طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

ملخص

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

الملخص

فول الصويا (ماكس جليكاين (لام) مير.) هو أنواع محاصيل هامة، وأصبحت نموذجا البقول للدراسات الخاصة بالمسارات الجينية والبيوكيميائية. ولذلك، من المهم إقامة نظام تعبير الجيني عابر فعالة في فول الصويا. هنا، نحن تقرير بروتوكول بسيط لإعداد بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيقه للتحليلات الفنية عابرة. ووجدنا أن يترك أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا أدى إلى كميات كبيرة من بروتوبلاستس عالية الجودة. عن طريق تحسين أسلوب تحويل الكالسيوم توسطت شماعة، حققنا التحول عالية الكفاءة باستخدام فول الصويا أونيفولياتي بروتوبلاستس. هذا النظام يوفر نموذج كفاءة وتنوعاً للنظر في آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية من فول الصويا، وقد تساعد على تحسين فهم العمليات الخلوية والتنموية والفسيولوجية المتنوعة من البقوليات.

المقدمة

بروتوبلاستس هي الخلايا النباتية التي تحتوي على جدران الخلايا إزالة. كما يحتفظون بمعظم الميزات وأنشطة الخلايا النباتية، بروتوبلاستس هي نظام نموذجا جيدا لمراقبة وتقييم الأحداث الخلوية المتنوعة، وهي أدوات قيمة لدراسة تهجين جسمية¹ ومصنع التجدد². بروتوبلاستس على نطاق واسع أيضا استخدمت محطة التحول^3،،من⁴⁵، نظراً لجدران الخلايا إلا تعرقل مرور الحمض النووي في الخلية. بروتوبلاستس تمتلك بعض الاستجابات الفسيولوجية والعمليات الخلوية للنباتات سليمة، ومن ثم تقديم قيمة أساسية في البحوث الأساسية لدراسة البروتين سوبسيلولار التعريب

البروتوكول

1-نمو النباتات

1. زرع بذور فول الصويا 5-10 (ويليامز 82) في وعاء 13 سم في الدفيئة ظروف طويلة أيام (الخفيفة في 1,500 µmol m^-2 s^-116 ح) عند 25 درجة مئوية على مزيج التربة المخصصة لفول الصويا (1: نسبة 1:1 للتربة، البيرليت ونسف الرمال).

2-إعداد بلازميد الحمض النووي

1. استخدام تلميح ماصة معقمة أو مسواك، اختيار مستعمرة واحدة أو الأسهم والغليسيرول المجمدة من كولاي يحمل بلازميد يحتوي على الجينات للفائدة وتطعيم أنه في 20 مل بيرتاني لوريا (رطل) المتوسطة السائل مع المضادات الحيوية المناسبة في قارورة 50 مل.
2. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في شاكر. جمع البكتيريا سينتريفوجينج التع....

النتائج

تم اختبار أجهزة مختلفة من فول الصويا 10-يوم قديمة لإعداد جبلة مجردة (الشكل 1)، ولوحظت غلة تحت المجهر (الشكل 2). كان لا يكاد يهضم جدران الخلايا من hypocotyl وابيكوتيل، وبقيت بعض الخلايا المتصلة ببعضها البعض (الشكل 2، ج 2). وفي كوتيليدون (الشكل 2D) والجذر (الشكل 2A)، أزيلت جدران الخلية فقط في جزء صغير من الخلايا. وفي المقابل، .......

المناقشة

هذا البروتوكول لعزل بروتوبلاستس فول الصويا والتطبيق لدراسات التعبير عابر قد تم اختبارها بدقة، ويعمل بشكل جيد للغاية في المختبر. الإجراءات بسيطة وسهلة، وتتطلب معدات عادية وأقل تكلفة. لدينا بروتوكول ينتج كميات كبيرة من بروتوبلاستس موحدة وعالية الجودة بالمقارنة مع أساليب سبق الإبلاغ عنها^{34،35،36،،}من³⁷³⁸. ومع ذلك، نظراً لوجود العديد من العوامل التي تؤثر على غلة جب.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
MES	Sigma Aldrich	M8250-100G
Cellulase CELF	Worthington Biological Corporation	LS002611
Pectolyase Y-23	BioWorld	9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10	yakult	10g
MACEROZYME R-10	yakult	10g
Mannitol	ICN الطب الحيوي	152540
CaCl 2 < / sub>	Fisher	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	Sigma Aldrich	D5545-5G
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-1kg
KCl	Fisher	P217-500g
MgCl 2< / sub>	Sigma Aldrich	M8266-100g
PEG4000	Fluka	81240
شبكة نايلون	كارولينا	652222N
لوحات زراعة الأنسجة الولايات	المتحدة الأمريكية Scientific	CC7682-7506
شفرات الحلاقة	فيشر	12-640
مقياس الدم	hausserscientific	1483
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
EZNA البلازميد miniprep kit	أوميغا	D6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep	Kit Thermo Scientific	K0502
الطرد المركزي 5810	eppendorf	5811000827
الطرد المركزي 5424	eppendorf	22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller	Jencons	14526-202
Zeiss 710 مجهر متحد البؤر	Zeiss	N / A
غير لاصق ، أنابيب Microfuge خالية من RNase ، 1.5 مل	Ambion	AM12450
15 مل أنابيب الطرد المركزي	Denville	C1018-P
50 مل أنابيب الطرد المركزي	Denville	C1060-P
مصل العجل حديثي	الولادة التربة 16010159
	العلمية الحراريةحضانة
بيرلايت	فيجورو	100521091
طوربيد	JKS Ventures
LB Broth ، لينوكس (مسحوق)	فيشر	BP1427-500

إنجرام ساند