية وتجديد ذاتيا في جميع مراحل الحياة، مستقلة عن مساهمات نهائية هيماتوبويسيس⁷. توقيع التعبير الجيني ناضجة تماما من microglia الكبار لا يتحقق حتى بعد الولادة في الأسبوع الثاني⁸. منبهات البيئية من الأنسجة المحيطة دوراً رئيسيا في إملاء بلعم الأنسجة الخاصة ميزات⁶، التي تشمل التعرض المحدود لعوامل المنقولة بالدم الممنوحة من حاجز الدم في الدماغ⁹في الجهاز العصبي المركزي.

وهي عقبة واحدة لفهم كامل الاشتراكات ميكروجليال للتوازن في الجهاز العصبي المركزي والمرض صعوبة لخص الخصائص المتخصصة من microglia ناضجة ينظر في فيفو مع الخلايا المنقي في المختبر. تم تطوير العديد من الأساليب لعزل والثقافة microglia سليمة، ولكن معظم النهج المتبعة تعتمد على مصل لدعم بقاء الخلية. وقد أظهرنا أن إضافة مصل الدم، الذي هو طبيعته متغير كاشف التي تحتوي على مجموعة واسعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا، وهي إشكالية بصفة خاصة عند العمل مع ميكروجليا لأنه يشجع مورفولوجيا أميبية، زاد انتشار، و غالباً ما ينظر البلعمه زيادة⁹ في فيفو عندما يتعرض microglia الدم تتحمل العوامل بعد تعطل حاجز الدم في الدماغ. بهذه المقاييس، تشبه الخلايا المعرضة للمصل microglia في الإصابة أو المرض الدول، ولكن خفضت هذه التعديلات عندما تستزرع microglia في المتوسطة النمو المحددة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي-1 (أو إيل-34)، TGF-β، ونسبة الكولسترول في الدم، وسيلينيت.

يوفر هذا البروتوكول التفاصيل لاستزراع microglia الفئران الأحداث تحت ظروف خالية من المصل، المتصلة بالأعمال المنشورة مؤخرا⁹. هذا البروتوكول قد تم تبسيطها للفئران من يوم الولادة 21-30 (P21-P30)، ولكن يمكن تكييفها لعزل ميكروجليا من الفئران والجرذان في أي عمر، على الرغم من أن العائد والجدوى الشاملة سوف تختلف باختلاف الأنواع وسن الحيوان. الأعلى غلة وبقاء الأمثل يتحقق عند استخدام microglia قليلاً غير ناضجة (~ P9)، والغلات وجدوى مستدق تدريجيا إلى حد ما انخفاض مستويات في الحيوانات الكبار. ميكروجليا يمكن أيضا أن تكون معزولة من الفئران، ولكن وجدنا أن خلايا الفئران إظهار أعلى بكثير الغلات والجدوى، وتعقيد مورفولوجيس متشعب، عند مقارنتها بالماوس الخلايا في ثقافات خالية من المصل. الحيوانات أعمارهم أكبر من P50 لم يتم تقييمها مع هذا البروتوكول. وقد تم تحسين هذا الإجراء العزلة إيمونوبانينج لتقليل التغيرات في microglial النسخي التشكيلات الجانبية أثناء العزلة وإلى أقصى حد ممكن بقاء المتلقين للمعلومات من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات والصياغات وسائل الإعلام، يمكن أن يستمر الثقافات العالية الجدوى الأولية لمدة أسابيع. يحمل مورفولوجيا متشعب جداً التي تنطوي على التوسع السريع وتراجع عمليات Microglia مثقف في ظل هذه الظروف ومعدلات انتشار منخفضة نسبيا. نحن تسليط الضوء على أهمية المصل-التعرض على هذه الخصائص، ومناقشة مواطن القوة والضعف لهذه الطريقة بالنسبة للطرق الأخرى.

البروتوكول

جميع الإجراءات التي تنطوي على القوارض تتفق مع المبادئ التوجيهية لجامعة ستانفورد، التي تمتثل للسياسات الوطنية وقوانين الدولة و. وافق جميع الإجراءات الحيوان "الفريق الإداري" في جامعة ستانفورد في "مختبر رعاية الحيوان".

ملاحظة: ترد جميع التراكيب الحل والمخزن المؤقت في الجدول للمواد.

1-إعداد طبق بيتري ل CD11b إيمونوبانينج (يوم 0)

ملاحظة: إعداد طبق إيمونوبانينج 1 لكل أدمغة الفئران الأحداث 1-2.

1. إضافة 25 مل من 50 مم تريس pH 9.5 الحل إلى طبق بتري 15 سم.
2. إضافة الماعز الماوس المضادة IgG (سلاسل H + L) إلى الطبق لتركيز نهائي من 6 ميكروغرام/مل. دوامة لوحة توزيع بالتساوي.
3. احتضان الطبق ح 1-3 في 37 درجة مئوية.
4. ثم استبدال شطف الأطباق ثلاث مرات مع دببس⁺⁺ (فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع Ca^{2 +} و Mg^{2 +})، مع حل للغسل مخزن يحتوي على 1 ميكروغرام/مل جسم OX42. ترك الأطباق بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو.

2-الأنسجة جمع (1 يوم)

ملاحظة: يجب أن تأخذ هذا البروتوكول ح ~ 3-4.

1. قبل البدء، ضمان جميع الحلول عقيمة ومبردة على الثلج. تشيل جميع الصكوك المتعلقة بالجليد وتعقيم مع الإيثانول قبل استخدامها.
2. في أعقاب الإجراءات التنظيمية المناسبة، التضحية الفئران مختبرية الأحداث بالخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، الحيوانات الأصغر سنا يجوز التضحية بجرعة قاتلة من الكيتامين/إكسيلازيني (100-200 ميليلتر من الكيتامين 24 ملغ/مل، 2.4 ملغ/مل xylazine). يجب استخدام الكيتامين/إكسيلازيني إذا كانت الحيوانات أقل من 14 يوما عمر. في حالة استخدام الحيوانات متعددة، انتزاع الأنسجة من الحيوانات واحد ووضعه في مبردة مسبقاً دببس⁺⁺ على الجليد قبل الانتقال إلى الحيوانات اللاحقة.
3. قرصه هيندباو وضمان مشكلة عدم استجابة كاملة من الحيوان قبل المتابعة.
4. ترانسكارديالي نتخلل الحيوان مع 10-30 مل من نضح المثلج المخزن المؤقت باستخدام إبرة 27-ز حتى يتم تشغيل المخزن المؤقت واضحة.
   ملاحظة: حجم المخزن المؤقت نضح تتنوع تبعاً للحجم/عمر الحيوان.
5. فورا بعد نضح إزالة رأس الحيوان. تأتي من النخاع الشوكي قطع اللقمة والقفويه على كل جانب مع مقص التشريح، ينبغي الحرص على عدم الأضرار الدماغ. بعد قطع تقطيع كل جانب بعناية، إلى جانب واحد على طول الجداري وعظم جبهي نحو عظم الآنف. مع الملقط بعناية سحب الجزء العلوي من الجمجمة بسرعة إزالة الدماغ (أو هياكل الجهاز العصبي المركزي للفائدة) ووضع في مبردة مسبقاً دببس⁺⁺ على الجليد.
6. كرر لكل الحيوانات المتبقية.
   ملاحظة: ينبغي إجراء جميع خطوات المتابعة في غطاء الاندفاق الصفحي تحت ظروف معقمة مناسبة.

3-ميكانيكية الانفصال (1 يوم)

1. بعد أن تم جمع جميع العقول، ختم الدماغ واحد إلى 1 ملم³ قطع في طبق بتري على الجليد بشفرة المبضع بارد، ونقل إلى الخالطون دونس المثلج مع 5-7 مل دونسينج المثلج المخزن المؤقت. تنأى الدماغ واحد في وقت واحد.
2. ننأى بالانسجة باستخدام 10-20 السكتات الدماغية لطيف وغير مكتملة مع الخالطون دونس فضفاضة لتركيب. الحرص على عدم سحق الأنسجة في الجزء السفلي من الخالطون صورة مباشرة، ولكن بدلاً من ذلك تدفع الأنسجة من خلال الفضاء بين الجانبين للمكبس والخالطون.
3. بعناية إزالة المكبس منع إدخال فقاعات الهواء. السماح لقطع الأنسجة ضعيفة منفصلان لتسوية لأسفل الخالطون، ونقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 50 مل مثلجة جديدة.
4. استبدال وحدة إزالة المخزن المؤقت دونسينج الطازجة، وكرر الخطوات من 3، 2 و 3-3 لمدة 3-4 جولات، أو حتى قد تم فصل جميع الأنسجة. كرر هذا الإجراء لكل الدماغ.

4-المايلين إزالة (1 يوم)

ملاحظة: يتم استخدام إزالة المايلين لعزل ميكروجليا من الحيوانات أقدم P12.

1. قياس حجم تعليق خلية في أنبوب 50 مل المخروطية باستخدام ماصة 25 مل، ثم إضافة المخزن المؤقت دونسينج المثلج لضبط الحجم الإجمالي لمل 33.5.
2. إضافة 10 مل من المايلين العازلة الفاصلة (MSB) إلى تعليق خلية ومزيج دقيق بعكس الأنبوبة عدة مرات. وهذا سيؤدي إلى 23% تركيز MSB نهائي في وحدة تخزين 43.5 مل.
3. الطرد المركزي خلايا لمدة 15 دقيقة في 500 غرام x عند 4 درجة مئوية مع الكبح بطيئة.
   ملاحظة: ينبغي أن أجهزة الطرد المركزي حوالي 1.5-2 دقيقة يتباطأ. سيؤدي هذا إلى إنشاء طبقة علوية من المايلين والحطام خلية ميتة، ومن المادة طافية غامضة إلى حد ما وبيليه أصغر الذي هو إثراء للخلايا الحية.
4. قم بإزالة الطبقة العليا من المايلين/الحطام والمادة طافية مع ماصة. العناية عند إزالة الطبقة العليا لضمان كما أن الكثير من ذلك هو إزالة قدر الإمكان.
5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 12 مل من الغسل المخزن المؤقت. تريتوراتي برفق بتعليق خلية لتفريق أي كتل من الخلايا التي قد تبقى.

5-إيمونوبانينج (1 يوم)

1. يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة الحطام كبير أو كتل الخلية.
2. شطف الطبق الغسل المغلفة OX42 ثلاث مرات مع دببس⁺⁺. لا تسمح اللوحة ليجف تماما بين يغسل.
3. من أجل إيقاف الغسيل دببس⁺⁺ الماضي وتطبيق تعليق الخلية التي تم تصفيتها للطبق الغسل. بلطف دوامة لوحة توزيع الخلايا، ثم احتضان لوحة على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا الالتزام. عدم احتضان أطول من 20 دقيقة أو الخلايا ستصبح صعبة جداً للتعافي من الطبق.
4. شطف الطبق الغسل مع دببس⁺⁺ 10 مرات لإزالة الخلايا غير ملتصقة. سوف يكون ميكروجليا بشدة تعلق على اللوحة، حتى دوامة اللوحة مع كل شطف التأكد من إزالة الخلايا غير ملتصقة الأخرى.
5. من أجل إيقاف الغسيل دببس⁺⁺ الماضي واستبدال مع 15 مل دببس⁺⁺ و 200 ميكروليتر التربسين (1.25% حل الأسهم).
6. احتضان الطبق لمدة دقيقة دي وان زيرو على 37 درجة مئوية مع 10% CO₂ تريبسينيزي.
   ملاحظة: لا تستمر فترة أطول من 10 دقائق أو microglia سوف يصبح من الصعب إزالته.
7. بعد 10 دقائق من تريبسينيزيشن، سوف لا يزال عالقاً microglia للوحة. من أجل إيقاف التربسين/دببس⁺⁺ وتغسل بلطف x 2 مع دببس⁺⁺ لإزالة التربسين، استبدال مع 12 مل من microglia المثلج النمو المتوسطة (أم جي أم).
8. مكان الغسل طبق على الجليد لمدة 2 دقيقة لمساعدة يضعف التفاعل خلية/الركازة، وتأكد من أن الطبق مسطح لمنع جفاف المناطق طبق الغسل.
9. "الماصة؛" بقوة مع 10 مل ماصة وبيبيت تحكم بسرعة عالية لاستعادة الخلايا من طبق الغسل. رسم شبكة 16 × 16 مع تيار السائل من الماصة في محاولة لإزالة كافة الخلايا.
10. فحص الخلايا تحت مجهر في 20 X التكبير للتأكد من فصل خلايا من اللوحة. البقع علامة على رأس طبق فيها خلايا تزال عالقة، وتكرار بيبيتينج في تلك المناطق.
11. جمع تعليق خلية والكوة 3-4 مل من المادة طافية كل 15 مل الأنبوبة المخروطية. تدور لمدة 15 دقيقة في 500 غرام x عند 4 درجة مئوية مع الكبح بطيئة.
    ملاحظة: الغزل microglia من خلال وحدة تخزين صغيرة يسمح لاسترداد الحد الأقصى من الخلايا.
12. نضح المادة طافية، تاركاً 0.5 مل من أم جي أم مع بيليه الخلية.
13. ريسوسبيند كل بيليه في MGM المتبقية، وتجمع الخلايا من جميع الأنابيب.
14. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
15. لوحة الخلايا كما هو موضح في الخطوات 6-7 استناداً إلى التطبيق.
16. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 10%₂.
    ملاحظة: يمكن خلايا الثقافة لتصل إلى 3-4 أسابيع مع التغييرات الوسائط العادية أو أسبوع واحد مع أية تغييرات في وسائل الإعلام.

6-بقعة طلاء زراعة الأنسجة لوحات/كوفيرسليبس (1 يوم)

1. لوحة 15 ميليلتر لطلاء الكولاجين الرابع مباشرة في وسط لوحة 24-جيدا أنيونى/الموجبة زراعة الأنسجة المغلفة (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO₂.
2. بعد عد الخلايا مع الخلايا هيموسيتوميتير مخفف إلى 2.3 × 10⁵/mL في MGM. نضح بقعة الكولاجين الرابع وعلى الفور لوحة 15 ميليلتر من تعليق خلية لهذا المكان؛ وهذا سيعطي 3.5 × 10³ خلايا/البقعة. احتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO₂ السماح بالالتزام، وإضافة 500 ميليلتر من أول أكسيد الكربون_2-اكويليبراتيد TGF-β2/إيل-34/الكوليسترول تتضمن النمو المتوسطة (عرة) الخلايا بلطف إلى البئر.
3. إذا كان الطلاء في كوفيرسليبس، كوفيرسليبس زجاج معقمة معطف الأولى مع 10 ميكروغرام/مل حيلة-د-يسين (PDL) في ح₂س لح 1 في الرايت، يغسل 3 مرات مع ح₂س، واسمحوا جافة في غطاء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وبمجرد كوفيرسليبس الجافة، المضي قدما في بقعة الطلاء على كوفيرسليبس كما هو موضح في "الخطوة 6-2".

7-طلاء لعزل الحمض النووي الريبي/البروتين

1. في يوم 1، معطف المنطقة بأكملها من 24-جيدا أنيونى/الموجبة المغلفة صفيحة زراعة الأنسجة مع الكولاجين الرابع طلاء واحتضانها لدقيقة 10-1 ح في 37 درجة مئوية مع 10% CO₂، ثم إزالة وفورا لوحة 3-5 x 10⁴ خلايا/بئر في CO₂ اكويليبراتيد عرة وسائط الإعلام.
2. في اليوم 2، إجراء تغيير وسائط 50% لكل جيدا اليوم بعد إعداد. الخلايا الميتة تميل إلى المجموعة في وسط البئر، حتى تأخذ وسائل الإعلام من هناك.
3. إجراء تغيير وسائط 50% كل 2-3 أيام للحفاظ على الثقافات. في حالة إدخال تغييرات الوسائط متغير غير المرغوب فيها للثقافات، خلايا يمكن البقاء على قيد الحياة لمدة أسبوع واحد تقريبا دون أي تغييرات وسائل الإعلام، مقابل أكثر من 3 أسابيع مع أعمال الصيانة العادية.

النتائج

ويصف هذا البروتوكول أسلوب إلى ثقافة عالية النقاء تتفرع microglia من الفئران الأحداث. نتائج مماثلة يمكن الحصول عليها باستخدام الحيوانات غير ناضجة، والفترة المحيطة بالولادة، والكبار، كما هو مبين أدناه. إذ غالباً ما تتضمن الخلية العزلة المفروضة الفروق الدقيقة والعديد من الفرص للخلايا للموت، استخدمنا نقاط التفتيش لمراقبة الجودة للمساعدة في تحديد النجاح في الخطوات المختلفة. ونحن عادة رصد تعليق خلية باستخدام هيموسيتوميتير في خطوات متعددة في البروتوكول العزلة (الشكل 1A

المناقشة

لأنه بمثابة microglia الخلايا المناعية الحارس من الجهاز العصبي المركزي، فتستجيب للغاية للتغييرات البيئية؛ ولذلك، مطلوب قدر كبير من العناية لتقليل الاستجابات التحريضية داخل الخلايا أثناء عزلتها والثقافة⁸. ويتم ذلك في هذا البروتوكول من خلال السرعة ودرجة الحرارة. حفظ الخلايا على الجليد أو عند 4 درجة مئوية كلما أمكن يقلل كثيرا من التنشيط، حيث تجري جميع خطوات استخدام الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، يتم perfused الحيوانات مع المخزن المؤقت لنضح المثلج، وتم تبسيط البروتوكول لتقليل الوقت بين الأنسجة استخرا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الجرذ: Sprague-Dawley	Charles River	Cat # 400
فأر مضاد للفئران CD11b أحادي النسيلة (استنساخ OX42)	Bio-Rad	Cat # MCA275R	Panning: 1: 1,000 ؛ تلطيخ: 1:500
الماعز متعدد القولون المضاد ل Iba1	Abcam	Cat # AB5076	تلطيخ: 1:500
أرنب متعدد النسيلة مضاد ل Ki67	Abcam	Cat # AB15580	تلطيخ: 1:500
Alexa Fluor Donkey مضاد للفأر 594	Invitrogen	Cat # 11055	تلطيخ: 1:500
Alexa Fluor Donkey مضاد للماعز 488	Invitrogen	Cat # A-21203	تلطيخ: 1:500
Alexa فلور دونكي مضاد للأرانب 647	Invitrogen	Cat # A-31573	تلطيخ: 1: 500
Triton-X (منظف في تلطيخ ICC)	Thermo Fisher	Cat # 28313
Heparan كبريتات	Galen مستلزمات مختبر	Cat # GAG-HS01
Heparin	Sigma   ؛	Cat # M3149
الببتون من مواد صلبة الحليب	Sigma	Cat # P6838
TGF- &&beta ؛ 2	Peprotech	Cat # 100-35B
Murine IL-34	R & D Systems	Cat # 5195-ML / CF
كوليسترول صوف الأغنام	Avanti Polar Lipids	Cat # 700000P
كولاجين IV	Corning	Cat# 354233
حمض الأوليك	كايمان للكيماويات	Cat# 90260
11 (Z) Eicosadienoic (Gondoic) حمض	كايمان للكيماويات	Cat # 20606
Calcein AM صبغة	Invitrogen	Cat # C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat # E1169
DNaseI	Worthington	Cat # DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat # 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat # T9935
DMEM / F12	Gibco	Cat # 21041-02
Penicillin / Streptomycin	Gibco	Cat # 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat # 25030-081
N-acetyl cysteine  ؛	سيجما	كات # A9165
الأنسولين	سيجما	القط # 16634
Apo-transferrin	سيجما	كات # T1147
سيلينيت الصوديوم	سيجما	القط # S-5261
DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز)	جيبكو	كات # 11960-044
دابي فلورومونت-جي	الجنوب للتكنولوجيا الحيوية	القط # 0100-20   ؛
بولي د-لايسين	Sigma	Cat # A-003-E
ألواح Primaria   ;	VWR	Cat # 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock recodes  < / قوي >
Apo-transferrin			إعادة التكوين: 10 مجم / مل في PBS التركيز المستخدم: 1: 100 التخزين: -20 درجة ؛ C
N-أسيتيل السيستين			إعادة التكوين: 5 ملغ / مل في H2O التركيز المستخدم: 1: 1،000 التخزين: -20 درجة ؛ C
إعادة تكوين سيلينيت			الصوديوم: 2.5 مجم / مل في H2O التركيز المستخدم: 1: 25،000 التخزين: -20 درجة ؛ إعادة
C Collagen IV			: 200 مو ؛ جم / مل في PBS التركيز المستخدم: 1: 100 التخزين: -80 درجة ؛ إعادة تكوين C
TGF-b2			: 2 مجم / مل في PBS التركيز المستخدم: 1: 1،000 التخزين: -20 درجة ؛ إعادة
C IL-34			: 200 & mu ؛ جم / مل في PBS التركيز المستخدم: 1: 1،000 التخزين: -80 درجة ؛ C
إعادة تكوين كوليسترول			صوف الأغنام: 1.5 مجم / مل في 100٪ إيثانول التركيز المستخدم: 1: 1،000 التخزين: -20 درجة ؛ C
إعادة تكوين كبريتات			الهيباران: 1 مجم / مل في H2O التركيز المستخدم: 1: 1،000 التخزين: -20 درجة ؛ C
حمض الأوليك / حمض			إعادة التكوين: الجندويك: 0.001 مجم / مل ؛ الأوليك: 0.1 مجم / مل في 100٪ إيثانول التركيز المستخدم: 1: 1،000 التخزين: -20 درجة ؛ إعادة
الهيبارين			C: 50 مجم / مل في PBS التركيز المستخدم: 1: 100 التخزين: -20 درجة ؛ C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions  < / قوي >
العازلة			للتروية: 50 مو ؛ جم / مل من الهيبارين في DPBS ++ (PBS مع Ca ++ و Mg + +) التعليقات: استخدم عند المثلج
العازلة			Douncing: 200 & mu ؛ L من 0.4٪ DNaseI في 50 مل من DPBS ++ التعليقات: استخدم عند المثلج
المقلاة العازلة			: 2 مجم / مل من البيبتون من المواد الصلبة للحليب في DPBS + +
Microglia Growth Medium (MGM)			الوصفة: DMEM / F12 يحتوي على 100 وحدة / مل البنسلين ، 100 مو ؛ جم / مل ستربتومايسين ، 2 ملي جلوتامين ، 5 مو ؛ جم / مل N-أسيتيل سيستين ، 5 مو ؛ جم / مل الأنسولين ، 100 مو ؛ جم / مل apo-transferrin ، و 100 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم تعليقات: استخدم MGM المثلج البارد لتحريك الخلايا الدبقية الصغيرة من طبق immnopanning.
		الكولاجين الرابع	: MGM تحتوي على 2 & mu ؛ جم / مل من الكولاجين IV
فصل المايلين			: 9 مل Percoll PLUS ، 1 مل 10x PBS بدون Ca ++ و Mg ++ ، 9 & mu ؛ L 1 م CaCl2 ، 5 & L 1 M MgCl2 تعليقات: تخلط جيدا بعد إضافة   CaCl2 و MgCl2
TGF-b2 / IL-34 / الكوليسترول المحتوي على وسائط النمو (TIC)   ؛			الوصفة: MGM تحتوي على الإنسان 2 نانوغرام / مل TGF-b2 ، 100 نانوغرام / مل الفئران IL-34 ، 1.5 & جم / مل من كوليسترول صوف الأغنام ، 10 مو ؛ جم / مل كبريتات الهيباران ، 0.1 مو ؛ جم / مل حمض الأوليك ، و 0.001 مو ؛ جم / مل حمض الجندويك تعليقات: تأكد من إضافة الكوليسترول إلى الوسائط الدافئة إلى 37 درجة ؛ C ولا تضيف أكثر من 1.5 & mu ؛ جم / مل أو سوف يترسم. لا تقم بتصفية الوسائط المحتوية على الكوليسترول. قم بموازنة وسائط TIC مع 10٪ CO2 لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة قبل إضافتها إلى الخلايا لضمان درجة الحموضة المثلى.

تكوين تشكيل الجندويك تكوينوصفة البارد وصفةوصفةوصفة طلاء وصفة