مقالة منهجية

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

DOI:

10.3791/57281

⸱

فبراير 28, 2018

 , 
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يمكننا وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من المواقع الاستقرائي بما في ذلك البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية واستنزاف الليمفاوية المساريقي العلوي، ومواقع المستجيب بما في ذلك بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء المناعي الأمعاء الصغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز المناعي المعوي تلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي عن طريق توليد استجابات متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal بينما تصاعد فعالية الاستجابات المناعية ل enteropathogenic الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، أنه أصبح من الواضح أن الحصانة المعوية المحلية تأثيراً عميقا على الحصانة البعيدة والجهازية. ولذلك، من المهم دراسة كيفية فعل استجابة مناعية معوية وما نتائج الاستجابة المناعية. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من مواقع الاستقرائي الأمعاء الدقيقة مثل البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية وتجفيف الغدد الليمفاوية المساريقي العلوي والمستجيب مثل بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء. ويضمن هذا الأسلوب عزل عدد كبير من الخلايا الليمفاوية من أنسجة الأمعاء الصغيرة مع النقاء الأمثل والبقاء والحد الأدنى من التلوث يغلب المتبادل ضمن قيود زمنية مقبولة. القدرة التقنية على عزل الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى من الأنسجة المعوية يمكن فهم الاستجابات المناعية لالتهابات الجهاز الهضمي، وأمراض السرطان، وأمراض التهابات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهضمي (غي) بالعديد من الطيات ونتوءات تمثل واجهة أكبر فصل الهيئة الداخلية والبيئة الخارجية. الأمعاء الجهاز المناعي يلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي. استمرار تعرضه لمولدات المضادات الغذائية، commensal البكتيريا والجراثيم الممرضة. على هذا النحو، يجب أن تظل متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal مع الحفاظ على القدرة على سرعة توليد استجابة مناعية فعالة للميكروبات انتيروباثوجينيك1. ويمكن تقسيم المناعي المعوية تشريحيا إلى مواقع الاستقرائي، حيث يتم تنشيط لمفاوية الساذج من مستضد تقديم الخلايا تحمل مستضدات من مخاطية الأمعاء، ومواقع المستجيب، حيث يمارس تنشيط الخلايا الليمفاوية المحددة وظائف المستجيب2. وتشمل المواقع الاستقرائي هيكل اللمفاوية المنظم بقع في بييير (PP) أن الدراسات الاستقصائية التجويف المعوي مباشرة من خلال عمل الخلايا M المتخصصة والإقليمية استنزاف المساريقي العلوي الليمفاوية (مليون). تتألف مواقع المستجيب بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية)، وهو النسيج الضام تحت الغشاء الطابق السفلي، وظهاره الأمعاء، طبقة وحيد خلية الموجودة أعلى الغشاء الطابق السفلي يحتوي على الخلايا الليمفاوية للسيتولوجيا (IEL). الخلايا الليمفاوية هي الجهات الفاعلة الرئيسية من مناعة التكيفية التوسط من أجل الحماية ضد الالتهابات والأمراض السرطانية وقد يسهم أيضا في إيمونوباثولوجي في أمراض التهابات. من المهم وذات صلة وثيقة بدراسة الخلايا الليمفاوية في هذه متميزة المقصورات المخاطية تشريحية بشكل أفضل فهم وظائفها التعريفي والمستجيب.

ويلزم بروتوكول موحد وبسيط نسبيا لعزل الخلايا الليمفاوية من هذه المقصورات كما يتم التعجيل بعدد المحققين استكشاف محصنة ضد الأحداث التي تحدث في الأمعاء. مجموعات بحثية عديدة قد نشرت البروتوكولات التي تشترك في عدة عمليات مماثلة لعزل الخلايا المناعية من الماوس المقصورات الأمعاء الصغيرة3،4،،من56،7 . ومع ذلك، هناك العديد من الاختلافات التقنية فيما بينها تبعاً لتركيز البروتوكول الفردية. على سبيل المثال، مع التركيز على عزل الخلايا المناعية من ليرة لبنانية، وبروتوكول واحد يدرس أثر ديجيسشنز الانزيمية المختلفة على بقاء الخلية، الخلية السطحية علامة التعبير، وتكوين الخلايا المناعية معزولة5. بروتوكول آخر يسلط الضوء على طريقة سريعة واستنساخه لعزل الخلايا اللمفية دون كثافة استخدام الطرد المركزي6. وأخيراً، توجد بروتوكولات محددة أيضا غرض عزل البالعات وحيدات النوى من طبقات أنسجة مختلفة من الأمعاء الدقيقة7. ويرد هنا، استنساخه بشدة بروتوكول يسمح لعزل متسلسلة من السكان اللمفاويات من حجرة مليون PP، ليرة لبنانية و IEL من الأمعاء.

علينا أن نركز على عزل السكان عالية منقاة من المقصورات ليرة لبنانية و IEL، التي إلى حد كبير خالية من الملوثات من المقصورات المعوية الأخرى. وهذا يستخدم على نطاق واسع تنتج البروتوكول عائد عالية من الخلايا اللمفية أقصى نقية وقابلة للبقاء ضمن قيود وقت مقبول4،9،8،10،11،12. ويضمن هذا البروتوكول أيضا عزل الخلايا الليمفاوية من حجرة ليرة لبنانية و IEL مع الحد الأدنى من التلوث يغلب عبر، مما يتيح فرصة حسنة نية لدراسة الخلايا الليمفاوية في هذه المقصورات متميزة. لمفاوية معزولة يمكن أن تخضع للتلاعب أخرى مثل تدفق سيتوميتريك التحليل أو التحليل الوظيفي. هذا البروتوكول طبقت بنجاح إلى عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس الأمعاء والقولون خلال العدوى البكتيرية مثل الليستريه المستوحدة، typhimurium السالمونيلاو واليرسينيا بسيودوتوبيركولوسيس الإصابات والظروف الملتهبة مثل التهاب القولون الناجمة عن المواد الكيميائية والممرض. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لعزل الخلايا المناعية الفطرية مثل الخلايا الجذعية والضامة العَدلات وحيدات من الماوس الأمعاء الدقيقة والقولون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب على الحيوانات كانت تجري وفقا للمبادئ التوجيهية "المعهد الوطني للصحة" ووافق ستوني بروك جامعة المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة.

ملاحظة: تأكد من أن يتم منح جميع الموافقات قبل تنفيذ الإجراءات.

1-حل إعداد

  1. هجبج (حبيس، ل الجلوتامين والبنسلين/ستربتوميسين مع الجنتامايسين)، 100 ×
    1. مزيج ز 59.6 حبيس (النهائي 500 ملم)، 14.6 ز لام الجلوتامين (نهائي 200 ملم)، 1 × 106 يو البنسلين (2,000 U/mL النهائي) وز 1 ستربتوميسين (2 مغ/مل النهائي) 2.5 ملغ الجنتاميسين (5 ميكروغرام/مل النهائي). إضافة RPMI 1640 إلى 500 مل. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (قبل التعديل، المخزن المؤقت الأصفر/البرتقالي مع الرقم الهيدروجيني حوالي 6.0). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر. قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة، أو عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. بيكربونات هيبيس المخزن المؤقت, 10 x
    1. مزيج ز 23.8 حبيس (نهائي 100 ملم)، 21 ز ناكو3 (النهائي 250 ملم) وإضافة الماء لمل 1,000. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 مع HCl. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر. تخزين في درجة حرارة الغرفة. الرقم الهيدروجيني التغييرات على مر الزمن. إعادة ضبط الأس الهيدروجيني بشكل دوري.
  3. حصاد الإعلام (~ الفئران زجاجة 1/2)
    1. إلى 500 مل RPMI 1640، إضافة 25 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل (5% النهائي)، ومل 5 × 100 هجبج. تخزين تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.
  4. حل ديثيوريثريتول (DTE) (40 مل/الصغيرة الأمعاء)
    1. ميكس 50 مل 10 × الحل الملح المتوازن هانكس و Ca2+-ملغ2+--الحرة, 50 مل 10 × بيكربونات حبيس المخزن المؤقت، و 50 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل (10% النهائي). إضافة 350 مل ح2س و 15.4 ملغ ديثيوريثريتول 100 مل (النهائي 1 مم). إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
  5. حل حمض (يدتا) الإيثيلين (50 مل الصغيرة الأمعاء)
    1. ميكس 50 مل 10 × الحل الملح المتوازن هانكس و Ca2+-ملغ2+--الحرة مع 5 مل 100 × هجبج. إضافة يدتا 0.5 M ميليلتر سين إضافة 260 مل 445 ح2/100 مل (النهائي 1.3 مم). إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
  6. الحل كولاجيناز (30 مل/ليرة لبنانية)
    1. إضافة إلى 500 مل ربمي، 50 مل FBS (10% FBS النهائي)، 5 مل 100 × هبجب ومل 1 0.5 م MgCl2 (النهائي 1 مم) 1 مل م 0.5 كاكل2 (النهائي 1 مم). إضافة كولاجيناز، النوع الأول (100 U/mL النهائي). إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
  7. الكثافة المتدرجة (DG) الحلول
    1. إعداد 1 × DG الأسهم الحل عن طريق خلط حل الأسهم 90 مل المديرية العامة (راجع الجدول للمواد) مع 10 مل من 10 × برنامج تلفزيوني. تبقى عقيمة في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد حل المديرية العامة 44% (8 مل/IEL، و 8 مل/ليرة لبنانية) عن طريق خلط مل 44 × 1 المديرية العامة حل الأسهم و 56 مل RPMI 1640. إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.
    3. إعداد حل المديرية العامة 67% (5 مل/IEL، و 5 مل/ليرة لبنانية) عن طريق خلط مل 67 × 1 المديرية العامة حل الأسهم ومل 33 RPMI 1640. إعداد هذا الطازجة قبل استخدامها.

2-عزل الليمفاوية المساريقي العلوي، الأمعاء، وبييير لبقع

  1. Euthanize الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون الخدر والتفكك عنق الرحم الثانوي. ضع الماوس على ظهرها ورذاذ مع الإيثانول 70%. استخدام مقص لجعل شق خط الوسط، وفتح الجلد وجدار البطن لكشف التجويف الصفاقى.
  2. موقع في الأعور واستخدام الملقط لأجذب الأعور. استخدام الملقط لتحريك الأمعاء بعناية إلى اليمين، فضح في سلسلة مليون أسرة، والذي يتسق مع القولون.
    ملاحظة: صورت خريطة الليمفاوية المساريقي العلوي كان التصريف اللمفاوي وسلسلة من الأمعاء قبل13.
  3. تحديد العقدة السفلي في السلسلة، الموقع الأقرب إلى الأعور. استخدام مجموعة واحدة من الملقط لفهم مساريق/الدهون حوله وإزالة بلطف سلسلة مليون من الأسفل إلى الأعلى كاياالاقل الدهون من حول العقدة الليمفاوية مع مجموعة أخرى من الملقط.
  4. تكمن في سلسلة مليون على منشفة ورقية مبلل مع وسائل الإعلام الحصاد. إزالة مساريق/الدهون المتداول في السلسلة على برج الورق وسحب الدهون قبالة مع مجموعتين من الملقط. مكان مليون في وسائل الإعلام الحصاد الباردة للخطوات اللاحقة في عزلة.
    ملاحظة: يتم تثبيط المناولة (ط) مباشرة من العقد. بدلاً من ذلك، فهم مساريق/الدهون حولها. (ثانيا) من المهم لإزالة الدهون/مساريق قدر ممكن لتحسين بقاء الخلية.
  5. قطع الأمعاء الدقيقة أدناه مصرة البواب وأعلاه الأعور استخدام مقص. سحب الأمعاء ببطء من الدقاق إلى العفج باستخدام مجموعة واحدة من الملقط أثناء إزالة المرفق مساريق/الدهون باستخدام مجموعة أخرى من الملقط.
  6. ضع الأمعاء على منشفة ورقية مبلل مع وسائل الإعلام الحصاد وندف أي مساريق/الدهون المتبقية قبالة مع مجموعتين من الملقط.
    ملاحظة: (ط) يجب التأكد من إزالة الدهون/مساريق قدر ممكن للعائد الأمثل الخلية وقدرتها على البقاء. (ثانيا) إبقاء الأمعاء مبلل طوال هذا والخطوات التالية عن طريق تطبيق وسائل الإعلام الحصاد بشكل دوري.
  7. جمع البقع في بير بإزالتها من الأمعاء مع مقص منحنى. استخدام نطاق تشريح أو المكبرة إذا لزم الأمر (للمبتدئين)؛ بقع معظم بير يجب أن تكون مرئية للعين المدربة. جمع البقع في 5-11 (بشكل نموذجي) بير من الأمعاء. البقع "بييير المكان" في وسائل الإعلام الحصاد الباردة للخطوات اللاحقة في عزلة.
    ملاحظة: في بييير بقع صغيرة، أساسا جولة تضخمات في جدار الأمعاء الخارجي مقابل خط مرفق مساريق.
  8. استخدم الجانب المسطح من الشريحة الملقط و لطف من العفج نحو الدقاق لطرد محتوى البراز والمخاط. كرر مرة واحدة لإزالة معظم المخاط.
    ملاحظة: يمكن إنقاص صلاحية خلية الإزالة كاملة من مخاط والعائد. ومع ذلك، يجب التأكد من الشريحة الأمعاء برفق لتجنب تجريد الزوائد أو إتلاف الغشاء الطابق السفلي.
  9. استخدام مقص جيد مع نهاية حادة على نقطة واحدة وإدراج نهاية حادة في الأمعاء، وقطع الأمعاء مفتوحة طوليا من العفج إلى اللفائفي. جانبياً قص الأمعاء فتحت أربا ~ 2-سم. مكان القطع المعوية في أنبوب 50 مل مخروطية مع 25 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام للخطوات اللاحقة في عزلة.
    ملاحظة: حفظ المقص مبلل مع وسائل الإعلام سوف تساعدهم الشريحة دون عناء عن طريق الأمعاء.

3-عزل الخلايا الليمفاوية من مواقع حثي

  1. عزل الخلايا الليمفاوية من مليون بالناي بلطف من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر استخدام المكبس لحقنه 3 مل. أغسل مصفاة الخلية مع 5 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  2. بيليه مليون-الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.
    ملاحظة: يمكن استخدام المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء لإزالة خلايا الدم الحمراء إذا كان النزيف حدث أثناء الإزالة.
  3. عزل الخلايا الليمفاوية من البقع في بير بحضانة البقع في بير في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 5 مل بريوارميد كولاجيناز الحل في 37 درجة مئوية و 220 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  4. دوامة 15 s بتحديد الحد الأقصى وتصفية يهضم الأنسجة والمادة طافية في أنبوب مخروطي 50 مل من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. بلطف ننأى بقطع الأنسجة المتبقية استخدام المكبس لحقنه 3 مل وغسل مصفاة الخلية مع 5 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  5. بيليه التصحيح الخلايا في بير التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.
    ملاحظة: بير في عزلة بقع قد تكون بعض تلويث الصفيحة بروبريا اللمفاويات والخلايا اللمفية للسيتولوجيا.

4-عزل الخلايا اللمفية للسيتولوجيا من الأمعاء

  1. أغسل قطعة الأمعاء ثلاث مرات مع 25 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام بعكس الأنبوب 10 مرات، وترك القطع المعوية تسوية، وصب قبالة المادة طافية.
    ملاحظة: ينبغي أن يسهل تسوية قطع الأنسجة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. إذا لم يفعلوا ذلك، إشارة إلى أن الكثير من مساريق/الدهون يبقى المرفقة أو المرتبطة فقاعة هواء.
  2. إضافة 20 مل من بريوارميد DTE الحل إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على قطع الأمعاء ونقل إلى قارورة Erlenmeyer siliconized 50 مل تحتوي على إثارة-بار. إثارة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسي ل 20 دقيقة استخدام مغناطيس كبيرة خارج قارورة لعقد إثارة الشريط ونقل الأنسجة وحل العودة إلى الأنبوبة المخروطية 50 مل.
  3. دوامة الأنبوب في الإعداد لنقل س. 10 المادة طافية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر مع الحرص على إبقاء قطع الأنسجة في الأنبوب الأصلي كحد أقصى. عدم تجاهل المادة طافية؛ وتتضمن المادة طافية لمفاوية للسيتولوجيا. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام وتخزين على الجليد.
  4. إضافة 20 مل من بريوارميد DTE الحل إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على قطع الأمعاء ونقل مرة أخرى إلى قارورة Erlenmeyer siliconized 50 مل تحتوي على إثارة-بار. إثارة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسي ل 20 دقيقة استخدام مغناطيس كبيرة خارج قارورة لعقد إثارة الشريط ونقل الأنسجة وحل العودة إلى الأنبوبة المخروطية 50 مل.
    ملاحظة: DTE هو عامل تخفيض تثري لمفاوية للسيتولوجيا.
  5. دوامة الأنبوب في الإعداد لنقل س. 10 المادة طافية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب السابقة التي تحتوي على خلايا من المادة طافية معاملة DTE الأولى (من الخطوة 4، 3) كحد أقصى.
    ملاحظة: تستخدم القطع المعوية المتبقية لعزل الخلايا الليمفاوية من بروبريا الصفيحة. مراقبة الجودة: يمكن إزالة قطعة من الأنسجة ودققت الأشيع التأكد من أن الخلايا الظهارية موجودة والغشاء غير سليمة.
  6. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج المادة طافية في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 8 مل محلول المديرية العامة 44% في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. نقل تعليق الحل/خلية المديرية العامة 44% 8 مل في 17 ملم ø x 100 نمط مم 14 مل البوليبروبيلين الجولة-أسفل الأنبوبة. الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل من الرايت 67% DG الحل. الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 20 دقيقة في RT دون استخدام الفرامل.
    ملاحظة: قد بريتريتيد أنابيب مع المصل البقري منع الخلايا من الالتصاق بجدران الأنبوبة.
  8. نلاحظ أن خلايا قابلة للحياة يشكل عصابة (بافي معطف) في واجهة 44% إلى 67% وخلايا ميتة وبعض الخلايا الظهارية في فيلم مخاطاني في الجزء العلوي من التدرج، وخلايا الدم الحمراء في بيليه. إزالة الطبقة العليا من التدرج إلى حدود ~ 2 سم الواجهة بالشفط بالتخلية. استخدام ماصة باستور لحصاد معطف بافي في الواجهة وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 40 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  9. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.

5-عزل لمفاوية بروبريا الصفيحة من الأمعاء

  1. إزالة الخلايا الظهارية من قطع الأنسجة المعوية بإضافة 25 مل من بريوارميد يدتا الحل إلى قارورة تحتوي على القطع المعوية المتبقية. استخدام قارورة ضجة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسي للحد الأدنى 30 نقطة جذب كبيرة في الخارج من قارورة لعقد إثارة الشريط وتجاهل المادة طافية بعناية مع الاحتفاظ بالقطع المعوية داخل قارورة.
    ملاحظة: (ط) يدتا هو تشيلاتور كالسيوم التي تستهدف تقاطعات تعتمد على الكالسيوم ويعزز مفرزة الخلايا الظهارية المعوية. (ثانيا) المادة طافية ينبغي غائم، ويمكن أن تستخدم لعزل اللجنة الانتخابية المستقلة إذا هو المطلوب جمعها.
  2. كرر الخطوة 5، 1.
    ملاحظة: يجب أن تكون المادة طافية غائم أقل بعد هذه الحضانة. مراقبة الجودة: يمكن إزالة قطعة من الأنسجة ودققت الأشيع التأكد من أنه تم إزالة الخلايا الظهارية المعوية والغشاء الطابق السفلي غير سليمة. ويمكن أيضا تقييم عينة من المادة طافية بالتدفق الخلوي لتأكيد أن الكريات البيضاء (CD45+ الخلايا) غائبة.
  3. إضافة 50 مل الإعلام الحصاد RT قارورة. ضجة بإيجاز مع مغناطيس. واسمحوا القطع المعوية تسوية وتجاهل المادة طافية بعناية.
    ملاحظة: هذه الخطوة تضمن إزالة يدتا قبل الهضم كولاجيناز كما يحللها يدتا كولاجيناز من خالب الكالسيوم ضروري للدالة كولاجيناز.
  4. إضافة 30 مل من محلول كولاجيناز بريوارميد قارورة ويحرك قطع الأمعاء على 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في محرض مغناطيسية لمدة 45 دقيقة.
  5. نقل الأنسجة هضمها والمادة طافية إلى أنبوب مخروطي 50 مل بعملية التصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. بلطف ننأى بالقطع الأنسجة المتبقية باستخدام المكبس لحقنه 3 مل إلى الهريس من خلال عامل تصفية. يجب غسل الفلتر مع 10 مل من الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  6. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 8 مل محلول المديرية العامة 44% درجة الحرارة المحيطة.
  7. نقل تعليق الحل/خلية المديرية العامة 44% 8 مل في 17 ملم ø x 100 نمط مم 14 مل البوليبروبيلين الجولة-أسفل الأنبوبة. الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل محلول المديرية العامة 67% درجة الحرارة المحيطة. الطرد المركزي التدرجات في درجة حرارة الغرفة و 1600 × ز لمدة 20 دقيقة مع لا الفرامل.
  8. إزالة طبقة الدهون في الأعلى بالشفط بالتخلية. استخدام ماصة باستور حصاد معطف بافي في الواجهة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 40 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام.
  9. بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الحصاد الباردة وسائل الإعلام. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد تمثيل تخطيطي للبروتوكول (الشكل 1). واضح يتم تنظيم الخلايا الليمفاوية داخل الغشاء المخاطي المعوي الاستقرائي ومواقع المستجيب. بير بقع (PP) والغدد الليمفاوية المساريقي العلوي (مليون) تحتوي الخلايا الليمفاوية في مناطق تي خلية منظمة تنظيماً جيدا والمسام ب-الخلية، بينما يحتوي ظهارة الأمعاء على الخلايا الليمفاوية التي توزع أكثر تصطبغ. بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) يحتوي على الخلايا الليمفاوية تصطبغ الموزعة والخلايا اللمفية الواردة ضمن هياكل اللمفاوية المنظم مث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من الأمعاء المخاطية الاستقرائي (مليون و PP) ومواقع المستجيب (حجرة ليرة لبنانية و IEL). وقد وضعت البروتوكول لتحقيق التوازن بين المدخلات (الوقت) والمخرجات (الجدوى والعائد) تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والنتائج. ويضمن البروتوكول أيضا تلوث مقسم عبر الحد الأدنى بين المقصورات ليرة لبنانية و IEL.

وكانت عدة بروتوكولات لعزل الخلايا المناعية من الأمعاء الماوس المنشورة3،،من45<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم قرارها منحة المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI076457) والأموال المقدمة من جامعة ستوني بروك. Z.Q. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح (K12 GM102778).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيبسفيشر العلميBP310-500
ل-الجلوتامين  Sigma-aldrichG3126-100G
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
GentamicinLife Technologies15710-072
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS318-500
RPMI 1640Life Technologies21870-076
بيكربونات الصوديومفيشر ScientificS233-500
مصل الجنين الأبقارLife Technologies26140-079
10x محلول الملح المتوازن من هانكسسيجما ألدريتشH4641-500ML
1،4-DithioerythritolSigma-aldrichD9680-5G
0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0Life Technologies15575-020
سداسي هيدرات كلوريدالكالسيوم سيجما ألدريتش21108-500G
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومسيجما-ألدريتشM2670-100G
كولاجيناز ، النوع الأولLife Technologies17100-017
DG حل مخزون التدرج (Percoll)   ؛GE Healthcare17-0891-01
عازلة تحلل خلايا الدم الحمراءBiolegend420301
70-& micro ؛ مصفاة الخلايا المم Corning352350
14 مل من مادة البولي بروبيلين ذات الأنبوب المستدير القاعCorning352059
قارورة Erlenmeyer كيمبل26500R-50mL
المحرك المغناطيسيثيرموفيشر 50094596
شريط التحريكفيشر العلمي14-512-148

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة