Method Article

بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم

DOI:

10.3791/57188

⸱

May 31st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DC المشتقة من الوحيدات (مودك) يمكن الشعور بمبالغ صغيرة من الجزيئات المرتبطة بالخطر ويتم ذلك بسهولة جاهزة للانفجار. نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل مودك من الدم والأورام ومن التفعيل مع مجمعات محصنة مع تسليط الضوء على الاحتياطات الرئيسية التي يجب أن تعتبر تفاديا من تفعيل سابق لأوانه.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية (DC) هم سكان الخلية غير المتجانسة التي تختلف في علامات غشاء الخلية وأنماط الهجرة والتوزيع، وفي عرض مستضد وخلية T تفعيل القدرات. منذ تلقيح معظم النماذج التجريبية الورم تتطلب ملايين العاصمة، معزولة على نطاق واسع من النخاع العظمى أو الطحال. بيد أن هذه العاصمة كثيرا تختلف من الدم وورم DC في ردودهم مجمعات محصنة (IC)، ويفترض أن مستقبلات يكتين Syk-إلى جانب الأخرى. الأهم من ذلك، نظراً لحساسية DC للجزيئات المرتبطة بالخطر، على وجود اندوتوكسينس أو الأجسام المضادة التي مستقبلات التنشيط التشعب في عزل الخطوات يمكن أن يؤدي فتيلة العاصمة وتؤثر بالتالي المعلمات، أو على الأقل الجرعة المطلوبة لتفعيلها. ولذلك، هنا يصف لنا بروتوكول مفصل لعزل مودك من الدم والأورام مع تجنب من تفعيل سابق لأوانه. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها بروتوكولا لتفعيل مودك مع الورم IC، وتحليلاتها اللاحقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ اكتشافهم، كانت الخلايا الجذعية (DC) تركيز بحوث واسعة النطاق بسبب قدرتها الفريدة على الانحراف تمايز الخلية تي1. على مدى العقود العديدة الماضية، سعى مسعى بحوث مستفيضة لتحديد مجموعات فرعية العاصمة المختلفة ووظيفتها أثناء تطور الورم وحصانة 2. وحدات تحكم المجال Dc تتألف من السكان خلية غير المتجانسة التي تختلف عن بعضها البعض في تلك المستقبلات التعرف على الأنماط، توزيع الأنسجة، والمهاجرة ومستضد العرض التقديمي قدرات3،،من45. بالمقارنة مع سائر المجموعات الفرعية في العاصمة، العاصمة المشتقة من الوحيدات (مودك) هي الآن أكثر وفرة في الأورام ويمكن إنشاؤها بسهولة من تعميم أو التسلل إلى الورم وحيدات6،7. ولذلك، تستند العديد من التجارب السريرية التي تسعى إلى الاستفادة من انتشارها النسبي التلاعب في فيفو و السابقين فيفو من مودك الذاتي بغية الحصول على خلية T الحصانة 8،9.

وبالمثل، يتطلب التلقيح المستندة إلى العاصمة من النماذج التجريبية الورم حقن المسلسل 2-3، 5-7 أيام على حدة، من 1-2 × 106 DC المنشط نابض مع المستضدات الورم. ولذلك، ولتحقيق هذا العدد الكبير من العاصمة، معظم الدراسات الماوس أساسا استخدمت مودك مثقف من السلائف نخاع العظم (بي أم) في GM-CSF لمدة 7-9 أيام (إيل-4 غير مطلوبة في إعداد الماوس)10،11. على الرغم من ذلك، نظراً لخروج المغلوب GM-CSF أن الفئران قد حجرة DC عادي عموما 12،13، وإعطاء السكان المختلطة التي تم الحصول عليها من تلك الثقافة،14 الفسيولوجية أهمية هذه العاصمة قد تم التشكيك.

وبدلاً من ذلك، قد تكون معزولة بشكل روتيني DC من خلايا الطحال. ومع ذلك، تشمل العاصمة فقط حوالي 0.3-0.8 ٪ من مجموع الطحال الخلايا (أسفر عن حوالي 7 × 105 DC/الطحال)، وهذه الخلايا، إلا CD103+ العاصمة ومودك يمكن أن يهاجر مرة أخرى إلى الأجهزة اللمفاوية. منذ مودكس يشكلون حوالي 10-15% من سكان العاصمة الطحال15،16، تحقق معظم عزل البروتوكولات حوالي 1 × 105 مودك في الطحال. ويمكن تحقيق التوسع في مودك عن طريق حقن الخلايا B16 transfected التي تفرز GM-CSF، أدى إلى زيادة 100-fold في الطحال مودك17. استخدام مودك لتطوير لقاحات DC غير محدودة إذ لا يمكن أن يتم هذا الإجراء في البشر، وتم الحصول عليها فعلا عالية يتم تنشيط مودك.

بالإضافة إلى الحصول على عدد كاف من العاصمة، ينطوي على تحد آخر لتطوير لقاحات فعالة العاصمة ضد الخلايا السرطانية ذاتي عدم وجود إشارات الخطر كافية في تحديد الورم تنشيط العاصمة بالكامل. وعادة ما يتحقق الاستقراء إشارات كوستيمولاتوري من خلال تنشيط المستقبلات التعرف على الأنماط (بر)، أو يكتين ج-نوع الإشارات مسارات18،19،،من2021. نهج آخر لتنشيط العاصمة يستغل قدرتهم على تناول المضادات عن طريق التفاعل مع مستقبلات Fcγ السطحية (FcγR). وفي الواقع، قد أظهرت عددا من المخطوطات الهامة أن حقن مودك من السلائف BM المنشط مع الورم-مفتش IC يمكن أن تمنع نمو الأورام في إعدادات الاتقائية، ويمكن أن يؤدي إلى استئصال أورام ثابتة22،23 .

في ورقتي الأخيرة، اكتشف الكرمي وآخرون على النقيض من بمدك والطحال DC، مودك من الدم والأورام لا يمكن الاستجابة لمفتش IC دون منشطات إضافية. تم العثور على هذا أن تكون بسبب وجود ارتفاع مستويات تيروزين phosphatases تنظيم إشارات24،25FcγR داخل الخلايا. عن طريق تحديد نقطة حرجة في العاصمة، قدم هذا العمل نظرة ثاقبة هامة في متطلبات التطعيم الناجحة المستندة إلى العاصمة. الحاجة إلى حوافز إضافية لتمكين FcγR الإشارات، ويفترض أنه إشارة من مستقبلات يكتين الأخرى الاستفادة من سلسلة الفسفرة مماثلة، مما يؤكد الحاجة إلى تجنب فتيلة العاصمة خلال عزلتها.

ولذلك، هذا البروتوكول يصف عزلة مودك من الدم والأورام، والتي تختلف بشكل ملحوظ من BM والطحال DC، ويسلط الضوء على احتياطات جديرة بالنظر فيها أثناء العملية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكولات أدناه تشير إلى عزل الماوس مودك، ولكن المبادئ العامة التي قد تنطبق على DC مجموعات فرعية الخلايا الأخرى، كذلك. 12-16-الأسبوع-القديم C57Bl/6j الفئران أبقى في "جمعية الأمريكية" لمرفق الحيوان "الاعتماد لرعاية الحيوانات المختبرية" – المعتمدة. بموافقة كافة البروتوكولات في جامعة ستانفورد ورعاية الحيوان المؤسسية جامعة تل أبيب واستخدام اللجنة.

1-عزل الورم المقترنة DC المشتقة من الوحيدات

  1. في غطاء الاندفاق الصفحي، إزالة الأورام من أول أكسيد الكربون2 euthanized الفئران ومكان الأورام في المتوسط ربمي دون المصل البقري الجنين (FBS).
    ملاحظة: ينصح يحلق الفئران ورذاذ لهم مع الإيثانول 70% قبل إزالة الأورام، للتقليل من التلوث المحتملة من الفراء. تكون على يقين من أن الورم لا تتجاوز 25-40 ملم2 الأورام الأكبر منذ أقل من العاصمة التي تميل إلى أن تكون هشة وعرضه للخضوع لموت الخلايا. إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أكبر من العاصمة، يمكن حقنها كل الماوس مع خلايا الأورام في مواقع متعددة.
  2. تحت غطاء الصفحي عقيمة، ختم الأورام باستخدام مقص الجراحة إلى قطع صغيرة (حوالي 1 × 1 مم2).
    1. إضافة جميع أجزاء الورم من الماوس واحد في 30 مل عقيمة مسطحة القاع أنبوب مع أشرطة مغناطيسية ضجة، الذي يحتوي على 5 مل هانك لموازنة الحل الملح (هبس) والرابع كولاجيناز 2 مغ/مل 0.01 ملغ/مل الدناز أنا.
      تنبيه: النقوي خلايا إنتاج الطاقة عن طريق جليكوسيليشن، حتى في ظل حالة ثابتة. ولذلك، فقط استخدام وسائط يحتوي على الجلوكوز (مثلاً حبس وربمي ودميم)، كالمجاعة الجلوكوز أقل من 10-15 دقيقة سيؤدي إلى موت الخلايا والمبرمج ضمن 24 h. استخدام فقط الذيفان انخفاض كولاجيناز الرابع، كولاجيناز المنتجة بإيجابية البكتيريا (Clostridium هيستوليتيكوم).
  3. ضجة في حوالي 200-400 دورة في الدقيقة في حاضنة 37 سج مع محرض مغناطيسية لمدة 20-30 دقيقة.
  4. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام كاملة وإعادة تعليق نشاط.
  5. تصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر. الطرد المركزي في التعاون الإقليمي س400 ج 4 لمدة 5-10 دقيقة بيليه الخلايا.
    تنبيه: لا تحاول عزل الخلايا مباشرة بعد الهضم الأنزيمي، كما بعض الأورام نخرية وتحتوي على كميات كبيرة نسبيا من الحطام خلية أو المصفوفة خارج الخلية. تطبيق الخلايا على 15% الكثافة المتوسطة التدرج للحصول على الخلايا فقط.
  6. تعليق 9 مل من الكثافة المتوسطة التدرج مع 1 مل من 10 x برنامج تلفزيوني لضبط أوسمولاليتي، والحصول على حل الأسهم بركل 100%. الأسهم الحل مع 8.5 مل هبس ميكس 1.5 مل الكثافة المتوسطة التدرج ومزجها بقوة مع بيليه المستمدة من ورم الخلايا. بلطف طبقة 2 مل دميم على رأس 15% الكثافة المتوسطة الانحدار والطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل سوبيرناتانتس، كما سوف تشكل الخلايا بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
    1. تغسل الخلايا الأعلاف مرتين بإعادة تعليق لهم في 10 مل حبس يحتوي على 2% FBS والبنسلين 1%/ستربتوميسين، ويدتا 10 ملم (عزلة المخزن المؤقت)، وأجهزة الطرد المركزي في 4 سج 400 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5-10 دقيقة بيليه الخلايا.
    2. حساب عدد الخلايا في هيموسيتوميتير استخدام تريبان الأزرق تحت مجهر خفيفة.
  7. إعادة تعليق 1 × 108 خلايا في عزلة 1 مل المخزن المؤقت واحتضانها لهم في 4 سج مع 30 ميكروليتر من CD11b+ مترافق الخرز المغناطيسية لمدة 15 دقيقة.
    تحذير: تجنب استخدام الخرز مترافق CD11c، أن هذا سيتم تنشيط وحدة تحكم المجال DC والحث على موت الخلايا. لا تحاول منع FcγRII و FcγRIII مع الأجسام المضادة-CD16/32. منع الأجسام المضادة سد FcγR وحمل الفسفرة قوية من خريطة مؤنزم ورئيس وحدة تحكم المجال DC.
    1. إزالة الخرز غير منضم الزائدة عن طريق إضافة 9 مل من المخزن المؤقت للعزلة وخلايا أجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5-10 دقيقة في 4سجيم
  8. نضح المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت للعزلة 1 مل. تطبيق الخلايا في عمود مغناطيسية بريواشيد. أغسل العمود مرتين مع 3 مل من المخزن المؤقت للعزلة.
    1. إزالة العمود من المغناطيس. "الماصة؛" 6 مل من المخزن المؤقت العزلة على العمود وطرد الخلايا المسماة مغناطيسيا إلى أنبوب جمع عقيمة بدفع المكبس. خلايا أجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5-10 دقيقة في 4 سجيم
    2. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكروليتر الواحدة 1 × 107 خلايا ووصمة عار مع الأجسام المضادة مترافق fluorophore التالية: لينج السلبية (تكرب، سيجليك، B220، CD19، فسيري و Ly6G)، مهسيي، ولي-6 ج.
  9. فرز الخلايا بواسطة النابضة الخلايا الصغيرة، باستخدام الجانب مبعثر (SSC) وإلى الأمام مبعثر (FSC) والثقافة في المتوسط كاملة وتستكمل مع 5 نانوغرام/مليلتر GM-CSF. احتضان خلايا لمدة 1 ساعة في 3 7 ج سمن أجل السماح بالضامة التمسك باللوحة. ثم نقل فضفاضة والخلايا غير ملتصقة بطبق ثقافة جديدة.
    ملاحظة: يتم تعريف الماوس مودك ك CD11b+/CD11c+/MHCIIمرحبا/Ly6Cلو/int 7،،من2627. التعبير عن Ly6C قد تختلف جذريا بين نماذج الأورام، وفي بعض النماذج (مثل LMP) مودكس تفتقر تماما إلى التعبير Ly6C. وعموما، واحد 100 مم3 B16F10 الورم عادة ما يحتوي على 5 × 104 من العاصمة، أسفر عن حوالي 4-5 × 106 مجموع الخلايا. من هذه الخلايا، 10-15 في المائة من الخلايا المناعية وهي مودك من 8-10%. ويمكن تحقيق زيادة عدد DC عن طريق حقن الفئران بأورام في مواقع متعددة. فرز الخلايا SSC/FCS الصغيرة فقط، كغيرها من الخلايا النقوي التعبير عن علامات مثل CD11c و Ly6C.
    اختياري: فرز الوحيدات التسلل إلى الورم كخلايا SSC/FSC صغيرة تعبر عن Ly6Cمرحبا وهي سلبية بالنسبة مهسيي. وبعد ذلك، ثقافة وحيدات في المختبر مع 50 نانوغرام/مليلتر GM-CSF للحصول على العاصمة.

2-عزل العاصمة الوحيدات المستمدة من الدم المحيطي

ملاحظة: منذ مودكس الناضجة نادرة نسبيا في الدم الماوس، البروتوكول أدناه يشير إلى الاشتقاق في المختبر من وحيدات المفروزة.

  1. لزيادة مستويات وحيدات في الدم، تخدير الفئران بنسبة 4 في المائة isoflurane وحقن لها تحت الجلد (الليبي) مع 1 ميكروغرام من GM-CSF في 50 ميكروليتر PBS.
  2. بعد 1-2 ح، التضحية الفئران باستخدام أول أكسيد الكربون2.
    تنبيه: لا التضحية الفئران بسرطان عنق الرحم من التفكك، أن هذا سوف يسبب نزيف داخلي.
  3. فور يوثانيزيشن، رش الماوس مع الإيثانول 70% وإزالة الجلد الذي يغطي القلب باستخدام مقص جراحي، تحت غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة. تنظيف المقص مع الإيثانول وقطع الاذين الأيمن من القلب. ببطء، تدفق القلب عن طريق البطين الأيمن مع 20 مم يدتا حبس باستخدام حقنه 10 مل وابرة 25-ز.
    1. جمع الدم مع المحاقن معقمة من التجويف الجنبي في أنبوب عقيم يحتوي على كبريتات heparan ويدتا. وتواصل تدفق القلب حتى الكبد والرئتين تصبح الوردي أو الأبيض.
  4. تطبيق الدم على كثافة ميديوماند تدرج للطرد مركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع الفرامل منخفضة.
    تحذير: استخدام خالية من الذيفان الكثافة المتوسطة التدرج (0.12 عادة أقل من الاتحاد الأوروبي كل مل).
    1. جمع الخلايا وحيدات النوى في أنبوب جديد. غسل الخلايا بإعادة تعليق في 10 مل حبس الذي يحتوي على 2% FBS 1% البنسلين/ستربتوميسين ويدتا 10 ملم (عزلة المخزن المؤقت) وسينتريفوجينج ثم في 4 سrcf 400 ج لمدة 5-10 دقيقة بيليه الخلايا.
      تحذير: استخدام الوسائط التي تحتوي على الأقل 1 غرام/لتر جلوكوز فقط.
  5. لاختيار CD11b إيجابية، إعادة تعليق 1 × 108 خلايا في المخزن المؤقت للعزلة 1 مل واحتضانها لهم لمدة 15 دقيقة مع 50 ميكروليتر من حبات مغناطيسية مترافق CD11b في 4 سجيم
    1. تغسل حبات الزائدة عن طريق إضافة 9 مل من المخزن المؤقت للعزلة وسينتريفوجينج في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5-10 دقيقة في 4 سأسبيراتي جيم سوبيرناتانتس وتعليق إعادة الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت للعزلة 1 مل. تطبيق الخلايا في عمود بريواشيد مغناطيسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    2. إزالة العمود من المغناطيس، "الماصة؛" 6 مل من المخزن المؤقت العزلة على العمود، وطرد الخلايا المسماة مغناطيسيا إلى أنبوب جمع عقيمة بدفع المكبس. الطرد المركزي خلايا في 400 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5-10 دقيقة في 4 سجيم أغسل العمود مرتين مع 3 مل من المخزن المؤقت للعزلة.
    3. تعليق إعادة الخلايا في 1 × 107 خلايا/100 ميكروليتر المخزن المؤقت العزلة ووصمة عار مع الأجسام المضادة مترافق fluorophore التالية: 0.1 ميكروغرام CD115 و 0.25 ميكروغرام مهسيي 0.1 ميكروغرام Ly-ج 6/1 × 106 خلايا.
  6. فرز الخلايا بواسطة النابضة على الجانب صغيرة مبعثرة (SSC) وخلايا صغيرة إلى الأمام مبعثر (FSC).
    ملاحظة: عموما الماوس وحيدات التحريضية التي تم تعريفها ك CD115+/مهسييلو/الراتب/Ly6Cمرحبا، والقيام بدوريات وحيدات عرف أنهم CD115+/MHCII/Ly6Cلو/الراتبالراتب 4، 5. وفي الحالات التي يلزم فيها أي فصل بين المجموعات اثنين، مجموع ال SSCلو/FCSلو/CD115+/مهسييلو خلايا يمكن فرزها. السذاجة والفئران الحاملة لورم تحتوي على حوالي 5-8 × 104 مودك كل 1 مل من الدم وتصل إلى 4-5 × 105 مودك عقب حقن GM-CSF. ومن بينهم حوالي 70% وحيدات التحريضية و 30% بدوريات وحيدات.
  7. لوحة الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل في وسائل الإعلام كاملة وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر GM-CSF. بعد يوم واحد، نقل الخلايا غير ملتصقة وفضفاضة ملتصقة لوحة جديدة وثقافة لمدة 4-5 يوما إضافيا.
    تنبيه: لا ينبغي أن تستكمل وسائل الإعلام في العاصمة مع بيروفات.

3-إعداد مجمعات محصنة ضد مفتش الورم

  1. ثقافة الخلايا السرطانية في 75 سم2 الثقافة قارورة لالتقاء 70% في وسائل الإعلام دميم كاملة.
    1. إضافة 2 مل من 0.25% التربسين/أدتا فصل الخلايا من الثقافة قارورة ورصد مورفولوجية الخلية تحت مجهر خفيفة لتجنب الإفراط في تريبسينيزيشن.
    2. إضافة 8 مل من وسائل الإعلام ثقافة كاملة (لكل 2 مل التربسين) تمنع الهضم التربسين، والطرد المركزي في 4 سج 400 إطار التعاون الإقليمي لمدة 5-10 دقيقة بيليه الخلايا.
      ملاحظة: تأكد من للتحقق من وجود خلايا الورم مفطورة باستخدام مجموعة بكر تجارية. اختبار لوجود بكتيريا سلبية الغرام والفطرية endotoxins استخدام ليمولوس أميبوسيتي ليستي (ال) الاعتداء28). ويجب تصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر المصل واختبارها "مدونة اللوائح التنظيمية الفيدرالية ل" الفيروسات 9. بالإضافة إلى ذلك، اختبار وسائط الثقافة والأمصال بإسقاط 100-200 ميكروليتر إلى أجار رطل أو مرق، والثقافة لمدة يومين في 37 ياجيم
    3. يغسل خلايا مرة أخرى من بقايا التربسين والمصل بإعادة تعليق لهم في 10 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 5-10 دقيقة لنضح المادة طافية وتكرار الغسيل 2 مرات أكثر.
  2. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 1.8 ٪ مخزنة مؤقتاً لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. غسل الخلايا بإعادة تعليق لهم في 10 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 ج س4 لمدة 5-10 دقائق.
    2. سوبيرناتانتس أسبيراتي وتكرار غسل مرتين أخريين.
      اختياري: لفحوصات امتصاص الورم، الخلايا يمكن أن يكون المسمى بحضانة لهم لمدة 5 دقائق في 37 سج في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكرومتر إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين (CFSE). ثم هو مروي كفسي مع وسائل الإعلام كاملة لمدة 10 دقائق في الجليد. وينبغي غسل الخلايا على نطاق واسع في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% مصل لإزالة الصبغة المتبقية.
  3. إعادة تعليق الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني تستكمل مع FCS 2% + 5 مم يدتا) و 0.5 ميكروغرام/مل من مكافحة-CD16/32 من أجل عرقلة محتملة غير محددة البروتين-بروتين التفاعلات. لوحة في آبار 96 شكل U/لوحة بتركيز 1 × 105 خلايا كل 100 ميكروليتر.
    1. إضافة تخفيف مختلف الأجسام المضادة ملزمة الورم تتراوح بين 5 ميكروغرام-5 نانوغرام/1 × 105 خلايا. احتضان لوحة على الجليد لمدة 15-20 دقيقة.
      ملاحظة: مفتش الأجسام المضادة كانت معزولة من المصل من السذاجة 20-24 أسبوعا القديمة الفئران الإناث على أعمدة البروتين أ، ك وصف24.
  4. غسل الخلايا بإضافة 150 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج اللوحة في إطار التعاون الإقليمي س400 ج 4 لمدة 5-10 دقائق.
    1. تجاهل في supernatants وتكرار الغسيل مرتين. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة التي تحتوي على جسم الثانوي مترافق فلوروفوري. احتضان لوحة على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    2. غسل الخلايا بإضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وسينتريفوجينج اللوحة في التعاون الإقليمي 400 5-10 دقيقة لتجاهل في supernatants وتكرار الغسيل.
    3. تحليل الورم ملزم بالتدفق الخلوي وتحديد تركيز الحد الأدنى المطلوب لمعطف الخلايا.
      ملاحظة: لا يمكن استخدام الأجسام المضادة التي لا تزيد fluorescence متوسط الكثافة (MFI) من الخلايا السرطانية ملطخة بخمسة إضعاف على الأقل ايستب السيطرة على في الاختبارات الفنية اللاحقة.

4-تفعيل مودك مع مفتش الورم IC

  1. معطف الخلايا السرطانية مع تركيز مفتش الحد الأدنى، كما هو موضح في المقاطع 3.1 عن طريق 3.4.3
    1. يوم واحد قبل تفعيل مودك مع الورم IC، استبدال مودك ثقافة وسائل الإعلام، التي تحتوي على GM-CSF. للقيام بذلك، بلطف نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا مرة واحدة مع حرارة مسبقاً وسائل الإعلام ثقافة كاملة.
      ملاحظة: ينبغي أن مثقف مودك المرتبطة بورم ناضجة معزولة على الأقل 2-3 ح (أو حتى بين عشية وضحاها) بعد الفرز في وسائل الإعلام كاملة دون GM-CSF، وقبل تفعيل لهم مع IC.
    2. لتحليلات امتصاص الورم، إضافة الورم المسمى كفسي IC إلى مودك بنسبة 1:5 (IC:MoDC) واحتضان بين عشية وضحاها على ح 12-16 في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة كل 1 × 106 DC.
    3. نظام مراقبة الأصول الميدانية بتحليل لتجارب التنشيط مودك، إضافة IC ورم في نسبة 1:1 (IC:MoDC) واحتضان بين عشية وضحاها على ح 12-16.
      ملاحظة: ينصح بتضمين عنصر تحكم إيجابية أيضا، في مودك التي يتم حفز مع 1 ميكروغرام/مل من لبس أو يضع TLR الأخرى.
    4. بعد تنشيط بين عشية وضحاها، نضح في supernatants وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للعزلة، أو 10 ملم "حبس يدتا".
    5. لفصل العاصمة من اللوحة، احتضان خلايا لمدة 2-3 دقيقة في 1 مل حبس تحتوي على 10 مم يدتا، وفصل الخلايا من بيبيتينج قوية.
    6. الطرد المركزي خلايا في 400 إطار التعاون الإقليمي، وإعادة تعليق 1 × 106 DC في 90 PBS ميكروليتر تستكمل مع السفح 2%، 5 مم يدتا (المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية) و 0.5 ميكروغرام لمنع الأجسام المضادة. تبني على الجليد لمدة 5-10 دقائق.
    7. إضافة 10 ميكروليتر من تلطيخ مزيج الأجسام المضادة للخلايا واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة.
    8. إضافة 2 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت إلى الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 ج س4 لمدة 5-10 دقائق.
  2. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة.
    1. إضافة 0.5-1 ميكروغرام/مل من DAPI 1-2 دقيقة قبل تشغيل العينات، لاستبعاد الخلايا الميتة من التحليلات. عدم الإفراط احتضان DAPI، كما سوف مودك من تناوله خلال 10-15 دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن في البداية بالمقارنة مع قدرة الأجسام المضادة من الفئران سينجينيك ومتمكنة من السذاجة لربط الخلايا السرطانية. وتحقيقا لهذه الغاية، كانت ثابتة في بارافورمالدهيد خطوط الخلايا السرطانية B16F10 و LMP وغسلها على نطاق واسع. B16F10 هو خط خلية سرطان الجلد، الذي كان أصلاً معزولة من الانبثاث الرئة في الفئران C57Bl/6. LMP هو خلية ورم البنكرياس التي كانت معزولة من KrasG12D/+ الفئران LSL-Trp53R172H/+ و Pdx-1-لجنة المساواة العرقية، وينمو باطراد في الفئران 129F1. للحصول على IC، كانت المحتضنة الخلايا ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظراً للعدد الكبير من العاصمة اللازمة لتطعيم الفئران (حوالي 2-4 × 106 العاصمة الواحدة وماوس واحد)، ومعظم التلقيح تستند الاستراتيجيات في الفئران إلى عزل العاصمة من BM والطحال متبوعاً التنشيط السابقين فيفو . ومع ذلك، يحاول تنشيط الورم DC في فيفو، استخدام نفس الشروط لتنشيط الطحال والعاصمة BM، كثيرا ما كانت غير ناجحة في إنتاج الحصانة فعالة. في منشورين اللاحقة، الكرمي وآخرون. وقد وجدت أن الدم والورم مودك تختلف كثيرا عن الطحال والعاصمة BM، نظراً لأن تحمل بطبيعة الحال ارتفاع مستويات الفوسفا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن جميع المؤلفين لديهم أي تعارض في المصالح، وأن لديهم أي شيء كشف.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
EasySep Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19861
Collagenase IVSigmaC9697-50MGاختبر كل دفعة للسموم الداخلية
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071اختبر كل دفعة للذيفان الداخلي
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC / Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE / Cy7-CD15Biolegend 135523

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165(2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte derived Dendritic CellsImmune Complex ActivationTumor Cell IsolationBlood Cell IsolationMagnetic Bead SeparationDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisCD11b Cell SelectionCFSE labeled Tumor ComplexDendritic Cell Activation

Related Articles