Method Article

فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

DOI:

10.3791/57311

⸱

June 9th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Neurogenetics, German Cancer Research Center (DKFZ), DKFZ-ZMBH Alliance, 2Division of Molecular Genetics, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 3Hopp-Children's Cancer Center at the NCT Heidelberg (KiTZ), 4Division of Pediatric Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 5Department of Pediatric Hematology and Oncology, Heidelberg University Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كثيرا ما كانت التقليدية دراسات فقدان لوظيفة الجينات باستخدام الحيوانات خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. على أساس انهانسر كريسبر بوساطة الطفرات الجسدية أداة قوية لفهم وظائف الجينات في الجسم الحي. هنا، نحن التقرير طريقة لتحليل تعمل خروج المغلوب في تكاثر خلايا المخيخ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيراً ما تشوه الدماغ بسبب الطفرات الوراثية. فك رموز الطفرات في الأنسجة المستمدة من المريض قد حددت المحتملة العوامل المسببة للأمراض. للتحقق من صحة بمساهمة من خلل تحور الجينات لتطوير المرض، هو توليد نماذج حيوانية تحمل الطفرات أحد النهج الواضح. بينما germline وراثيا نماذج الماوس (جيمس) هي أدوات البيولوجية شعبية ويحمل النتائج استنساخه، فإنه مقيد بالوقت والتكاليف. وفي الوقت نفسه، تمكن جيمس غير الخط غالباً ما استكشاف الجينات الدالة بطريقة أكثر جدوى. منذ الدماغ بعض الأمراض (مثل، أورام الدماغ) تظهر نتيجة جسدية ولكن لا germline الطفرات، نماذج الماوس تشيميريك غير germline، تتعايش فيه الخلايا العادية وغير العادية، يمكن أن تكون مفيدة لتحليل الأمراض ذات الصلة. في هذه الدراسة، ونحن التقرير طريقة لاستحثاث الطفرات الجسدية بوساطة كريسبر في المخيخ. على وجه التحديد، أننا استخدمت الشرطي تدق في الفئران، التي Cas9 و التجارة والنقل هي مزمنة المنشط بالمروج كاج (CMV محسن/الدجاج ß-أكتين) بعد لجنة المساواة العرقية-بوساطة جزئ الجينوم. الذاتي المصممة الواحد-دليل الكشف (سجرناس) وتسلسل recombinase لجنة المساواة العرقية، سواء ترميز في بناء بلازميد واحد، سلمت إلى الخلايا الجذعية الدماغ/السلف في مرحلة جنينية في الرحم انهانسر باستخدام. ونتيجة لذلك، كانت تسمية transfected الخلايا وخلاياها ابنه مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، مما ييسر المزيد من التحليلات المظهرية. ومن ثم، هذا الأسلوب هو عرض التسليم على أساس انهانسر الجينات في خلايا الدماغ الجنينية بل تقترح أيضا رواية نهج كمي لتقييم الخسارة من الدالة كريسبر بوساطة تعمل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض الدماغ واحدة من أفظع أمراض مميتة. أنهم غالباً ما تنجم عن طفرات وراثية والتقلبات اللاحقة. لفهم الآليات الجزيئية لأمراض المخ، اكتشف من أي وقت مضى تدوم الجهود الرامية إلى فك الجينوم البشري المرضى عددا من الجينات المسببة المحتملة. حتى الآن، استخدمت نماذج حيوانية germline وراثيا في فيفو مكسب-من-وظيفة (صندوق القناص) وخسارة للدالة (LOF) تحليلات لمثل هذه الجينات المرشحة. نظراً لتسارع تطور الدراسات الفنية التحقق من الصحة، أكثر عمليا ومرناً في فيفو جينات مقايسة نظاما لدراسة وظيفة الجينات المرغوب فيه.

تطبيق نظام نقل الجينات على أساس انهانسر في فيفو على الدماغ الماوس مناسبة لهذا الغرض. في الواقع، أظهرت عدة دراسات في الرحم انهانسر باستخدام قدرتها على إجراء التحليلات الفنية في تطوير الدماغ1،2،3. في الواقع، تعرضت عدة مناطق في الدماغ الفأرة، مثل قشرة الدماغ4والشبكية5، الجملة6، هيندبراين7، المخيخ8، والحبل الشوكي9 إيصال الجينات الجسدية النهج، حتى الآن.

في الواقع، التعبير الجيني عابر خلال في فيفو انهانسر على أدمغة الفأر الجنينية قد استخدمت منذ فترة طويلة لتحليل صندوق القناص. تمكين التكنولوجيات المستندة إلى ينقول التكامل الجينوم الأخيرة زيادة التعبير طويل الأجل و/أو المشروطة للجينات لفائدة10،11، ومفيد تشريح وظيفة الجينات بطريقة المكانية والزمانية خلال التنمية. وعلى النقيض من تحليل صندوق القناص، تم التحليل LOF أكثر تحديا. بينما أنجز تعداء عابر سيرناس ووالبلازميدات تحمل شرنا، ليست مضمونة الآثار الطويلة الأجل ل LOF للجينات بسبب التدهور في نهاية المطاف من مناشئ أدخلت الأحماض النووية، مثل البلازميدات ودسرناس. ومع ذلك، توفر تقنية كريسبر/Cas فاصل عبر في تحليلات LOF. وقد تم transfected الجينات ترميز البروتينات الفلورية (مثلاً، التجارة والنقل) أو البروتينات طرحه (مثلاً، لوسيفراس اليراع) شاركت مع كريسبر-Cas9 وسجرناس لتسمية الخلايا تتعرض لطفرات جسدية كريسبر-Cas9-بوساطة. ومع ذلك، هذا النهج قد يكون القيود في الدراسات الفنية في تكاثر الخلايا، حيث تضعف الجينات علامة خارجية وتدهورت بعد انتشار طويلة الأجل. بينما transfected الخلايا والخلايا ابنه لها الخضوع الطفرات المستحثة كريسبر في جينومات بهم، قد تضيع على أقدام على مر الزمن. وهكذا، سيكون النهج وضع العلامات الوراثية المناسبة للتغلب على هذه المشكلة.

مؤخرا قمنا بتطوير أسلوب المستندة إلى كريسبر LOF في الخلايا الحبيبية للدماغ التي يخضع لها الانتشار الطويل الأجل خلال هذه المفاضلة12. لتسمية الخلايا transfected وراثيا، شيدت بلازميد تحمل سجرنا جنبا إلى جنب مع لجنة المساواة العرقية ، وأدخلت بلازميد cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP الفئران13 استخدام انهانسر في الرحم . خلافا لترميز اجفب ناقلات بلازميد العادية، هذا النهج بنجاح المسمى الحبيبية transfected الخلايا العصبية السلائف (قومي) وخلاياها ابنه. هذا الأسلوب يوفر دعما كبيرا في فهم في فيفو وظيفة جينات فائدة في الخلايا المتكاثرة في نمو الدماغ الطبيعي وخلفية معرضة لورم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للوائح الرفق بالحيوان وأقرتها السلطات المسؤولة (كارلسروه Regierungspräsidium، الموافقة على الأرقام: G90/13، G176/13، و G32/14، G48/14، و G133/14).

1-توليد والبلازميدات pU6-سجرنا-Cbh-لجنة المساواة العرقية

  1. تصميم سجرنا لاستهداف جين لفائدة وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا14.
    ملاحظة: في هذه التجربة، تم تصميم سجرناس اثنين لاستهداف الجين Top2b الماوس وسجرنا تحكم غير المستهدفة (الجدول 1). لاستخدام التكنولوجيا كريسبر gene(s) خروج المغلوب، حاجة سجرناس أن تكون مصممة لاستهداف الترميز تسلسل 5 ' المنطقة أو المجال الوظيفية الأساسية من البروتين. نقطة انطلاق ملائمة واحد اختبار تسلسل سجرنا المصممة مسبقاً متاحة للجمهور، مثل أبو بريص v2 الماوس خروج المغلوب تجمع المكتبة15 من مختبر تشانغ. وبدلاً من ذلك، يمكن تصميم سجرناس باستخدام البرمجيات المتاحة عامة مثل الموقع التالي: crispr.mit.edu.
  2. استنساخ في سجرناس إلى ناقل pU6-سجرنا-Cbh-لجنة المساواة العرقية.
    ملاحظة: مشتق متجه pU6-سجرنا-Cbh-Cre12 المستخدمة في هذه الدراسة من بلازميد pX330 الأصلي16 باستبدال الترميز تسلسل SpCas9 مع ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية .
    1. توليف اثنين الحمض النووي أوليجوس كما يلي. معنى: 5 '-كاككجننننننننننننننننننن-3'؛ أنتيسينسي: 3 '-كنننننننننننننننننننكاا-5'.
      ملاحظة: عرض 20 ن أعلاه موقف للتسلسل سجرنا.
    2. هضم pU6-سجرنا-Cbh-لجنة المساواة العرقية ببسي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام الكواشف التالية وتحميل العينة هضمها إلى 1% [اغروس] هلام، وتنقية لهم باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام. استخدم 3 ميكروغرام بلازميد؛ 3 ميليلتر Bbsالأول؛ 1 ميليلتر فاستاب؛ 5 ميليلتر 10 × الهضم المخزن المؤقت؛ إضافة ddH2س لتحقيق الحجم الإجمالي إلى 50 ميليلتر.
    3. فوسفوريلاتي ويصلب كل زوج من أوليجوس سجرنا استخدام الكواشف التالية (الحجم الإجمالي 10 ميليلتر): 1 ميليلتر مخصص معنى اليغو (100 مم)؛ تخصيص 1 ميليلتر اليغو العقاقير (100 مم)؛ 1 ميليلتر 10 × T4 ربط المخزن المؤقت؛ ميليلتر 6.5 ddH2س؛ 0.5 ميليلتر T4 بنك. احتضان في حرارية cycler لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5 دقائق في 95 درجة مئوية، ومن ثم منحدر وصولاً إلى 25 درجة مئوية في 5 درجة مئوية/دقيقة.
    4. قم بإعداد رد فعل ربط التالية، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الحجم الإجمالي 10 ميليلتر): X µL Bbsأنا يهضم بلازميد (50 نانوغرام)؛ 1 ميليلتر فوسفوريلاتيد وتعتيق، اليغو المزدوجة (تخفيف 1: 200)؛ 5 ميليلتر 2 × ربط المخزن المؤقت؛ X µL ddH2س؛ 1 ميليلتر ليجاسى سريعة.
    5. إضافة 2 ميليلتر من ربط المنتج إلى 50 ميليلتر من الخلايا DH5α الإشريكيّة القولونية المختصة كيميائيا. وبعد 30 دقيقة من الحضانة على الجليد، صدمة الحرارة العينة 90 s في 42 درجة مئوية، واحتضان لمدة 2 دقيقة على الجليد. إضافة 100 ميليلتر من المتوسطة رطل ولوحة من على لوحة رطل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين.
      ملاحظة: يتم دمج تسلسل سجرنا إلى بلازميد pU6-سجرنا-Cbh-لجنة المساواة العرقية طبقاً لخطوات الاستنساخ بلازميد pX33014.
    6. تطعيم المستعمرات اثنين، كل منهما في 2 مل متوسطة رطل في 37 درجة مئوية لمدة أدناها 6 ح، والقيام بعزل الحمض النووي الإعدادية المصغرة استخدام عدة.
    7. سانجر تسلسل الحمض النووي المصغر الإعدادية استخدام التمهيدي hU6 إلى الأمام، وتحديد المستعمرات مع الإدراج الصحيح من سجرناس بمحاذاة مع التسلسل هو موضح في الخطوة 1.2.1. ويرد في الجدول 1تسلسل التمهيدي. والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة كانت تسمى pU6-sgTop2b-1-Cbh-لجنة المساواة العرقية، pU6-sgTop2b-2-Cbh-لجنة المساواة العرقية، و pU6-سجكونترول-Cbh-لجنة المساواة العرقية.
    8. تطعيم المستعمرات حددت بشكل صحيح وتنقية خالية من الذيفان بلازميد الحمض النووي في الرحم انهانسر استخدام عدة، مثلاً، من Qiagen. الوت الحمض النووي مع خالية من الذيفان TE-المخزن المؤقت المخفف في ddH2س في 01:10 (المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 10%). تركيز بلازميد الحمض النووي يجب أن يكون أعلى من 2 ملغ/مل.
      ملاحظة: لا تستخدم مجموعة ماكسي الإعدادية عادية لإعداد الحمض النووي. تخزين بلازميد-حلول عند 4 درجة مئوية للاستخدام القصير الأجل العادية (تصل إلى 4 أسابيع)، أو قاسمة بحجم مناسب حوالي 25 ميليلتر وتبقى في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

2-اختبار كفاءة سجرناس استخدام "نظام بلازميد اجكسكسفب"

ملاحظة: يتم اختبار كفاءة سجرناس عادة مساح أو T7E1 (T7 endonuclease أنا) فحوصات. وفي هذا البروتوكول، يستخدم نهج بديل سهل وفعال. المفتاح لهذا النهج هو استخدام بلازميد بكاج-اجكسكسفب التي تحتوي على أجزاء اجفب متداخلة مفصولة بتسلسل الحمض النووي يحتوي على سجرنا استهداف الموقع17. عند التعبير عن بكاج-اجكسكسفب إلى جانب سجرنا و Cas9 في الخلايا ترانسفيكتيد، كسر Cas9 بوساطة حبلا مزدوجة (جهاز تسوية المنازعات) في تسلسل المستهدفة يتم إصلاح آليات تعتمد على التماثل الذاتية، التي ريكونستيتوتيس التعبير اجفب كاسيت.

  1. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم منطقة الجينوم تركزت مع سجرنا استهداف متواليات. أمبليكون بكر هو ما يقرب من 500 شركة بريتيش بتروليوم. في هذه التجربة، تم تطبيق جمعية الحمض النووي لاستنساخ جزء من تضخيم PCR إلى بلازميد بكاج-اجكسكسفب.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، مواقع التقييد الملائمة يمكن أن تضاف إلى 5 ' نهاية الإشعال PCR. هي مواقع التقييد المتوفرة في ناقلات بكاج-اجكسكسفب بامهي، ني، وبسطي، سالي، اكوري، واكورف.
  2. تضخيم الحمض النووي الجينوم مع الإشعال مصممة باستخدام النموذج والمعلمات PCR أدناه. تحميل العينة (19.7 ميليلتر ح2س؛ 0.3 ميليلتر 10 نانوغرام/ميليلتر الماوس الحمض النووي؛ 2.5 ميليلتر 10 ميكرون 2.5 ميليلتر 10 ميكرون؛ اجكسكسفب-Top2b-و اجكسكسفب-Top2b-R؛ 25 ميليلتر 2 X ميكس سيد بكر؛ 50 ميليلتر إجمالي حجم) على 1% [اغروس] هلام وهلام تطهير الشظايا PCR باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام. استخدام التالي رد فعل الشروط: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ ثم 35 س دورات 98 درجة مئوية 20 s، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية ل 20 s، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ 4 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى.
    ملاحظة: في هذه التجربة، تم تضخيمها منطقة واحدة في Top2b إكسون 1؛ البحث عن سلاسل التمهيدي في الجدول 1.
  3. ملخص ناقل بكاج-اجكسكسفب مع تقييد الإنزيمات بامهي واكوري ح 2 في 37 درجة مئوية، ثم تحميل العينة على 1% [اغروس] هلام وهلام تطهير ناقلات العمود الفقري باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام. استخدام الكواشف التالية (الحجم الإجمالي 50 ميليلتر): X µL بلازميد (3 ميكروغرام)؛ بامهي 2 ميليلتر؛ اكوري 2 ميليلتر؛ 5 ميليلتر 10 × المخزن المؤقت؛ X µL ddH2o.
  4. قم بإعداد رد فعل الجمعية الحمض الخلوي الصبغي18 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، وتحويل المختصة DH5α كولاي.
  5. تطعيم المستعمرات اثنين وكل مل 2 في المتوسط رطل في 37 درجة مئوية للحد ني ح 6، أداء عزل الحمض النووي الإعدادية المصغرة استخدام عدة، مثلاً، من Qiagen، وتحديد المستعمرات مع الإدراج الصحيح (يشار إليه فيما يلي بكاج--على سبيل المثال-Top2b-FP) استخدام سانجر التسلسل مع التمهيدي اجكسكسفب-Top2b-F.
  6. ترانسفيكت الخلايا HEK293T.
    1. خلايا البذور HEK293T في لوحة 24-جيدا 24 ساعة قبل تعداء.
      ملاحظة: الخلايا كانت مثقف في حاضنة خلية 37 درجة مئوية مع 5% CO2، في دميم مع الجلوتامين الملحق الذي يحتوي على 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين. التأكد من أن الخلايا روافد 60% في يوم تعداء. في هذه التجربة، استخدمنا خلايا HEK293T عصامي ستابلي معربا عن SpCas9 لاختبار pU6-سجرنا-Cbh-لجنة المساواة العرقية. ومع ذلك، يمكن استخدام wildtype HEK293T الخلايا إذا لم يتم توفير متجه تعبير SpCas9.
    2. ترانسفيكت الخلايا HEK293T باستخدام الكاشف بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد). ترانسفيكت الخلايا مع 120 نانوغرام/بئر بلازميد بكاج--على سبيل المثال-Top2b-FP12 و 120 نانوغرام/بئر pU6-sgTop2b-1-Cbh-لجنة المساواة العرقية أو pU6-sgTop2b-2-Cbh-العرقية في صفيحة 24-جيدا. مزيج بلازميد السلطات الوطنية المعينة وميليلتر 1.8 من كاشف برينس في 80 ميليلتر من أونسوبليمينتيد دميم المتوسطة مع الجلوتامين تكملة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد فورتيكسينج.
    3. إزالة المتوسط ح 6 بعد تعداء، واستبدل بمتوسطة جديدة.
    4. رصد وجود خلايا بروتينات فلورية خضراء+ يعيش 48 ساعة بعد تعداء استخدام مجهر الأسفار في 20 x التكبير.
      ملاحظة: عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ يشير إلى كفاءة الاستهداف سجرنا. نتائج سجرناس الفعالة وغير الفعالة (sgTop2b-1 و sgTop2b-2، على التوالي) ويرد في الشكل 2 ألف.

3-أداء انهانسر في الرحم

  1. تولد 6 للفئران عمرها 8 أسبوع وإعداد الأدوات انهانسر في الرحم . عبر الذكور متماثل Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP الفئران مع الإناث مؤتمر نزع السلاح-1 الفئران. وقت اكتشاف حمل الفئران مؤتمر نزع السلاح-1 من اليوم سد المهبلية (E0.5). الأجنة هي اليكتروبوراتيد في يوم E13.5.
    1. سحب زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (داخل القطر: 0.6-0.8 ملم) مع ساحبة ميكروبيبيتي. استخدم الإعدادات التالية: P = 500، الحرارة = 560، سحب = 150، حطي = 75، وقت = 250. قم بتسمية نصيحة الشعرية بالحبر الأسود لرؤية أفضل أثناء الحقن. تقليم تفتق الشعرية تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام مسطرة وحادة ملاقط إبرة وتقليم نصيحة بطول حوالي 6 ملم.
    2. الحفاظ على الوحدة من الشعيرات الدموية للحفاظ على التجربة استنساخه. إنشاء حافة مشطوفة أحادية الجانب خلال التشذيب. ينبغي أن تكون الحافة حادة قدر الإمكان لسهولة اختراق جدار الرحم وتجنب الأضرار أنسجة الجنين.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام طاحونة الجزئي لضبط زاوية 35°19. ويمكن تخزين الشعيرات الدموية في درجة حرارة الغرفة في 10 سم طبق بيتري تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض.
    3. اﻷوتوكﻻف الأدوات الجراحية.
    4. مزيج سجرنا-البلازميدات في أجزاء متساوية مع pT2K-إيريس-لوك إلى نهائي تركز على الأقل 1 ميكروغرام/ميليلتر لكل لون وبلازميد بلازميد-الحل مع الأخضر سريع (النهائي تركيز 0.05%). إعداد الحل الأسهم الخضراء سريعة 1% مع الماء المقطر خالية من الذيفان وتصفية من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرون لإزالة جسيمات صبغة من الحل.
      ملاحظة: تعداء المشارك من pT2K آيريس--لوك هو اختياري، ولكن يسمح لتحديد هوية الحيوانات اليكتروبوراتيد قابلة للحياة بعد الولادة باستخدام التصوير بالإضاءة الحيوية. الرجاء راجع الخطوة 3.5. إعداد كمية كافية من المزيج بلازميد للعدد الكلي للفئران الحوامل ليتم تشغيلها. استخدم حول 15-20 ميليلتر مزيج كل الماوس (~ 12 الأجنة). الشروع فورا في عملية جراحية.
  2. إعداد الفئران لإجراء عملية جراحية.
    1. تخدير الفئران مؤتمر نزع السلاح-1 الحوامل مع إيسوفلوراني. حمل التخدير في مربع مع 3-4 المجلد % إيسوفلوراني (معدل تدفق الأوكسجين: 1.5 لتر في الدقيقة) والحفاظ عليه مع المجلد 2-% خلال الجراحة عن طريق الآنف مخروط.
      ملاحظة: عملية جراحية كاملة يجب أن لا يستغرق وقتاً أطول من 30 دقيقة الحد من العدد من حقن والأجنة اليكتروبوراتيد، إذا لزم الأمر. استخدام قفازات معقمة لإجراء عملية جراحية.
    2. ضع الماوس على ظهرها وسادة تدفئة وتكييف التخدير.
    3. حقن مسكن (ميتاميزول، 800 مغ/كغ وزن الجسم تحت الجلد (الليبي)، مستودع ح 24).
      ملاحظة: يجوز لك استخدام المسكنات الأخرى المأذون بها من ميتاميزول.
    4. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء الجراحة.
    5. إصلاح أطرافه مع الشريط وتعقيم البطن بمطهر. تغطية الماوس مع شاش، تاركة فقط في مجال الجراحة مكشوف. تنتشر الإيثانول 70% في مجال العمليات الجراحية والشاش.
    6. جعل شق جلد حوالي 2 سم في الطول واتساع الفجوة بلطف مع المقص الجراحي مباشرة. قم بتحديد موقع ينيا ألبا وجعل شق ثاني أصغر قليلاً عن طريق الصفاق استخدام أنسجة المقص مع تلميح غير حادة.
    7. ترطيب تجويف البطن فتحت مع 1 العقيمة قبل حرارة × برنامج تلفزيوني.
    8. استخراج قرون الرحم بعناية من تجويف البطن باستخدام الملقط الدائري. سحب بلطف بالاستيلاء على جدار الرحم فقط في الفجوة بين الحويصلات صفار اثنين من الأجنة المجاورة. تجنب أي ضغط على الجنين أثناء سحبه من خلال الشق. توسيع الشق إذا لزم الأمر واتخاذ المزيد من الحيطة لموقف ابواق الرحم على البطن أثناء عدم ضغط تدفق الدم عن طريق الشريان الرحمي.
      ملاحظة: في بعض الحالات، ينصح باستخراج القرن الرحم واحد في وقت واحد ويحل محله قبل المضي قدما في القرن الثاني الرحم.
  3. حقن وانهانسر من بلازميد السلطات الوطنية المعينة
    1. نضح حوالي 15 ميليلتر من حل بلازميد الملونة مع استعداد الزجاج الشعرية. تجنب أي فقاعات الهواء أثناء هذه العملية.
      ملاحظة: بلازميد-الحل يمكن أن تسد التلميح بسهولة إذا كان تركيزها عالي. اختبار شعري بالإفراج عن بعض الحمض النووي الحق قبل الحقن.
    2. بلطف عقد الجنين بالملقط خاتم وتحديد موقع منطقة الرقبة.
      ملاحظة: إذا كان الجنين في وضع صعب لحقن، تخطي ذلك وتذهب للجنين القادم. زيادة إعادة تموضع الجنين قد تزيد احتمالات الضرر لهم.
    3. بيرس ببطء مع غيض الزجاج المجهز سابقا الشعرية في البطين الرابع باختراق عن طريق hindbrain الظهرية وبعد ذلك ضخ حوالي 1 ميليلتر من بلازميد-المزيج. وتؤكد أن الحمض النووي مصبوغ لا تسربت من الدماغ وتظهر كالماس على شكل هيكل.
      ملاحظة: كخيار، استخدم 2.5-fold نظارات مكبرة لرؤية أفضل البطين الرابع والمحيطة بالأوعية الدموية. توصيل النبضات الكهربائية مباشرة بعد الحقن لمنع نشر بلازميد-الحل البطينين الأخرى.
    4. تطبيق نبضات مربعة الكهربائية (5 البقول، 32 mV، 50 مللي ثانية على 950 مللي-إيقاف التشغيل) مع ملاقط البلاتين مثل الملقط (انظر الجدول للمواد). وضع أقطاب كهربائية أفقياً مع القطب السلبي الذي يغطي الإذن والقطب إيجابية المتمركزة في بريمورديوم الدماغ على جدار الرحم. استخدام ألواح القطب مم 5 انهانسر فعالة للأجنة E13.5.
      ملاحظة: زيادة معدل البقاء على قيد الحياة من الجراء عن طريق التلاعب في أقل من 2/3rd عدد إجمالي من الأجنة الواحدة والسد. تجنب الأجنة قريبة جداً لعنق الرحم. إذا كان التلاعب بها، أنها قد تسبب مضاعفات أثناء المخاض وتعرض للخطر القمامة كاملة. إذا كان أقطاب جداً قريبة من القلب للجنين، وقد يؤدي ذلك إلى توقف القلب.
  4. الرعاية انهانسر وظيفة وما بعد الجراحة
    1. بعناية بوضع ابواق الرحم إلى تجويف البطن والتعبئة مع تسخينها قبل 1 العقيمة x برنامج تلفزيوني. واسمحوا الشريحة ابواق الرحم في وضع طبيعي.
    2. إغلاق الصفاق والجلد بشكل منفصل مع خياطة مستمرة بسيطة.
      ملاحظة: اتخاذ المزيد من الحيطة لا لاختراق من خلال جدار الرحم عند خياطة الصفاق.
    3. إيقاف التخدير ووضع الحيوان لأسفل البطن في قفص جديد.
    4. مراقبة الحيوان أثناء مرحلة الاستيقاظ وح 24 مرة أخرى بعد الجراحة. ضع القفص تحت مصباح تدفئة، إذا يرتجف لا يحسن ضمن 15 دقيقة بإطار الزمني، والحيوان لا تبدأ الاستمالة.
    5. تأكيد نجاح انهانسر بالتصوير لوسيفراس.
      1. تأكد من أن السدود تعمل إسقاط الأجنة في الوقت المحدد (في E19.5).
        ملاحظة: تاريخ الميلاد قد يتم تأجيلها إلى اليوم التالي ربما بسبب العملية.
      2. تخدير الجراء اليكتروبوراتيد (P5-P7) مع إيسوفلوراني 2.5% وحقن (داخل (القائمة)) د-لوسيفرين (3 مغ/كغ من وزن الجسم) 5 دقائق قبل التصوير.
      3. كشف الإشارات لوسيفراس في الجراء اليكتروبوراتيد باستخدام جهاز تصوير الإضاءة الحيوية.
        ملاحظة: وقت تعرض 1 دقيقة كافية للكشف عن إشارة لوسيفراس. وهج (خ ع/s/سم2) تقريبا > 1 × 106.

4-إعداد كريوسيكشنز من سيريبيلا اليكتروبوراتيد

  1. Euthanize الجراء P7 اليكتروبوراتيد وتشريح المخيخ.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة إشارة التجارة والنقل باستخدام ستيريوسكوبي ابيفلوريسسينت.
  2. إصلاح في سيريبيلا بين عشية وضحاها في 5 مل في دماغ 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
  3. نقل cerebella الثابتة بين عشية وضحاها في 10 مل في دماغ سكروز 30% في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب أن تصل الأنسجة إلى الجزء السفلي من أنبوب 15 مل بعد حضانة في محلول السكروز.
  4. بعد امتصاص محلول السكروز المتبقية مع قطعة من ورق الترشيح السليلوز، تزج المخيخ في درجة حرارة قطع أمثل (OCT) مجمع في العفن بلاستيك القابل للصرف وتجميد على الثلج الجاف. ويمكن تخزين كتلة المبردة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  5. قطع كتلة المبردة إلى أقسام مع 10 ميكرون بسمك كريوستات استخدام وإبقاء الأبواب في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: واحد يمكن تأكيد تعبير بروتينات فلورية خضراء في الفروع، بعد الغسيل OCT مجمع مع برنامج تلفزيوني.

5-إيمونوستينينج كريوسيكشنز

  1. الجاف للشرائح في room temperature لمدة 30 دقيقة ويغسل مرتين لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني.
  2. دائرة الفروع بقلم مانع سائل واحتضان المقاطع في حل حظر (10% مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% تريتون X100) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة الأجسام المضادة الأولية ضد الجزيئات ذات الاهتمام (مثلاً، والتجارة والنقل و topoisomerase الثاني بيتا (Top2B) في هذه الدراسة) في حل حظر، وتبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتم سرد أسماء وتركيزات الأجسام المضادة المستخدمة في الجدول للمواد. بغية تعزيز إشارات التجارة والنقل، يمكن استخدام جسم مكافحة التجارة والنقل اختيارياً جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الأخرى.
  4. يغسل الشرائح مع 0.1% X ببست 3 المحتوية على تريتون لأدنى 10 إينكوباتي باب 1 ح في درجة حرارة الغرفة مع جسم ثانوي مترافق fluorophore المخفف في عرقلة الحل التي تحتوي على DAPI.
  5. يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني 3 X 10 دقيقة جبل للشرائح والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

6-التصوير والتحليل

  1. صورة الأقسام استخدام مجهر [كنفوكل] في 20 x التكبير.
  2. حساب عدد الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء فقدان التعبير عن البروتين الهدف. ويبين الشكل 2صورة ممثل.
  3. تحقق من النمط الظاهري الجزيئية على الاجتثاث الجينات المستهدفة في قومي وعلى نسلها إيموستينينج12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في فيفو التحليل الوظيفي، من المهم تحديد الخلايا التي أدخلت gene(s) الخارجية. بينما تعبير محدد، مثل التجارة والنقل في الخلايا غير آخذة في الانتشار يمكن أن تكون متابعة لفترة طويلة من الزمن، الإشارة التتابع يضيع في تكاثر الخلايا. مثال على ذلك يتجلى في الشكل 1. للالتفاف حول فقدان البصمة transfected الخلايا في تحليلات LOF، طورنا نهجاً جديداً من خلال الجمع بين التسليم على أساس انهانسر الجينات مع التكنولوجيا كريسبر/Cas9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام انهانسر الرحم أكسو ، أبلغنا سابقا على أساس siRNA في فيفو الوظيفية تحليلات Atoh1 في مرحلة مبكرة من الحبيبية للدماغ الخلية التمايز8. سبب siRNA تمييع/تدهور والتعرض للأجنة خارج جدار الرحم، اقتصر التحليل المظهرية من الخلايا الحبيبية اليكتروبوراتيد المراحل الجنينية. ومع ذلك، الطريقة الحالية لتمكين تحليل النمط الظاهري للحيوانات بعد الولادة.

دراستنا السابقة أثبتت أن خروج المغلوب Cas9 بوساطة من القامع الورم Ptch1 عبر في الرحم انهانسر ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نقدر سيبر لورا وأنا نوربورج، هاريم ياسين وشروتر بترا للمساعدة التقنية. كما نشكر الدكتور ك. ريفينبيرج، ك. Dell وص Prückl لمساعدة مفيدة للتجارب على الحيوانات في هذا؛ التصوير الأساسية تسهيلات هذا ومركز تصوير كارل زايس في هذا للتصوير المجهري [كنفوكل]. وأيد هذا العمل الأوقيانوغرافية دويتش، كا 4472/1-1 (ل D.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 488 Goat Anti-ChickenThermoFisherA110391:400 التخفيف
Alexa 568 تقنيات الحمار المضادة للفأرA-100371:400 التخفيف
Alexa 594 الحمار المضاد للأرانبThermoFisherA212071:400 التخفيف
Alexa 647 تقنيات الحمار المضادة للأرانبA315731:400 التخفيف
القلوي الفوسفاتيز (FastAP)ThermoFisherEF0654
الأوتوكلاف الفرقةKisker Biotech150262
BamHI (HF) NEBR3136S
BbsI (FastDigest) ThermoFisherFD1014
ورق ترشيح السليلوز (Whatman)Sigma-AldrichWHA10347525
قماشTork530378
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرZeissLSM800
D-Luciferinbiovision7903-1
DAPISigma-AldrichD95421: 1000 التخفيف
قوالب بلاستيكية يمكن التخلص منها (Tissue-Tek Cyromold)VWR4566
DMEM GlutamaxThermoFisher31966047
مصلالحمارسيجما ألدريتشD9663
EcoRI (HF) NEBR3101S
Electro Square PoratorBTXECM830
Endofree Maxi KitQiagen12362
EthanolMerck107017
مرهم العين (Bepanthen)باير81552983
Fast GreenMerck104022
FBSThermoFisher10270-016
(0.22 وميكرو ؛ م)ميركF8148
جهاز تصوير الخلايا الفلورية (ZOE)Biorad1450031
ملقط مستقيمأدوات العلوم الدقيقة91150-20
شاش (X100 ES-pads 8f 10 × 10 سم)فيشر ساينتفيك15387311
GFP الجسم المضادAbcamab139701: 1000
جيبسون الجمعية ماستر ميكسNEBE2611S
زجاج شعري مع خيوطNarishigeGD1-2
وسادة تسخينThermoLux463265 / -67
برنامج معالجة الصور (ImageJ وفيجي)الأنسولين NIH
-(B. Braun OMNICAN U-100)Carl RothAKP0.1
IsofluraneZoetisTU061219
IVIS لومينا LT سلسلة III الفرجاربيركين إلمرCLS136331
إبر خياطة كالتأدوات العلوم الدقيقة12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY مزيجKapa BiosystemsKK2601
Ki67 الأجسام المضادةAbcamab155801: 500 التخفيف
المؤشرالضوئيPL3000
قلم مانع السوائلKisker التكنولوجيا الحيويةMKP-1
MetamizolWDT-Microgrinder
NarishigeEG-45
MicroinjectorNarishigeIM300
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
برنامج المجهر ZENZeiss-خيوط
خياطة حريرية غير معقمة (0.12 مم)أدوات العلوم الدقيقة18020-50
O.C.T. مركب (Tissue-Tek)VWR4583
p27 الجسم المضادBD Bioscience6102411: 200 التخفيف
بارافورمالديهايدروث335.3
PBS ( 1x)Life Technologies14190169
pCAG-EGxxFPAddgene50716
PolyethylenimineSigma-Aldrich408727
pX330 البلازميدAddgene42230
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
طقم ربط سريعNEBM2200S
ملقط دائريأدوات العلوم الدقيقة11103-09
شرائح (SuperFrost)ThermoFisher10417002
للإحصاء الحيوي (المنشور 7)برنامج GraphPad ،Inc-Spitacid
EcoLab3003840
المجهر المجسمنيكونC-PS
السكروزSigma-AldrichS5016
مقص جراحيأدوات العلوم الدقيقة91460-11
مقص جراحي بطرف غير حادأدوات العلوم الدقيقة14072-10
خياطة (Supramid schwarz DS 16 ، 1.5 (4/0)) SMI220340
T4 DNA Ligation BufferNEBB0202S
T4 PNKNEBM0201S
مقص مناديل بلانت (11.5 سم)أدوات العلوم الدقيقة14072-10
TOP2B الأجسام المضادةسانتا كروزsc130591: 200 تخفيف
التربسين (2.5٪) ملاقطThermoFisher15090046
w / 5mm & Oslash ؛ أقطاب القرص PlatinumXceltis GmbHCUY650P5
VaporizerDr & auml ؛ جيرويرك AGGS186
فلتر تخفيف حقنة ضوء برنامج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  2. Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391(2015).
  3. Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
  4. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  5. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  6. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  7. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
  8. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
  9. Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
  10. Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
  11. Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
  12. Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758(2017).
  13. Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  14. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  16. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  18. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
  19. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303(2016).
  20. Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Loss Of FunctionIn Utero ElectroporationCerebellar Granule CellsGene Transfer MethodCas9 GFP ReporterPlasmid Construct DeliveryImmunohistochemistry AnalysisFluorescent Cell ImagingCryosection PreparationBrain Tumor Modeling

Related Articles