عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب

ملخص

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا mast البريتوني مورين. يصف لنا أيضا بروتوكولين لتوصيف وظيفي على: تصوير فلورسنت داخل الخلايا الحرة Ca^{2 +} تركيز ومقايسة تحبب استناداً إلى الكمي اللونية للمفرج عنهم β-هيكسوسامينيداسي.

الملخص

خلايا ماست (MCs)، كجزء من النظام المناعي، وتلعب دوراً أساسيا في الدفاع عن البلد المضيف ضد العديد من مسببات الأمراض، وفي الشروع في الاستجابة المناعية حساسية. تفعيل الإشراف عن طريق العابرة للربط من سطح فريق الخبراء الحكومي الدولي ملزمة تقارب عالية ايغي مستقبلات (FcεRI)، وكذلك من خلال تحفيز مستقبلات أخرى عديدة، يبدأ صعود داخل الخلايا الحرة Ca^{2 +} المستوى ([Ca^{2 +}]_أنا) أن يعزز الإفراج عن وسطاء التهابات وحساسية. تحديد المكونات الجزيئية المشاركة في هذه المسارات مما يشير إلى أمر حاسم لفهم تنظيم وظيفة MC. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول لعزل نوع النسيج الضام مورين MCs بالغسل البريتوني وزراعة MCs البريتوني (الشركات العسكرية الخاصة). الثقافات للإشراف من خروج المغلوب الماوس نماذج مختلفة من هذه المنهجية تمثل نهجاً مفيداً لتحديد البروتينات المشاركة في MC إشارات المسارات. وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا وصف بروتوكول لخلية مفردة Fura-2 التصوير كما أسلوب هام للتحديد الكمي ل Ca^{2 +} إشارات في MCs. المستندة إلى الأسفار الرصد [Ca^{2 +}]_أنا موثوقة ويشيع استخدام نهج دراسة Ca^{2 +} يشير إلى الأحداث، بما في ذلك دخول الكالسيوم تعمل بالمخزن، الذي يتسم بأهمية قصوى لتفعيل MC. لتحليل تحبب MC، يصف لنا مقايسة إصدار β-هيكسوسامينيداسي. يعتبر مبلغ β-هيكسوسامينيداسي التي تطلق في المتوسط الثقافة كعلامة تحبب لكل ثلاثة مختلفة الافرازية المجموعات الفرعية الموصوفة في الإشراف-β-هيكسوسامينيداسي يمكن بسهولة قياسها كمياً بفعلها مع الركازة كولوريجينيك في ميكروتيتير لوحة مقايسة اللونية. هذا الأسلوب استنساخه بدرجة عالية من حيث التكلفة ويتطلب أي معدات متخصصة. إجمالاً، يوضح البروتوكول قدم عالية غلة من MCs معربا عن علامات السطح MC نموذجية، عرض السمات الشكلية والمظهرية نموذجية للإشراف، وإظهار الردود استنساخه بدرجة عالية على سيكريتاجوجويس في كاليفورنيا^{2 +}- فحوصات التصوير وتحبب.

المقدمة

الإشراف دوراً بارزا خلال الاستجابات المناعية الفطرية والمكتسبة. على وجه التحديد، MCs المشاركة في قتل مسببات الأمراض، مثل البكتيريا والطفيليات، وكذلك تتحلل محتملة السمية الببتيدات الذاتية أو مكونات من السموم (لاستعراض انظر جالي et al. 2008¹). دور الرصد والمراقبة الفسيولوجية في الحصانة الفطرية والتكيف هو موضوع نقاش ساخن. ولذلك، تتطلب التناقضات بيانات عديدة في الدراسات التي يؤديها مع نماذج مختلفة من الماوس MC-تفتقر إلى منهجية إعادة تقييم الوظائف المناعية للإشراف تتجاوز الحساسية². MCs ناضجة تكون مترجمة معظمها في الأنسجة والأعضاء مثل الجلد والرئة، والأمعاء، وعادة ما تكون موجودة فقط في إعداد صغيرة في الدم. الإشراف مستمدة من السلائف المكونة للدم، مثل MC فروعه، وإتمام تمايز ونضج في ميكرونفيرونمينتس تقريبا جميع الأنسجة فاسكولاريزيد¹. عامل المستمدة من الخلايا T انترلوكين (إيل)-3 بشكل انتقائي يعزز الاستمرارية والانتشار، والتفريق بين سكان pluripotent الماوس MCs من فروعه المكونة للدم على³. الخلية الجذعية عامل (SCF) هي التي تنتجها الخلايا الهيكلية في الأنسجة ويلعب دوراً حاسما في التنمية مولودية، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، والدالة⁴. خصائص الإشراف الفردية قد تختلف تبعاً لقدرتها على تجميع وتخزين مختلف البروتياز أو بروتيوجليكانس. في الفئران، تتميز MCs ما يسمى النسيج الضام-نوع من الإشراف المخاطية وفقا للتعريب التشريحية ومورفولوجيا، والمحتوى من الهيبارين والبروتياز⁵.

في أنظمة الرصد والمراقبة، أي بزيادة قدرها مجاناً Ca سيتوسوليك^{2 +} ([Ca^{2 +}]_أنا) أمر لا غنى عنه تحبب وإنتاج eicosanoids، فضلا عن توليف السيتوكينات وتفعيل عوامل النسخ ردا على مستضد و مختلف سيكريتاجوجويس⁶. هو المصب هدفا رئيسيا لهذه المحفزات phospholipase جيم، الذي هيدروليزيس فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي دياسيلجليسيرول (همرشولد) واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي. همرشولد ينشط البروتين كيناز ج والنشرات IP3 أيونات Ca^{2 +} من هيولى. استنفاد هذه المحلات ينشط Ca^{2 +} التدفق عبر غشاء البلازما Ca^{2 +} القنوات، مما يؤدي إلى تخزين الكالسيوم تعمل دخول (سوسي). هو أثارت هذه العملية من خلال التفاعل من Ca^{2 +}-استشعار، stromal التفاعل جزيء-1 (Stim1)، في هيولى مع Orai1⁷ وكذلك من خلال تفعيل مستقبلات عابر المحتملة المتعارف عليه في قناة (TRPC) البروتينات (لاستعراض انظر فريتشيل et al. ⁸من 2014) في غشاء البلازما.

لدراسة دور الفسيولوجية لهذه القنوات، عدة الدوائية (تطبيق محصرات قنوات) أو نهج الوراثية تستخدم عادة. وفي الحالة الأخيرة، يتحقق قمع التعبير البروتين باستهداف مرناً (ضربة قاضية) أو تحرير الحمض النووي مع حذف العمومية أو الخاصة بالانسجة⁹ إكسون الترميز مسام تشكيل وحدة فرعية قناة (خروج المغلوب). ويقتصر توافر مانع مع خصوصية كافية لهذه القنوات. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نهج ضربة قاضية تحكم دقيق من الفعالية استخدام، على سبيل المثال-غربية لطخة تحليل، ويعوقها عدم وجود أجسام مضادة محددة للبروتين القناة المستهدفة في كثير من الحالات. وهكذا، لا يزال يعتبر استخدام نماذج الماوس خروج المغلوب كمعيار الذهب لمثل هذا التحليل. نموذج مفضل في المختبر لتحقيق مهام المؤتمر الوزاري هو زراعة الشركات العسكرية الخاصة التي يمكن أن تكون معزولة السابقين فيفو كعدد سكان ناضجة تماما (بدلاً من التمييز بين الإشراف في المختبر ، على سبيل المثال-، خلايا نخاع العظام)¹⁰ . مقارنة بنخاع العظام المستمدة MCs (بممكس)، التي تستخدم عادة لدراسة MC الدالة في المختبر، وحفز FcεRI وبيتا-هيكسوسامينيداسي الإصدار هو زيادة 8 إضعاف ومعززات في هذه الشركات، على التوالي. في هذه المقالة، يصف لنا طريقة لعزل وزراعة مورين الشركات العسكرية الخاصة، التي تسمح بالحصول على بعد 2 أسابيع من استزراع عدد كبير من النسيج الضام نقي نوع الإشراف، كافية لمزيد من التحليل.

على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في وضع وتطبيق المؤشرات الكالسيوم وراثيا المرمزة، الاستخدام الخاص بهم لا يزال محدودا بصعوبات في إيصال الجينات إلى الخلايا المستهدفة، وعلى وجه التحديد، في خلايا متخصصة للغاية--مثل الأسماك المستزرعة الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، لا تزال هذه المجموعة من المؤشرات نيون [Ca^{2 +}]_أنا القياسات تفتقر إلى الأصباغ راتيوميتريك مع مجموعة ديناميكية عالية. لهذه الأسباب، الأسلوب المفضل لقياس راتيوميتريك [Ca^{2 +}]_أنا لا يزال استخدام صبغة الفلورسنت "Fura-2"¹¹.

في الوقت الراهن، النهج الأكثر شيوعاً لتقييم تفعيل المنهج النموذجي وتحبب قياس النشاط β-هيكسوسامينيداسي. Β-هيكسوسامينيداسي، وسيط حساسية، هو أحد مكونات الحبيبية مولودية أن المفرج عنهم يشترك مع الهستامين في نسبة ثابتة من الإشراف¹². ويمكن قياس β-هيكسوسامينيداسي بسهولة ودقة من خلال فعلها مع الركازة محددة، التي تنتج كمية قابلة لقياس لمنتج كولوريجينيك التي لا يمكن اكتشافها بسهولة في مقايسة اللونية ميكروسكوبية. ويقال في هذا المقال، تطبيق هذه التقنية لتحليل تحبب الشركات العسكرية الخاصة في الاستجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات.

تجميع مستقبلات عالية تقارب فريق الخبراء الحكومي الدولي بلاسماليمال (FcɛRI) ينشط في الإشراف مسار إشارات داخل الخلايا تنوعاً، مما يؤدي إلى الإفراج عن محتوى الحبيبية الافرازية في الفضاء خارج الخلية المجاورة. بالإضافة إلى مستضد معين، يمكن تنشيط العديد من المحفزات الأخرى الإشراف على الإفراج عن مجموعة متنوعة من الوسطاء إيمونومودولاتوري، مثل أنافيلاتوكسينس تكملة (مثلاً., C3a و C5a)¹³, endothelin الببتيد مضيق للأوعية 1 (ET1)¹⁴ ، وكذلك العديد من المواد الموجبة والمخدرات آثار ردود فعل بسيودواليرجيك (مثلاً., إيكاتيبانت)¹⁵ بالربط إلى MRGPRX2¹⁶. مسارات الإشارات داخل الخلايا المشاركة في الإشراف التي يسببها مرجبر تحبب تتميز ضعيف بالمقارنة مع FcɛRI بوساطة الإشارات داخل الخلايا؛ وبدأت هذه المسارات فقط إلى دراسة مكثفة خلال السنوات القليلة الماضية¹⁷ بعد تحديد مستقبلات¹⁶. إلى حد كبير، تبقى قنوات أيون غشاء البلازما المتورطين في إدخال الكالسيوم متبوعاً MRGPRX2 التحفيز يجب أن يفهم. ولذلك، تركز هذه المادة أيضا على إشارات الكالسيوم داخل الخلايا وحفز تحبب للإشراف مع مرجبر يضع.

البروتوكول

وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية التشريعات الألمانية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (أقرتها رسميا المجلس الإقليمي كارلسروه).

1-PMC العزلة وزراعة بالغسل داخل

1	الجليد
2	الحقن 10 مل
3	إبر ز 27
4	إبر ز 20
5	كتلة الستايروفوم ودبابيس
6	مجموعة أنابيب (50 مل البلاستيكية أنابيب الطرد المركزي)
7	إيثانول 70%
8	ربمي المتوسطة (قبل مبردة، وأبقى على الجليد)
9	PMC المتوسطة: المتوسطة ربمي + + 20% FCS (مصل العجل الجنين) محلول "البنسلين والستربتوميسين" 1% (القلم-بكتيريا)
10	فوسفات دولبيكو في مخزنة المالحة-دببس (دون Ca2 + و Mg2 +)
11	الثقافة قوارير (25 سم)
12	عوامل نمو الأسهم الحلول (إيل-3: 1 ميكروغرام/ميكروليتر؛ صندوق إنقاذ الطفولة: 2.5 ميكروغرام/ملليلتر)
13	الممصات المصلية (10 مل)
14	نصائح ماصات معقم (20 – 200 ميليلتر)
15	هيموسيتوميتير
16	مقاعد البدلاء للطرد المركزي
17	مقص وملقط
18	CO2 غرفة للفئران
19	فتح غطاء معقم
20	أغلق غطاء معقم
21	الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2)
22	نقل الماصات (20 – 200 ميليلتر)

الجدول 1: المواد للخطوة 1.

1. بعد الاجتماع الوزاري العزل بواسطة الغسل داخل
   1. قبل عزل الخلية، إعداد المواد المدرجة في الجدول 1.
   2. استخدم 8 إلى 14 أسبوع ذكور الفئران للعزل بعد الاجتماع الوزاري. Euthanize ماوس باستنشاق أول أكسيد الكربون₂ ، وتأكيد الوفاة بفقدان ردود الفعل. رش الماوس مع الإيثانول 70% وإصلاحه على كتلة رغوة استخدام دبابيس (الظهرية الجانبية إلى أسفل). قم بإزالة الجلد البطني للماوس باستخدام مقص حافة حادة. تجنب إتلاف التجويف الصفاقى.
      ملاحظة: نحن نستخدم عادة هذا البروتوكول للفئران مع خلفية C57BL/6N سلالة وراثية.
   3. حقن 7 مل من المتوسطة ربمي المثلج و 5 مل من الهواء في التجويف الصفاقى استخدام حقنه 10 مل مزودة بإبرة ز 27. دفع الإبرة بعناية في الصفاق وإنثقب لا أي أجهزة. استخدام بقعة في منطقة الدهون البربخيه للحد من خطر ثقب الجهاز.
   4. بعد الحقن، قم بهز الماوس لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا البريتوني في المتوسط ربمي. لا تهز الماوس أيضا بشدة، لتجنب إتلاف الأجهزة الداخلية وتلوث التجويف الصفاقى بالدم.
   5. إعادة استخدام المحاقن 10 مل بتزويدها مع قنية ز 20 جديدة. تحول أجهزة الداخلية إلى جانب واحد بإمالة في كتلة الرغوة ولطف التنصت على على مقاعد البدلاء لتسهيل الشفط المتوسط من الجانب الآخر. إدراج إبرة ز 20، مجسم مشطوف الحواف أعلى ونضح السائل من البطن بلطف وببطء (~0.5 مل/ثانية) لتجنب انسداد الأجهزة الداخلية. جمع السوائل قدر ممكن (عادة 5-6 مل).
   6. إزالة الإبرة من المحاقن ونقل تعليق الخلية التي تم جمعها في أنبوب جمع على الجليد. تجاهل وجود أنبوب عينة إذا كان هناك تلوث الدم مرئياً.
   7. الطرد المركزي هذه الأنابيب مع تعليق خلية في ~ 300 x ز لمدة 5 دقائق. تحت غطاء معقم نضح المادة طافية. لكل الماوس، الجمع بين الكريات عينة في 4 مل الباردة (4 – 10 درجة مئوية) "المتوسطة بعد الاجتماع الوزاري" ونقل تعليق خلية قارورة ثقافة 25 سم² . إضافة عوامل النمو إيل-3 وقدم مكعب معياري للتركيزات النهائية 10 نانوغرام/مليلتر و 30 نانوغرام/ملليلتر، على التوالي. ضع قارورة تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون₂) واحتضانها ح ~ 48 حتى الإجراء التالي.
2. ثقافة ما بعد الاجتماع الوزاري
   1. 2 يوم (ح ~ 48 بعد عزلة): تغيير متوسطة
      1. لإزالة نضح طافية وغير ملتصقة الخلايا (الكريات الحمراء والخلايا الميتة)، المتوسطة من قارورة وضع تلميح ماصة باستور في حافة قارورة وعقد في قارورة تقريبا أفقياً. إضافة 4 مل من قبل حرارة PMC المتوسطة الواحدة والماوس. إضافة عوامل النمو إيل-3 (10 نانوغرام/مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة (30 نانوغرام/ملليلتر). ضع قارورة تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون₂).
   2. يوم 9: خلية تقسيم
      1. نقل تعليق خلية من قارورة ثقافة الخليوي في أنبوب بلاستيكي للطرد مركزي 50 مل. أغسل قارورة ثلاث مرات مع 10 مل استعد مسبقاً (37 درجة مئوية) دولبيكو للفوسفات مخزنة المالحة (دببس)، وجمع تعليق خلية مع خلايا منفصلة في 50 مل نفس أنبوب الطرد المركزي من البلاستيك. حساب تركيز الخلية هيموسيتوميتير، وحساب إجمالي عدد الخلايا.
      2. الطرد المركزي من تعليق خلية في ~ 300 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية. استرداد بيليه في حرارة قبل PMC المتوسطة (37 درجة مئوية) للحصول على خلية تركيز 1 × 10⁶ الخلايا/مل. نقل تعليق خلية قارورة 25 سم² ثقافة جديدة. تجاهل قارورة قديمة مع الليفية الانضمام إلى الأسفل.
      3. إضافة عوامل النمو إيل-3 (10 نانوغرام/مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة (30 ng/mL)، ووضع في قارورة تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون₂).
   3. 12 – 15 يوما: خلية القياسات
      1. إذا كان التخطيط لأي تجارب مع تحفيز مستقبلات FcɛRI، بريتريت الخلايا بين عشية وضحاها مع 300 نانوغرام/مليلتر من فريق الخبراء الحكومي الدولي مكافحة-التثقيف في مستنبت القياسي. يمضي قدما الخطوة 2 والخطوة 3.

2-قياس تركيز فلوروميتريك الكالسيوم الحرة داخل الخلايا في هذه الشركات

1. قبل القياسات، إعداد المواد المدرجة في الجدول 2. أيضا، بإعداد "برنامج الإعداد التصوير" تتكون من: Fluorescence المجهر المقلوب؛ الهدف: 40 X/1.3 النفط؛ تعيين عامل تصفية Fura 2؛ كاميرا اتفاقية مكافحة التصحر؛ مصدر الضوء الإثارة؛ تصوير اقتناء البرنامج؛ خطورة تغذية نظام تطبيق الحل.

1	بعد الاجتماع الوزاري (12 – 15 يوما) 1 × 106 خلايا/مل
2	كونكانافالين A
3	Fura-2 صباحا
4	F-127 بلورونيك 20 ٪ الحل
5	نظارات كشوف تغطية الجولة؛ ø 25 مم؛ رقم 1
6	حل الأسهم DNP-هسا (ألبومين المصل الإنسان dinitrophenol)
7	حل الأسهم المضادة-التثقيف-الأجسام المضادة (IgE)
8	لوحة مسطحة القاع (12 بئرا)
9	حل الأسهم 48/80 مركب
10	وتغطي أيضا التصوير الدوائر
11	هيموسيتوميتير
12	نقل الماصات (20 – 200 ميليلتر)

الجدول 2: المواد للخطوة 2.

2. إعداد تصوير Fura-2
   1. القيام بعدد خلايا استخدام هيموسيتوميتير وضبط تركيز الخلية إلى 1 × 10⁶ خلايا/مل. تقسيم المستعمرات هذه الشركات بلطف بيبيتينج (3 – 5 مرات) تعليق خلية مع تلميح ماصة 1 مل.
   2. إعداد Ca^{2 +}-تتضمن حبيس مخزنة الحل الملح (Ca^{2 +}-حبس) يتألف من 135 ملم كلوريد الصوديوم، 6 مم بوكل، كاكل 2 مم₂، 1.2 مم مجكل₂، 10 مم حبيس، والجلوكوز 12 مم. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم.
   3. إعداد كونكانافالين A جولة الشرائح المغلفة بقطرة 1 بيبيتينج من حل كونكانافالين A (0.1 مغ/مل ح₂س) على كل 25 مم تغطية الزجاج تحت غطاء عقيمة. اترك القطرات على كشوف غطاء لمدة 1 دقيقة على الأقل، ثم إزالة معظم الحل مع ماصة واسمحوا أيردري كشوف الغطاء عن 45 دقيقة بعناية اضغط كشوف الغطاء بمعاملة كونكانافالين على المطاط التصوير الدائرة (انظر الجدول للمواد) حتى يولونها للحصول على الفحص المجهري التصوير الدوائر.
      ملاحظة: يمكن استخدام الشرائح بولي-L-يسين المغلفة كبديل.
   4. حل الفلورسنت Ca^{2 +} صبغ Fura-2 صباحا (1 مم) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). تخزين هذا الحل محمية من الضوء.
   5. تمييع Fura-2 صباحا حل الأسهم في Ca^{2 +}-حبس لتركيز نهائي من 5 ميكرومتر بغية إعداد "تحميل المخزن المؤقت". الملحق مع 5 ميليلتر/مل من بلورونيك 20% F-127 في [دمس].
   6. ميكس 500 ميليلتر "تحميل المخزن المؤقت" مع 500 ميليلتر من تعليق خلية بعد الاجتماع الوزاري. "الماصة؛" الخليط إلى غرفة التصوير، واحتضان الخلايا لمدة 20 – 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   7. إعداد خطورة تغذية نظام التطبيق مع حلول مختلفة طبقاً للبروتوكول التحفيز. تكملة حقنه 1 مع 40 مل من محلول Ca^{2 +}-حبس، المحاقن 2 مع 40 مل من Ca^{2 +}-حبس محلول يحتوي على 100 نانوغرام/مليلتر إدارة التخطيط الوطني، والمحاقن 3 مع 40 مل من Ca^{2 +}-حبس محلول يحتوي على 50 ميكروغرام/مل مجمع 48/80، المحاقن 4 مع 40 مل من اسمياً Ca^{2 +}-الحرة-الحل حبس، والمحاقن 5 مع 40 مل من اسمياً Ca^{2 +}-الحرة-حبس محلول يحتوي على 2 ميكرومتر ثابسيجارجين.
   8. إعداد هدفا غمر نفط عالية في الفتحة X 40 عن طريق وضع قطره صغيرة من النفط الغمر على ذلك.
   9. تحميل تطبيق نظام على مرحلة المجهر المقلوب. وضعت دائرة التصوير مع الخلايا المحملة في تطبيق نظام وتأمينه لمنع الحركة أثناء التسجيل. قم بتشغيل الضوء المنقولة والتركيز الخلايا.
   10. شطف الخلايا ثلاث مرات مع Ca^{2 +}-حبس المخزن المؤقت باستخدام نظام تطبيق الجاذبية.
   11. احتضان الخلايا في Ca^{2 +}-حبس لمدة 5 دقائق ل Fura-2 ص دي الأسترة.
   12. شطف الخلايا أكثر من مرة واحدة قبل البدء التصوير، إزالة أي احتمال تسرب صبغة الفلورسنت.
3. تصوير الخلية
   1. بدء تشغيل البرنامج الحصول على التصوير في وضع اقتناء الفسيولوجية. فتح نافذة برنامج الإعداد، وضبط التركيز ووقت الامتلاك الأمثل (التي ينبغي أن تكون هي نفسها للإثارة مع 340 نانومتر و 380 نانومتر وعادة ما يتراوح بين 50-150 مللي ثانية).
      ملاحظة: تقليل التعرض Fura-2 تحميل خلية إلى أي ضوء لتجنب فوتوبليتشينج الصبغة.
   2. الصورة صورة مرجعية، ومارك الخلايا كمناطق للفائدة (العائد على الاستثمار). وضع علامة على عائد الاستثمار الأخير في منطقة حيث لا توجد خلايا موجودة وتعريفه الخلفية.
   3. إكمال الإعداد، وتبدأ بقياس معدل اقتناء s 5.
      ملاحظة: الخلايا سيكون بالتناوب مضيئة مع الإثارة الخفيفة من 340 نانومتر و 380 نانومتر، والأسفار المنبعثة (> 510 نانومتر) سوف يتم جمعها باستخدام الكاميرا CCD. سيتم عرض الصور fluorescence إشارات F340 شمال البحر الأبيض المتوسط و F380 شمال البحر الأبيض المتوسط، فضلا عن النسبة (F340 nm/F380 nm) في windows ثلاثة. الرسوم البيانية بالطبع وقت الشدة fluorescence رويس الفردية يعني سيتم عرض قيم أيضا باستمرار.
   4. إضافة الحلول في عدد دورة السليم وفقا لتصميم التجربة:
      1. لرفع التدبير المستحثة مستضد [Ca^{2 +}]_أنا، تطبيق كما هو موضح في الشكل 2أ 2، حل حقنه 2 بعد دورة 20، والتوقف عن تسجيل بعد دورة 150.
      2. لقياس الارتفاع الناجم عن مجمع 48/80 [Ca^{2 +}] تطبيق_i,كما هو موضح في الشكل 2ج، الحل حقنه 3 بعد دورة 20، والتوقف عن تسجيل بعد دورة 150.
      3. لقياس الارتفاع من [Ca^{2 +}]_أنا أثارت قبل سوسي، كما هو مبين في الشكل 2د، تطبيق الحل حقنه 4 بعد دورة 10، تطبيق الحل حقنه 5 بعد دورة 70، وتطبيق الحل حقنه 4 بعد دورة 120، تطبيق الحل حقنه 1 بعد دورة 150، وإيقاف التسجيل بعد دورة 220.
   5. بعد الانتهاء من القياس، تحويل النتائج إلى نسبة جدول يحتوي على كثافات محسوبة لكل الأطوال الموجية الإثارة مع أو بدون تصحيح الخلفية، فضلا عن قيم نسبة مع أو بدون تصحيح الخلفية لكل عائد الاستثمار وكل نقطة قياس الوقت. في البرنامج، واقتناء التتالي اضغط الأزرار: "كتر ابدأ"، ووضع علامة على كل شيء "،" تحويل كافة "،" علم وظائف الأعضاء القياسات "،" حسنا، "موافق". حفظ الملفات كالجداول ومداخن صورة للتحليل دون اتصال.

3-بيتا-هيكسوسامينيداسي الإفراج عن القياس في هذه الشركات

1	بعد الاجتماع الوزاري (12 – 15 يوما) 1 × 106 خلايا/مل
2	حل الأسهم المضادة-التثقيف-الأجسام المضادة (IgE)
3	حل الأسهم يمتلكهما التثقيف
4	حل الأسهم 48/80 مركب
5	إيونوميسين
6	96-جيدا اللوحة السفلي على شكل v
7	96-جيدا لوحات مسطحة القاع
8	أنابيب بلاستيكية للطرد المركزي (15 مل)
9	الممصات المصلية
10	الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2)
11	مقاعد البدلاء للطرد المركزي
12	قارئ لوحة ميكروتيتير لقياس الكثافة الضوئية
13	ماصة متعددة القنوات (20 – 200 ميكروليتر)
14	هيموسيتوميتير

الجدول 3: مواد للخطوة 3.

1. قبل القياسات، إعداد المواد المدرجة في الجدول 3.
   ملاحظة: هيدروليزيس β-هيكسوسامينيداسي صدر من الإشراف على تحفيز فنيتروفينيل-أسيتيل-د-الجلوكوزامين (بنج) في الرتبة فنيتروفينول ون-أسيتيل-د-الجلوكوزامين. Β-هيكسوسامينيداسي في العينة تبلغ متناسباً مع مقدار فنيتروفينول التي ستشكل. في بيئة عالية حموضة من "التوقف عن الحل"، فنيتروفينول موجود الكامل ديبروتوناتيد فنيتروفينولات، ويمكن الكشف عنها بواسطة امتصاص الضوء في 405 نانومتر.
2. إعداد تيرودي في محلول يحتوي على 130 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 1.4 مم كاكل₂، 1 مم مجكل₂، 10 مم حبيس، الجلوكوز 5.6 ملم، وجيش صرب البوسنة 0.1%. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم.
3. إعداد حل تحلل بإضافة وحدة تخزين 1% من Triton X-100 الحل تيرودي.
4. إعداد الحل إيقاف تتألف من 200 مم جليكاين وضبط درجة الحموضة إلى 10.7 مع هيدروكسيد الصوديوم.
5. إعداد الحل الحل (4-نيتروفينيل 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) بنج بتذويب بنج في حامض الستريك 0.4 متر إلى تركيز نهائي من 4 مم.
6. حساب كمية الخلايا بحاجة للفحص (القيام الفحص في تكرار). استخدام 200,000 الشركات العسكرية الخاصة لكل بئر. استخدام الآبار 2 كعناصر سلبية (الحل تيرودي دون أي سيكريتاجوجويس مثل DNP أو مجمع 48/80) والآبار 2 كعناصر إيجابية (الحل تيرودي مع 10 ميكرون إيونوميسين) لكل الوراثي.
7. نقل الخلايا في أنبوب بلاستيك أجهزة الطرد مركزي 15 مل وضبط مستوى الصوت إلى 15 مل مع الحل تيرودي للطرد المركزي في 200 x ز 4 كحد أدنى إزالة المادة طافية مع ماصة باستور وريسوسبيند الخلايا في حل تيرودي للخلايا 2 × 10⁶ /mL.
8. نقل 100 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة وكذلك إلى 96، حسنا الخامس-أسفل لوحة جيدا. إضافة 25 ميليلتر من التحفيز أو حل السيطرة لكل بئر (وفقا لنظام بيبيتينج هو موضح في الشكل 3أ). احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
9. وقف رد الفعل بوضع لوحة 96-جيدا على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 120 x ز. نقل 120 ميليلتر من المادة طافية استخدام ماصة متعددة القنوات للوحة مسطحة القاع 96-جيدا ووضعه على الجليد. عناية تجنب لمس الكريات الخلية، ولكن نضح تماما المادة طافية.
10. إضافة 125 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الكريات الخلية. احتضان الكريات خلية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند لهم بعد الحضانة بتكرار بيبيتينج (حوالي 5 مرات).
11. "الماصة؛" 25 ميليلتر من الحل بنج (4 ملم) في الآبار المطلوبة من لوحة مسطحة القاع 96-جيدا جديدة. إضافة 25 ميليلتر من كل المادة طافية إلى الحل بنج المعدة، فضلا عن 25 ميليلتر من كل خلية ليستي.
12. احتضان دفعات رد فعل ح 1 في 37 درجة مئوية. وبعد التفريخ، "الماصة؛" 150 ميليلتر حل التوقف لكل بئر التوقف عن رد فعل.
13. تحليل اللوحة مع قارئ ميكروسكوبية باستخدام إعداد المزدوج-الطول الموجي في 405 نانومتر مع مرجع 630 نيوتن متر للطرح التلقائي في الخلفية. في برنامج اقتناء، ووضع علامة في الخانة "مرجع"، وفي القائمة عنصر برنامج "امتصاص"، حدد "630 نيوتن متر" من القائمة المنسدلة. إذا كانت كثافة بصرية للعينات عالية جداً، تعد تمييع التحقيق مناسبة قبل هائي.
14. حساب النسبة المئوية للإصدار بيتا-هيكسوسامينيداسي وفقا للمعادلة التالية:
    
    حيث الإصدار [%] المئة من الإصدار بيتا-هيكسوسامينيداسي محددة، [المادة طافية] هي الخلفية تصحيح امتصاص المادة طافية، وهو [] الخلفية تصحيح امتصاص الخلية المقابلة ليستي.

النتائج

هذه الشركات كانت معزولة من الفئران البرية النوع 3 (C57BL/6N) بالغسل داخل ومثقف كذلك في المتوسط ربمي تستكمل مع السفح 20% و 1% بكتيريا القلم حضور عوامل النمو (إيل-3 الساعة 10 نانوغرام/مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة في 30 نانوغرام/مليلتر تحت العقيمة هوميديفيد الأوضاع في 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون₂. تم تغيير في المتوسط على أيام 2 و 9 بعد عزل الخلية. مورفولوجيا خلية تم تحليلها باستخدام نقل الضوء على تصوير DIC (انظر الشكل 1أ، ب). ال...

المناقشة

يمكن استخدام نماذج MC بنجاح لدراسة تحبب MC، إنزيمية، والالتصاق، فضلا عن توضيح مسارات توصيل إشارات تشارك في تفعيل المؤتمر الوزاري داخل الخلايا. بعض الباحثين استخدام نماذج MCs البشرية، مثل خطوط مخلدة (LAD2 و HMC1) أو الإشراف البشرية المستمدة من الحبل الدم الخلايا السلف (CD133 +) وخلايا الدم المحيطية السلف (CD34 +). ويفضل آخرون القوارض نماذج MC، مثل خلد (لوكيميا الفئران basophilic خط MC ربل-2 ح 3) أو الابتدائية مثقف (ماوس المشتقة من نخاع العظام MCs بممكس، هذه الشركات) نماذج. مورين الإشراف الابتدائي يمكن استخدامها لتحليل الد...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
21875034		حراري علمي متوسط
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R & D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM & nbsp ؛	ثيرمو فيشر Scientific	F1221
بلورونيك F-127	سيجما-ألدريتش	P2443
DNP-HSA	سيجما ألدريتش	A6661
المضادة DNP-الأجسام المضادة	سيجما ألدريتش	D-8406
بنستريب	ثيرمو	علمي 15140122
مركب 48/80	سيجما ألدريتش	C2313
4- (1،1،3،3-تتراميثيلبوتيل) فينيل بولي إيثيلين جلايكول	سيجما-ألدريتش	X100
4-نيتروفينيل 2-أسيتاميدو-2-ديوكسي-&بيتا-D-جلوكوبيرانوزيد	سيجما-ألدريتش	N9376
غرفة التصوير CoverWell	سيجما-ألدريتش	GBL635051
96 جيدا ، قاع على شكل حرف V   ؛	لوحات Corning	3896
96-Well ، قارئ	Greiner Bio-One	655180
Microtiter ذو القاع المسطح مع برنامج "i-control"   ؛	Tecan	Nano Quant ، لوحة M200 Pro
اللانهائية ذات القاع المسطح   ؛	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية	Sarstedt	62.547.254
قوارير الثقافة (25 سم)	Greiner Bio-One	69160
غطاء ينزلق النظارات المستديرة ؛ ø ؛ 25 مم ؛ رقم 1	Menzel	CB00250RA1
مقياس الدم	VWR	631-0696
المجهر المقلوب	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x / 1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC مجموعة المرشحات Fura 2 & nbsp ؛	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
سوتر مصدر الضوء أحادية		اللون برنامج اكتساب التصوير Lambda DG-4
	Zeiss	AxioVision 4.8.2
نظام تطبيق الحل المغذي بالجاذبية	مخصص	4 قنوات
15 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية	Sarstedt	62،554،502
مقعد الطرد المركزي	Heraeus	Megafuge 1.0R