Method Article

الأسلوب الكمي والنوعي سفينجوميلين من LC-MS استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى الأنواع سفينجوميلين

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن نقدم بروتوكول للتحديد الكمي وتأهيل كل الأنواع سفينجوميلين باستخدام رصد رد فعل متعددة ووضع MS/MS/MS، على التوالي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طريقة تحليل سفينجوميلين (SM) نوعيا وكمياً عن طريق التأين-جنبا إلى جنب كروماتوغرافيا سائلة-اليكتروسبراي الكتلي (LC-ESI-MS/MS). خ سفينجوليبيد مشتركة تتألف من فوسفوريلتشوليني والسيراميد كعنصر ماء ومسعور، على التوالي. عدد من الأنواع SM موجودة في خلايا الثدييات بسبب مجموعة متنوعة في سفينجويد طويلة السلسلة الأساسية (لكب) و نون-اشيل moiety في السيراميد. في هذا التقرير، نعرض طريقة لتقدير عدد الكربون وسندات مزدوجة في لكب و نون-moiety اشيل استناداً على أيونات المنتج المطابق في تجارب MS/MS/MS (3من مرض التصلب العصبي المتعدد). وبالإضافة إلى ذلك، نقدم أسلوب تحليل الكمي ل SM استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى SM الأنواع، مما يسهل تحديد النطاق المستخدمة في كوانتيتيشن ن خ. الأسلوب الحالي سيكون مفيداً في وصف مجموعة متنوعة من أنواع SM في العينات البيولوجية والمنتجات الصناعية مثل مستحضرات التجميل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سفينجوميلين (SM) سفينجوليبيد مشتركة في خلايا الثدييات. SM هو المركب إينتراسيلولارلي1 والحاضر تمهيدا لأخرى سفينجوليبيدس مثل سفينجوسيني-1-فوسفات، والسيراميد، لها أدوار حاسمة في جهاز المناعة الخليوي الاتجار والجلد حاجز التوازن، على التوالي2، 3. وبالتالي، من المهم تحليل دقيق من الأيض SM لتوضيح أدوار سفينجوليبيدس الفسيولوجية والمرضية.

يتكون SM السيراميد وفوسفوريلتشوليني مرتبط بمجموعة السيراميد، وهي كذلك مؤلفة من سفينجوسيني و ن1-هيدروكسي-مجموعة الأسيل. مجموعة متنوعة في أرقام الكربون والرابطة المزدوجة في كل من سفينجوسيني و نون-مجموعة الأسيل ينتج ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

راجع صحائف بيانات السلامة المادية ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. ارتداء قفازات للتقليل من تلوث العينة ب SM المستمدة من الجلد. تم تطبيق هذا البروتوكول على خلايا هيلا نمت في المتوسطة النسر الأساسية الدنيا وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم لالجلوتامين و 1,000 U/L البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/لتر.

1-إعداد العينات الدهنية

ملاحظة: من المهم أن تكون جميع الأواني الزجاجية بما فيها أنابيب الاختبار مع برغي قبعات مبطنة خالية من المنظفات.

  1. استخراج جزء مجموع الدهن من هوموجيناتي الخلية باستخدام أسلوب بلاي & داير7
    1. إزالة الثقافة (أو مكيفة) وسائط الإعلام من طبق استنبات ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصنيعه كيميائيا d18:1/SM (الشكل 1أ) 24:0 و d18:1/24:0 SM في عينات الدهون المستخرجة من خلايا هيلا (الشكل 1ب) تم تحليلها بواسطة LC-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد توظيف3 [م + هكوو]– و [م-CH3]- أيونات السلائف الأولى والثانية، على التوالي. لاحظ أن كثافة الطيف ديميثيلاتيد-سفينجوسيلفوسفوريلتشوليني (SPC) (m/z 449) أكبر من أن ن خ ن-مجموعة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الأسلوب النوعي، حصلنا على مرض التصلب العصبي المتعدد3 أيونات المنتج توافق آراء ساو باولو و نون-مجموعة الأسيل. من الأهمية بمكان لتعيين بشكل صحيح توافق آراء ساو باولو و نون-مجموعة الأسيل. وتحقيقا لهذه الغاية، تجدر الإشارة إلى أن يمكن أيضا الكشف عن الجزيئات الأخرى التي تحتوي على فوسفوريلتشوليني أيونات المنتج3 مللي ثانية. دياسيل-فوسفاتيديلتشوليني (PC) وأجهزة الكمبيوتر بلاسمالوجين موجودة تماما في خلايا الثدييات، وعلى hydrophobicity مماثلة لتلك التي SM. ولذلك، دياسيل-كمبيوتر وكمبيو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن أي تعارض في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان يؤيد هذا العمل بمنحه بحثية من وزارة التعليم، الثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا من اليابان (كاكينهي) إلى ك. أ. (#15 ك 01691)، المجلس (#15 ك 08625)، (#26461532)، والحصول على منحة لدراسة "مشروع الأمراض المستعصية" من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية (#201510032A). ونحن نشكر مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذه المخطوطة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
طبق زراعة الأنسجة 100 ممIWAKI3020-100
مكشطة خليةIWAKI9000-220
أنبوب 2.0 مل من السيليكونفيشر Scientific02-681-321
أنبوب اختبارIWAKITST SCR 16-100
غطاء لولبي مبطن بالتفلونIWAKI9998CAP415-15
أنبوب زجاجي يمكن التخلصمنه IWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 & micro ؛ م 1.5 مم معرف × 100 ممالحماية Shiseido92223في حامل الخرطوشة ، وربطها بعمود C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 مم × 10 مم خرطوشة الحرسShiseido12197
حامل خرطوشةShiseido12415
AcetonitrileWako018-19853
2-Propanol (كحول الأيزوبروبيل)واكو161-09163
الميثانولواكو134-14523
حمض الفورميكواكو066-00466
28٪ ماء الأمونياواكو016-03146
سونيكاتور (نوع الحمام)SHARPUT-206H
خلاط دوامة لأنبوب اختبار الزجاجTAITECMix-EVR
1.4 مل قارورةزجاجية Tomsic500-1982يتم تخزين العينات في قارورة زجاجية سعة 1.4 مل مختومة بغطاء لولبي وحاجز 8 مم عند -20 درجة ؛ C
8 مم الحاجزTomsic200-3322عند تحليل العينات ، يتم استبدال أغطية المسمار بأغطية لولبية مع شق
الحاجز غطاء اللولبي لقارورة زجاجية 1.4 ممTomsic500-2762
غطاء لولبي مع شق الحاجزShimadzuGLC GLCTV-803
PVDF 0.22 & micro ؛ مرشح mMilliporeSLGVR04NL
الطيف الكتلي لمصيدة الأيونات الخطية ثلاثية رباعية الأقطاب ورباعية الأقطابSCIEXQTRAP4500
برنامج الحصول على البيانات وتحليل أطياف أيونيات المنتجSCIEXمحلل
برنامج تكامل البيانات في التحليل الكمينظام SCIEXMultiQuant
HPLCShimadzuزجاجة Nexera
GlassSansyo85-0002
d18: 1/24: 0 sphingomyelinAvanti Polar Lipids860592P
SphingosylphosphorylcholineMerck567735
مصل الأبقار الجنينيThermoFisher   ؛26140079
L-glutamineThermoFisher   ؛25030081
البنسلين والستربتومايسينسيجماP4333
النسر الحد الأدنى من المتوسطالأساسي سيجماM4655
يتم إدخال خرطوشة قياس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sphingomyelin AnalysisLC MS MS MethodStable Isotope LabelingLipid ExtractionMobile Phase PreparationTriple Quadrupole MSProduct Ion SpectraStandard Curve ConstructionHeLa Cell SamplesCosmetic Lipid Characterization

Related Articles