هنا يمكننا وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من المواقع الاستقرائي بما في ذلك البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية واستنزاف الليمفاوية المساريقي العلوي، ومواقع المستجيب بما في ذلك بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء المناعي الأمعاء الصغيرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجهاز المناعي المعوي تلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي عن طريق توليد استجابات متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal بينما تصاعد فعالية الاستجابات المناعية ل enteropathogenic الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، أنه أصبح من الواضح أن الحصانة المعوية المحلية تأثيراً عميقا على الحصانة البعيدة والجهازية. ولذلك، من المهم دراسة كيفية فعل استجابة مناعية معوية وما نتائج الاستجابة المناعية. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من مواقع الاستقرائي الأمعاء الدقيقة مثل البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية وتجفيف الغدد الليمفاوية المساريقي العلوي والمستجيب مثل بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء. ويضمن هذا الأسلوب عزل عدد كبير من الخلايا الليمفاوية من أنسجة الأمعاء الصغيرة مع النقاء الأمثل والبقاء والحد الأدنى من التلوث يغلب المتبادل ضمن قيود زمنية مقبولة. القدرة التقنية على عزل الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى من الأنسجة المعوية يمكن فهم الاستجابات المناعية لالتهابات الجهاز الهضمي، وأمراض السرطان، وأمراض التهابات.
المقدمة
الهضمي (غي) بالعديد من الطيات ونتوءات تمثل واجهة أكبر فصل الهيئة الداخلية والبيئة الخارجية. الأمعاء الجهاز المناعي يلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي. استمرار تعرضه لمولدات المضادات الغذائية، commensal البكتيريا والجراثيم الممرضة. على هذا النحو، يجب أن تظل متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal مع الحفاظ على القدرة على سرعة توليد استجابة مناعية فعالة للميكروبات انتيروباثوجينيك1. ويمكن تقسيم المناعي المعوية تشريحيا إلى مواقع الاستقرائي، حيث يتم تنشيط لمفاوية الساذج من مستضد تقديم الخلايا تحمل مستضدات من مخاطية الأمعاء، ومواقع المستجيب، حيث يمارس تنشيط الخلايا الليمفاوية المحددة وظائف المستجيب2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب على الحيوانات كانت تجري وفقا للمبادئ التوجيهية "المعهد الوطني للصحة" ووافق ستوني بروك جامعة المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة.
ملاحظة: تأكد من أن يتم منح جميع الموافقات قبل تنفيذ الإجراءات.
1-حل إعداد
-
هجبج (حبيس، ل الجلوتامين والبنسلين/ستربتوميسين مع الجنتامايسين)، 100 ×
- مزيج ز 59.6 حبيس (النهائي 500 ملم)، 14.6 ز لام الجلوتامين (نهائي 200 ملم)، 1 × 106 يو البنسلين (2,000 U/mL النهائي) وز 1 ستربتوميسين (2 مغ/مل النهائي) 2.5 ملغ الجنتاميسين (5 ميكروغرام/مل النهائي). إضافة RPMI 1640 إلى 500 مل. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصودي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد تمثيل تخطيطي للبروتوكول (الشكل 1). واضح يتم تنظيم الخلايا الليمفاوية داخل الغشاء المخاطي المعوي الاستقرائي ومواقع المستجيب. بير بقع (PP) والغدد الليمفاوية المساريقي العلوي (مليون) تحتوي الخلايا الليمفاوية في مناطق تي خلية منظمة تنظيماً جيدا والمسام ب-الخلية، بينما يحتوي ظهارة الأمعاء على الخلايا الليمفاوية التي توزع أكثر تصطبغ. بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) يحتوي على الخلايا الليمفاوية تصطبغ الموزعة والخلايا اللمفية الواردة ضمن هياكل اللمفاوية المنظم مث.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويرد بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من الأمعاء المخاطية الاستقرائي (مليون و PP) ومواقع المستجيب (حجرة ليرة لبنانية و IEL). وقد وضعت البروتوكول لتحقيق التوازن بين المدخلات (الوقت) والمخرجات (الجدوى والعائد) تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والنتائج. ويضمن البروتوكول أيضا تلوث مقسم عبر الحد الأدنى بين المقصورات ليرة لبنانية و IEL.
وكانت عدة بروتوكولات لعزل الخلايا المناعية من الأمعاء الماوس المنشورة3،،من45<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ويدعم قرارها منحة المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI076457) والأموال المقدمة من جامعة ستوني بروك. Z.Q. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح (K12 GM102778).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| هيبس | فيشر العلمي | BP310-500 | |
| ل-الجلوتامين | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| بيكربونات الصوديوم | فيشر Scientific | S233-500 | |
| مصل الجنين الأبقار | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x محلول الملح المتوازن من هانكس | سيجما ألدريتش | H4641-500ML | |
| 1،4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| سداسي هيدرات كلوريد | الكالسيوم سيجما ألدريتش | 21108-500G | |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | سيجما-ألدريتش | M2670-100G | |
| كولاجيناز ، النوع الأول | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG حل مخزون التدرج (Percoll) ؛ | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء | Biolegend | 420301 | |
| 70-& micro ؛ مصفاة الخلايا المم | Corning | 352350 | |
| 14 مل من مادة البولي بروبيلين ذات الأنبوب المستدير القاع | Corning | 352059 | |
| قارورة Erlenmeyer | كيمبل | 26500R-50mL | |
| المحرك المغناطيسي | ثيرمو | فيشر 50094596 | |
| شريط التحريك | فيشر العلمي | 14-512-148 |
المراجع
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
