يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم التعبير عن العديد من الجينات في أدمغة الأجنة، وبعضهم يعبر عن استمرار في الدماغ بعد الولادة. لهذه الجينات، وأعرب عن إصرار أنها قد تعمل لتنظيم عملية التنمية و/أو الوظيفة الفسيولوجية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة. للتحقيق في الوظائف العصبية الحيوية من جينات محددة في الدماغ، من الضروري إلغاء تنشيط الجينات في الدماغ. هنا، نحن تصف طريقة ستيريوتاكسيك بسيطة لإلغاء تنشيط التعبير الجيني في المخطط الفئران المحورة وراثيا في إطارات زمنية الولدان. كانت ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل جينات الفئران في يوم بعد الولادة (ف) 2 بجراحه الدماغ ستيريوتاكسيك. تم الكشف عن الجينات مراسل تدتوماتو في المخطط P14، مما يوحي نجاح لجنة المساواة العرقية-لوكسب يتوسط جزئ الحمض النووي في الخلايا سترياتال ترانسدوسيد إف. كذلك نحن التحقق من صحة هذا الأسلوب من ميكروينجيكتينج الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في الفئران P2Foxp2fl/فلوريدا . وسم مزدوجة للتجارة والنقل و Foxp2 أظهرت أن الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء تفتقر إلى إيمونوريكتيفيتي Foxp2 في المخطط P9، مما يوحي بفقدان البروتين Foxp2 في لجنة المساواة العرقية اجفب إف ترانسدوسيد سترياتال الخلايا. مجتمعة، هذه النتائج تبرهن حذف وراثية فعالة بالفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية ستيريوتاكسيكالي ميكروينجيكتيد في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة من الفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد. وفي الختام، لدينا تقنية ستيريوتاكسيك يوفر منبرا سهلة وبسيطة للتلاعب بالجينات في أدمغة الفأر حديثي الولادة. هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها فقط لحذف الجينات في مناطق معينة من أدمغة الأطفال حديثي الولادة، ولكن أيضا يمكن استخدامه لحقن العقاقير الدوائية، تتبع الخلايا العصبية، أوبتوجينيتيكس المعدلة وراثيا والبروتينات تشيموجينيتيكس، مؤشرات نشاط الخلايا العصبية و الكواشف الأخرى في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة.
المقدمة
الدراسات الحديثة لهيكل ووظيفة المخ عادة ما تتطلب التحوير الوراثي لجينات معينة في الخلايا العصبية. وقد تم إنشاؤها للتحقيق في وظائف جينات مختلفة، الفئران المحورة وراثيا تحمل الآليلات متحولة، بما في ذلك بشكل روتيني خروج المغلوب والمغلوب في الآليلات. جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار أسلوب قياسي لتسليم المخدرات وتتبع وفيروسات أخرى الكواشف محلياً إلى مناطق معينة من أدمغة القوارض1،2. تطبيق جراحة الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المحورة وراثيا يسمح أحد للتلاعب وراثيا بوظيفة الجينات ونشاط الخلايا العصبية في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في الدماغ الماوس. التلاعب الخلية بنوع خاص يوفر نهج قوية فك الوظائف العصبية في مجمع الدوائر العصبية من المخ3،،من45.
تبدأ التنمية العصبية للجهاز العصبي في المراحل الجنينية المبكرة، والعمليات الإنمائية التي تستمر بعد الولادة حتى فترة الأحداث. ويشمل نضج الجهاز العصبي بعد الولادة الأسلاك متشابك دقيقة من الدوائر العصبية، هو أمر ضروري للوظائف الفسيولوجية والإدراكية ل الدماغ6. ولذلك، دراسة الأحداث التنموية التي تحدث في windows وقت حديثي الولادة مهم ليس فقط لفهم التنمية العصبية الطبيعية، ولكن كما يجوز تقديم رؤى في الآلية المرضية للنماء العصبي والاضطرابات العصبية7 ،8. على الرغم من أن أساليب جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار متاحة2،9، البروتوكولات القليلة المتاحة على شبكة الإنترنت لعملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الفئران حديثي الولادة10،11. في الواقع، ميكروينجيكشنز ستيريوتاكسيك من الكواشف في أدمغة الفأر المواليد الجراء صعبة، لأن رأس ألجرو الولدان هشة جداً لتكون ثابتة في الجهاز ستيريوتاكسيك القياسية. على الرغم من ذلك، يتم تطبيق عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المعدلة وراثيا ممكنة للفئران حديثي الولادة12. وهنا يصف لنا طريقة بسيطة مع إعداد محلية صنع لإجراء عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الجراء الماوس حديثي الولادة. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يسمح أحد لحذف الجينات فلوكسيد مشروط ميكروينجيكتينج ريكومبيناسي إف-الإعراب عن "الحمض النووي لجنة المساواة العرقية" في المخطط لمراسل جينات الفئران والفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد إفراجاً مشروطاً. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على تسليم المواد الكاشفة في المخطط الولدان من الفئران البرية من نوع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
عليها البروتوكولات الحيوانية الموضحة هنا بالعناية بالحيوان ولجان جامعة يانغ مينغ الوطنية استخدام.
1. إعداد الحامل للمواليد الجراء في الجهاز ستيريوتاكسيك
- جعل علبة الرأس: قص الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل (طويلة 15 ملم) في الشكل الذي يناسب رأس الجراء الأطفال حديثي الولادة عن طريق إزالة 1/5 لجدار الأنبوبة.
- أن مربع تلميح ماصة مع الحجم الصحيح الذي يناسب مع قاعدة التمثال لجهاز ستيريوتاكسيك، وإزالة الغطاء العلوي. إلصاق درج الرأس بإعدادها في الخطوة 1، 1 ونسيج كاسيت تضمين على القاعدة علبة تلميح بمادة لاصقة ساخنة-ذوبان. ارتفاع كاسيت تضمين الأنسجة هو 7 مم، الذي يستخدم لدعم ألجرو في الرقبة والجسم في موقف ثابت الرأس.
- ضع الإعداد كلها في جهاز ستيريوتاكسيك قياسية.
2-إعداد 30 جرام الحقن بالإبر الفولاذ المقاوم للصدأ
- قبل تنظيف 30 إبر المحاقن ز التي نقع عليها في كلوروفورم لمدة 3 أيام.
- استخدام الملقط بعناية وبطء سحب الإبرة من مركزها البوليبروبيلين في غطاء كيميائية.
- أغسل الإبر مع الإيثانول المطلقة لمدة 20 دقيقة تليها يشطف الإيثانول 70% ل 3 × 10 دقيقة على شاكر 50 لفة في الدقيقة. واسمحوا الهواء الإبر الجافة، وتخزين الإبر تنظيفها في مربع نظيف في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
3-إعداد محول لأنابيب Microinjection
- قم بتوصيل المحاقن ميكروليتير إبرة حقن 30 جرام مع أنبوب البولي إثيلين PE10 (أنبوب PE10). إعداد محول أنابيب (أنابيب PE20) البولي إثيلين PE20 لسد إبرة الحقن والمحاقن ميكروليتير. استخدام المحول ضروري، لأن قطر الأنبوب PE10 أصغر بكثير من أن الإبرة للمحاقن ميكروليتير ز 26.
- إعداد الأنابيب للمحاقن ميكروليتير: الاتصال إبرة حقن 30 جرام تنظيفها مسبقاً مع 5 سم أنبوب PE20، وختم التقاطع مع الغراء الفورية. هذا محول الأنابيب قابلة لإعادة الاستخدام.
ملاحظة: إذا كانت الإبرة لحقنه microinjection ز 30، إعداد (الخطوة 3.1) واستخدام هذا المحول (الخطوة 3، 3) ليس من الضروري. - قم بتوصيل مهايئ الأنابيب (أعد الخطوة 3.1) مع حقنه ميكروليتير (10 ميليلتر).
- قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب PE10 (لا تزيد عن 60 سم) على الإبرة 30 جرام من محول أنابيب PE20. جبل إبرة حقن ز 30 جديدة على الطرف الآخر من أنبوب PE10.
4-تحميل أنبوب Microinjection مع يعقم الماء المقطر وصبغ والفيروسات
- إزالة المكبس المحاقن ميكروليتير. استخدام المحاقن ز 25 لتحميل المحاقن ميكروليتير ولها أنبوب PE متصلة مع يعقم الماء المقطر لإزالة الهواء من الأنبوب.
- وضع المكبس مرة أخرى إلى المحاقن ميكروليتير، ودفع المكبس حتى 2 ميليلتر من بقايا الماء المقطر في البرميل. لا تدع حجم الماء المقطر أصبح أقل من 2 ميليلتر.
- جبل بعناية المحاقن ميكروليتير على ضخ حقنه معدل التدفق الجزئي.
- "الماصة؛" كميات صغيرة من صبغة 0.1% الأخضر سريع (أعد في المحلول الملحي 0.9% وتصفيتها مع 0.22 ميكرومتر التصفية) والسوائل الفيروس بقطعة من بارافيلم.
- سحب كمية صغيرة من الهواء لجعل فقاعة هواء مرئية على مفترق الطرق بين 30 جرام حقن إبرة وأنبوب PE10 متبوعاً بتحميل ميليلتر 0.7 الخضراء السريعة التي تمت تصفيتها في الأنبوب اختبار تدفق السوائل في الأنابيب microinjection.
- سحب آخر كمية صغيرة من الهواء لجعل فقاعة هواء ثاني متبوعاً بتحميل الفيروسات السوائل في الأنابيب microinjection.
- إرفاق وتأمين إبرة microinjection ز 30 في الذراع لجهاز ستيريوتاكسيك.
5-تخدير فئران حديثي الولادة بانخفاض درجة حرارة الجسم
- ألجرو في الأكمام قفاز مطاط وتزج أنه في الثلج المجروش حتى الرقبة لمدة 5 دقائق.
- قرصه القدمين ألجرو مع الملقط للتأكد من استجابة انسحاب لا من قدميه.
- وضع ألجرو الأكمام قفاز مطاط في علبة الرأس ووضع بعض الثلج المجروش حول الأكمام مطاط للحفاظ على البارد للتخدير انخفاض درجة حرارة الجسم.
- تطبيق مرهم البيطرية في عيون ألجرو لمنع جفاف بينما تحت التخدير إذا كان ذلك ممكناً.
6-microinjection
- إعداد عملية جراحية معقمة بمحو الصك ستيريوتاكسيك تماما مع الإيثانول 70%. تعقيم الأدوات الجراحية بغمر لهم في الإيثانول 70%.
- فرك رأسه ألجرو مع الإيثانول 70%. تحديد موقع لامدا معلما في الجمجمة وعلامة لامدا بقلم ماركر. تهدف نصيحة إبرة إلى لامدا، وتعيين الأمامي الخلفي (AP) واحداثيات الآنسي الجانبي (ML) كصفر.
- تحريك ذراع الحقن إلى الموقع المستهدف وفقا لإحداثيات س وص للموقع المستهدف. للمخطط يوم بعد الولادة (ف) 2 الجراء، الإحداثيات: وكالة اسوشييتد برس، مم +2.4 لياقته لامدا؛ مل، تيار الأفقي مم من خط الوسط؛ الظهري-البطني (DV)، مم و− من الجمجمة. وضع علامة على موضع الصبغة الخضراء سريعة في أنبوب PE10 بقلم.
- إسقاط إبرة حقن 30 غ ببطء لاختراق عن طريق الجلد والجمجمة ومن ثم إحضار تلميح إبرة حتى يتوقف على سطح الجمجمة. تعيين تنسيق DV كصفر.
- إسقاط إبرة حقن 30 غ ببطء حتى تصل إلى تنسيق DV من الموقع المستهدف. الانتظار لمدة 1 دقيقة للسماح حمة استئناف شكل عادي. قم بتشغيل برنامج microinjection (100 nL/دقيقة).
- تأكد من أن علامة الصبغة الخضراء سريعة تتحرك في أنبوب PE لضمان يتم حقن السائل فيروس في المخ.
- انتظر 1 دقيقة بعد انتهاء microinjection، وثم ببطء وتدريجيا إحضار الإبرة للارتفاع 1/2 من عمق العنف المنزلي خلال 30 ثانية. وبعد 30 ثانية، سحب الإبرة ببطء من الرأس ألجرو.
- كرر الخطوة 6، 2 إلى 6.7 حتى يتم إكمال ميكروينجيكشنز من جميع المواقع المستهدفة.
7-بعد الجراحة استرداد ألجرو
- الاحماء ألجرو لمدة 20 دقيقة في حاضنة 33 درجة مئوية. تحقق من استرداد ألجرو من انخفاض حرارة الجسم التخدير كل 5 دقائق حتى ألجرو قد استعاد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
- العودة ألجرو إلى السد بعد ألجرو هو تعافي تماما.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للمجموعة الأولى من التجربة، ونحن ميكروينجيكتيد 200 nL فيروسات AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية، 1/10 إضعاف في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو) التي تعبر عن ريكومبيناسي الحمض النووي Cre تنصهر مع التجارة والنقل في المخطط P2 من الفئران Ai14. الفئران Ai14 إكسبريس تدتوماتو مراسل الجينات عند الحذف بوساطة لجنة المساواة العرقية من كاسيت وقف يحف لوكسب (فلوكسيد) (الشكل 2 واو). كان حصاد P14 العقل المدبر ل immunostaining تدتوماتو والتجار...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الدراسة الحالية، ونظهر أسلوب ستيريوتاكسيك بسيطة وموثوق بها لحقن الفيروسات إف في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. ونحن ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل الفئران في P2 وثم تحليل تعبير الجينات مراسل في P14. ووجدنا إف ترانسدوسيد الخلايا الحاملات للتجارة والنقل في جميع أنحاء المخطط على المستويات روستروكودال. وعلاوة على ذلك، شارك ما يقرب من جميع بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا أعرب عن تدتوماتو مراسل الجينات في الخلايا سترياتال، مما يوحي جزئ الحمض النووي لوكسب لجنة ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا تمنح MOST104-2311-B-010-010-MY3، MOST106-2321-ب-010-012، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية في منح المؤسسات الوطنية-EX106-10429NI، ومنحة "البرنامج مركز بحوث المناطق" الموصى بها من وزارة التربية من خلال مركز أبحاث الدماغ، جامعة يانغ مينغ الوطنية في تايوان، ، ومنح "زمالات ما بعد الدكتوراه" MOST106-2811-ب-010-031 (س-أ)، MOST105-2811-ب-010-036 و MOST106-2811-ب-010-030 (حاء-مجموعة).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 30G PrecisionGlide إبرة | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER حقنة | هاميلتون ؛ | 80300 | 30G إبرة مناسبة لأنبوب PE10 ؛ تحتاج إبرة 26G إلى محول PE20 |
| أنابيب البولي إيثيلين PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| أنابيب البولي إيثيلين PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| مضخة حقنة معدل التدفق | الصغير مضخة مضخة الدقة الأطول | TJ-2A (وحدة تحكم) و L0107-2A (وحدة القيادة) | |
| 25G حقنة | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| أخضر سريع | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1٪ |
| أدوات تجسيمية قياسية | RWD علوم الحياة | 68037 | بدون استخدام 68030 محول الفئران / حديثي الولادة |
| الأجسام المضادة للجسم المضاد | ABCAM | ab16046 | الأرنب متعدد النسيلة إلى FOXP2 ، 1: 4،000 |
| الأجسام المضادة المضادة لطلب تقديم العروض | Abcam | ab65856 | ماوس أحادي النسيلة إلى RFP ، 1: 1,000 |
| BX63 مجهر | أوليمبوس | BX63 | |
| LSM 880 مجهر متحد البؤر | Zeiss | LSM 880 | |
| الماعز مضاد للأرانب مترافق Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987 ، 5.506x1013< / sup> (GC / mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core ، معهد العلوم الطبية الحيوية ، أكاديميا سينيكا ، تايوان | N / A | 1x1014< / sup> (GC / ml) |
| B6. CG-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6 (Cg) -Foxp2tm1.1Sfis / CfreJ | مختبر جاكسون ؛ | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco' s فوسفات مخزن محلول ملحي | Corning سيلجرو | 21-030-CVR |
المراجع
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
