Method Article

إجراء شامل تقييم أداء نيوفاسكولاريزيشن هيمانجيوبلاستوما المفترضة استخدام كروي تنتشر في التحليل في المختبر

DOI:

10.3791/57183

⸱

April 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتعرض هذه الورقة إجراء شامل لتقييم في المختبر ما إذا كان يوجد ورم الكلاسيكية تولد الأوعية في هيمانجيوبلاستوماس (HBs) ودورها في ميزانيات. وتسليط الضوء على الطابع المعقد لغبطة-نيوفاسكولاريزيشن النتائج توحي بأن هذا النموذج الموحد لتولد الأوعية فقط إليه تكميلية في غبطة-نيوفاسكولاريزيشن.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المنظمة الجينات القامع الورم فون هيبل-لينداو (VHL) يلعب دوراً حاسما في تطوير هيمانجيوبلاستوماس (HBs) داخل النظام العصبي المركزي (CNS) البشرية. ومع ذلك، أصل الخلوية وعملية تطورية من ميزانيات (بما في ذلك نيوفاسكولاريزيشن) تظل مثيرة للجدل، والأوعية المناهضة ل VHL-HBs، استناداً إلى الكلاسيكية غبطة الأوعية، أسفرت عن نتائج مخيبة للآمال في التجارب السريرية. هو إحدى العقبات الرئيسية للترجمة السريرية الناجحة لعلاج الأوعية الدموية المناهضة الافتقار إلى فهم دقيق نيوفاسكولاريزيشن في هذا الورم والأوعية الدموية. في هذه المقالة، نقدم إجراء شامل لتقييم في المختبر ما إذا كان يوجد ورم الكلاسيكية تولد الأوعية في ميزانيات، فضلا عن دورها في ميزانيات. مع هذا الإجراء، يمكن أن دقة فهم تعقيد neovascularization غبطة الباحثين وتحديد وظيفة هذا النموذج الموحد للأوعية في ميزانيات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتقييم العلاج المضادة الأوعية الدموية الواعدة للأورام، التي لديها إمكانات متعدية الجنسيات عالية لعلاج الأورام أو للمعاونة في الاستغلال الأمثل لعلاج الأوعية المضادة HBs في المستقبل الترجمات. وتسليط الضوء على الطابع المعقد لغبطة neovascularization النتائج توحي بأن هذه الأوعية النموذج الموحد فقط إليه تكميلية في neovascularization غبطة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemangioblastomas (HBs) هي أورام حميدة في الأوعية الدموية التي تم العثور عليها حصرا داخل الإنسان الجهاز العصبي المركزي (CNS). أنها تتطور في المرضى الذين يعانون من مرض فون هيبل-لينداو (VHL) أو الآفات متفرقة. VHL-هكسابايت يصعب علاج من خلال العلاج الجراحي بسبب تكرار المتكرر والآفات المتعددة التي تنجم عن هذا الوراثية واضطراب1. على الرغم من أن المنظمة الجينات القامع الورم VHL اعتبرت السبب الجذري tumorigenesis VHL-هكسابايت، منشأ الخلوية (بما في ذلك نيوفاسكولاريزيشن) والعملية التطورية لميزانيات تظل مثيرة للجدل إلى حد كبير2. ولذلك، فهم أفضل للآليات البيولوجية غبطة-نيوفاسكولار قد توفر أفكاراً مفيدة في الأوعية الدموية المناهضة الاستراتيجيات الواعدة ل VHL-هكسابايت.

واقترحت البحوث التي أجريت مؤخرا أن غبطة-neovascularization مشابه لل4،فاسكولوجينيسيس امبريولوجيك3،5. الكلاسيكية والأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)-أدى إلى وساطة الأوعية التي نشأت من البطانة الوعائية والتي تحركها VHL فقدان الوظيفة في انتشار وتشكيل نيوفاسكولار، الذي كان تحدي6. في عام 1965، كانسيلا وزيمرمان وجدت، باستخدام المجهر الإلكتروني، التي نشأت من البطانة7. وتبين في وقت لاحق أن الخلايا اللحمية مستمدة من عنصر فاسوفورماتيفي8. في عام 1982، وجد ياركو et al. أن الخلايا اللحمية من أصل غشائي9. ولذلك، افترضنا أن الخلايا البطانية الوعائية البشرية هي الخلايا الأصلية لغبطة-نيوفاسكولاريزيشن10. على الرغم من أنه من الأفضل استخدام الثقافات الأولية من الخلايا HB المستمدة من VHL المرضى العمليات الجراحية، ابحاثنا السابقة وأشار إلى أن الثقافات الأولية من خضاب الدم ليست مستقرة، وخطوط الخلية لا يمكن أن تكون ثابتة3. وعلاوة على ذلك، ثقافات الأولية في بيئة 3D لم يتمكن من تحديد أصل غبطة-neovascularization الخلوية لأنها تشمل موروث من خضاب الدم والأوعية الدموية المكونات10،11. ولذلك كنموذج البدائية والكلاسيكية من خلايا بطانية، يمكن أن تخدم البشرية خلايا بطانية والأوعية الدموية (هوفيك) كنموذج بديل خلوية لميزانيات.

والرزن تبرعم كروي نموذج جديد في الأنسجة الهندسة12،13. في هذه الورقة، 3D على أساس الكولاجين كوكولتوري نظام في المختبر استخدام كروي تنتشر مقايسة وضعت، مع أحد الأهداف شاملة لتقييم ما إذا كان يوجد ورم الكلاسيكية تولد الأوعية في ميزانيات، فضلا عن دورها في ميزانيات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان تنفيذ هذا الأسلوب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة وأنظمة البحث أخلاقيات اللجنة من هواشان مستشفى جامعة فودان. وتلت تدابير السلامة القياسية المناظرة في كل خطوة. لعرض تقديمي تخطيطي، يرجى الرجوع إلى الشكل 1.

1-الخلية الثقافة وبناء بلازميد

  1. الاحتفاظ بشكل روتيني تعديل الخلية البشرية الوريد السري غشائي (هوفيك) في دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 100 وحدة/مل من البنسلين و 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين في هوميديفيد 5% CO2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. هضم بلازميد PLKO.1 مع أبي واكوري لتوليف بلغة شرنا. تأكد من تسلسل اليغنوكليوتيد ناقل شرنا VHL تتججتجتكتككاجاتكتتتتج ككججاتكتجاجاككاكككااتكتكجاجا14.
  3. ثم، مزيج 20 µΜ النظام مع الأمام ميليلتر 5 اليغو، 5 ميليلتر لعكس اليغو، 5 ميليلتر من 10 × NEB المخزن المؤقت و 35 ميليلتر من ddH2س معا (الحجم الإجمالي هو 50 ميليلتر). حرارة الخليط عند 98 درجة مئوية 4 دقيقة، وبطء باردة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة في بضع ساعات.
  4. سد أوليجوس ملدن وبلازميد PLKO.1 جنبا إلى جنب مع ليجاسى T4 عند 4 درجة مئوية لبين عشية وضحاها. في وقت لاحق، إضافة 16 ح 5 ميليلتر من المزيج ربط إلى 25 ميليلتر الخلايا DH5α المختصة. ثم شاشة والبلازميدات الواصلة بنجاح، والتحقق من بلغة المدرج بالتسلسل.

2-لينتيفيروس حزمة والعدوى

  1. وفي المجموع، مزيج 10 ميكروغرام ناقل PLKO.1-شفهل أو PLKO.1-شسكرامبلي و 7.5 ميكروغرام للتعبئة psPAX2 بلازميد 2.5 ميكروغرام من pMD2.G بلازميد المغلف في 500 ميليلتر دميم وسائل الإعلام دون الجنين المصل البقري (FBS) لمدة 25 دقيقة.
  2. إضافة ملدميم 7 دون FBS إلى الحل أعد أعلاه.
  3. ثقافة الخلايا 293 مترا في دميم دون FBS في أطباق زراعة الأنسجة قطرها 10 سم. تأكد من أن عدد الخلايا 293 مترا 1 × 107 باستخدام عداد خلية.
  4. أضف 1 مل من محلول إعداد أعلاه إلى متوسط الخلايا 293 مترا تعداء.
    ملاحظة: خط الخلية 293 مترا مشتق من خط خلية 293F وستابلي التعبير عن مستضد تي كبيرة SV40. ولذلك، فمن مضيف مناسب لإنتاج لينتيفيرال.
  5. استبدال المتوسطة الثقافة مع دميم التي تحتوي على 10% FBS بعد ح 6.
  6. جمع وسائل الإعلام باستخدام ماصة في ح 48 بعد تعداء.
    ملاحظة: الفيروس موجود في دميم التي تحتوي على 10% FBS. الخلايا الميتة تطفو على المتوسط. استخدم الغشاء معقم 0.45 ميكرومتر لتصفية الخلايا الميتة والشوائب. عموما، ليس هناك حاجة للتحقق من تعدد العدوى (وزارة الداخلية). وهذا لإنشاء خط خلايا مستقرة. في الخطوة الأخيرة، سوف يموت جميع الخلايا الحية دون الإصابة بنجاح قبل بوروميسين. مجموعة شسكرامبلي وخلايا هوفيك هي السيطرة على المجموعة. تأكد من أن كافة الخلايا هوفيك يموتون مع تركيز بوروميسين المستخدمة قبل ح 72. وقد كل بئر على نفس العدد من الخلايا.
  7. ثقافة الخلايا هوفيك في وسائل الإعلام لينتيفيرال لح 72. ثم إضافة بوروميسين لوسائل إعلام الخلايا هوفيك بتركيز 2 ميكروغرام/مل حاء 24 "هوفيك استخدام" الخلايا دون أي علاج كمجموعة المراقبة. ضمان جميع التحكم تموت الخلايا في هذا الوقت.
    ملاحظة: وتمثل الخلايا الحية خط خلية مستقرة VHL ضربة قاضية الخلايا والخلايا شسرامبلي. وتبلغ الكثافة الطلاء 5,000/بئر في لوحات 96-جيدا.

3-جيل الماغنيسيوم خلية غشائي

  1. تريبسينيزي الخلايا هوفيكس وريسوسبيند في المتوسط دميم مع 10% FBS. عدد معتدل من الخلايا في صحن ثقافة 10 سم، مع إضافة 1 مل من تيبسين-يدتا.
  2. بذور الخلايا في صفيحة 96-بئر القاع المستديرة 3D، في كثافة خلية3 1 × 10 خلايا/جيدا. استخدام جيدا التي يمكن أن تستوعب كروي من 0.50 ميليلتر بتعليق كروي. حساب عدد الخلايا باستخدام نظام عداد خلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 مستمر ح 72. في ظل هذه الظروف، كفالة أن تشكل الخلايا علقت الماغنيسيوم الخلية تلقائياً. استبدال نصف المتوسط الثقافة بعد 36 ساعة.

4. في المختبر فحص الأوعية

  1. ذوبان الجليد حل جل في 4 درجات مئوية، وتمييع مع المتوسطة المصل انخفاض بنسبة 1:5 إضعاف.
  2. مص الماغنيسيوم من المتوسط الثقافة دميم مع ميكروبيبيتي. بعد الغسيل الماغنيسيوم مع 5 مل من المصل انخفاض المتوسط، تعليق الماغنيسيوم بلطف وحذر في الهلام المخفف. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء.
  3. تضمين 300 ميليلتر من سائل مختلطة في صفيحة 15-جيدا. بعد حضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 1، إضافة 400 ميليلتر المصل انخفاض المتوسط لكل بئر. ملء الماء المعقم حول الآبار لتوليد بيئة هوميديفيد تعوق التبخر.
  4. وبعد ذلك، ثقافة لوحة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 في الرطوبة 100% ح 1.
  5. عناية نضح المتوسطة القديمة، واستبدله ب 600 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط مع ملاحق نمو الخلايا البطانية 1% في كل بئر.
  6. بعد ح 12 أو 24 ساعة، التقاط صور تحت مجهر خفيفة مقلوب (40 *).

5-بيانات التحليل

  1. تحميل الصور إلى منصة تحليل صور على شبكة إنترنت للحصول على بيانات الطول تنبت (جدول المواد).
  2. على صفحة ويب، قم بإنشاء حساب عن طريق البريد الإلكتروني.
  3. ثم تحميل الصور عن طريق النقر على زر التحميل.
  4. تحميل النتيجة بواسطة النقر فوق الزر تنزيل.
    ملاحظة: البرنامج سيولد صورة المجهزة والبيانات. تحتوي البيانات على خمسة أجزاء: طول تنبت التراكمي، تنبت متوسط الطول، الانحراف المعياري لطول تنبت وتنبت منطقة ومنطقة كروي. يرد في الصورة المجهزة، وكل معلمة بلون مختلف لتسهيل تحديد في الصورة المجهزة: براعم الأحمر يمثل الهيكل العظمى، وأصفر عدد براعم، الأزرق هيكل تنبت وتنبت بيضاء نهاية، وكروي برتقالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتؤخذ الصور الأصلية بالمجهر المقلوب الخفيفة. الصور النمطية للسيطرة على المجموعة والمجموعة VHL مبينة في الشكل 2-A1 و الشكل 2-A2. طول تبرعم من السيطرة على المجموعة أقصر من مجموعة VHL.

بعد تحميل الصور، يوفر منصة على الإنترنت تحليل النتائج مباشرة. الناتج يتكون من جزئين: الصورة المجهزة ونتائج التحليل المطابق. صور المجهزة من السيطرة على المجم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الآونة الأخيرة، كانت تحفزها حقول متعددة من بحوث البيولوجيا الأوعية الدموية دراسة بطانة الأوعية15. في هذه المقالة، قمنا بتطوير كروي غشائي تنتشر تقنية كنموذج تجريبي لدراسة تشكيل السفينة التي تنبع من مورث VHL فقدان وظيفة في خلايا بطانية التلاعب بها لتحديد الجزيئات رواية مرشحة تتالي الأوعية. على حد علمنا، هذا هو أول تقرير لدراسة آثار الأوعية خلايا بطانية معدلة الفلزية.

نيوفاسكولاريزيشن الأنسجة (بما في ذلك ورم الأنسجة) هو عملية معقدة يحدث عن طريق الأوعية فاسكولوج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل منح من لجنة شانغهاي للعلوم والتكنولوجيا (15411951800، 15410723200). الكتاب أود أن أشكر البروفيسور يومي ون والبروفيسور تشاو تشاو جامعة "إدارة فودان الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض" الخاصة بالمساعدة التقنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الخلية البطانية للوريد السري البشريخلية Fudan IBSFDCC-HXN180
dulbecco النسر المعدل s متوسط جيبكو11995040
مصل الأبقار الجنينيGibco  26400044
PLKO.1-puro vectorAddgene# 8453
التعبئة البلازميد psPAX2   ؛Addgene# 12260
مغلف بلازميد pMD2.GAddgene# 12259
3D مستدير القاع 96 بئر لوحاتS-BioMS-9096M
matrigelBD Biosciences354234
Opti-MEM mediumGibco31985-070متوسط المصل المخفض   ؛
الجل ذات 15 بئرعن طريق موازنة & mu ؛ – شريحة تكوين الأوعية الدموية قبل الاستخدام داخل الحاضنة بين عشية وضحاها
مكملات نمو الخلايا البطانيةSciencell# 1052
طبق ثقافة 10 سمCorningScipu000813
PuromycinGibcoA1113802
typsin-EDTAGibco25200056
نظام عداد الخلايا الآلي   ؛الصور BioTech
 وينماسيسhttp://mywim.wimasis.com 
مركز يمكن تقليل فقاعات الهواء في برنامج تحليل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
  2. Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
  3. Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
  4. Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102(2014).
  5. Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
  6. Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
  7. Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
  8. Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
  9. Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
  10. Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
  11. Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
  12. Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
  13. Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
  14. Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
  15. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  16. D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).
  17. Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
  18. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
  19. Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019(2014).
  20. Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
  21. Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
  22. Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
  23. Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
  24. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
  25. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemangioblastoma NeovascularizationSpheroid Sprouting AssayVHL Gene SilencingEndothelial Cell CultureLentiviral Vector TransfectionHUVEC Cell LineSprout Length AnalysisIn Vitro AngiogenesisTumor VasculogenesisCapillary Formation Assay

Related Articles