يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة

8.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57314

⸱

فبراير 3, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويرد على بروتوكول تحضير البولي فينيل الكحول-co-إيتاكونيك الهلاميات المائية الحمضية بصلابة متفاوتة، التي كانت المطعمة مع أو بدون أوليجوبيبتيديس، للتحقيق في تأثير صلابة الحيوية على التفرقة وانتشار الخلايا الجذعية. وتسيطر صلابة من الهلاميات المائية الوقت كروسلينكينج.

الملخص

تأثير الرموز المادية، مثل تصلب الحيوية في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية، وكانت قد أجرت التحقيق العديد من الباحثين. ومع ذلك، استخدمت معظم هؤلاء المحققين polyacrylamide الهلاميات المائية لاستزراع الخلايا الجذعية في دراساتهم. ولذلك، نتائجها مثيرة للجدل لأن هذه النتائج قد تنشأ من الخصائص التي تنفرد بها بولياكريلاميدي وليس من الرمز المادي (تصلب) الحيوية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الهلاميات المائية، التي لا تستند إلى بولياكريلاميدي، حيث يمكن أن تكون مثقف مختلف الجذعية والخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES) والبشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (iPS)،. وأعدت الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة من بيوينيرت البولي فينيل الكحول-co-إيتاكونيك حامض (ف-IA)، مع تصلب تسيطر عليها درجة كروسلينكينج بتغيير الوقت كروسلينكينج. وتم التحقيق الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع أو بدون أوليجوبيبتيديس المستمدة من المصفوفة خارج الخلية كمنصة مستقبل لزراعة الخلايا الجذعية وتمايزها. ويرد في الثقافة ومرور السائل السلوى في مجال الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وحقوق دإط الخلايا والخلايا البشرية المتكاملة هنا بالتفصيل. وأظهرت الهلاميات المائية أوليجوبيبتيدي ف-IA متفوقة الأداء، التي كانت تحدثها خصائصها صلابة. هذا البروتوكول تقارير توليف مادة بيولوجية، التلاعب بهم السطحية، جنبا إلى جنب مع التحكم في خصائص صلابة، وأخيراً، أثرها على مصير الخلايا الجذعية باستخدام شروط ثقافة خالية من كرة. استناداً إلى الدراسات التي أجريت مؤخرا، مثل ركائز المعدلة يمكن أن تعمل كمنصات مستقبلا لدعم وتوجيه مصير مختلف خط الخلايا الجذعية للروابط المختلفة؛ وعلاوة على ذلك، تجديد واستعادة وظائف الجهاز المفقودة أو الأنسجة.

المقدمة

يعرف مصير تمايز الخلايا الجذعية إلى نسب محددة للخلايا وانتشار طويلة الأجل للخلايا الجذعية، ولا سيما البشرية المستحثة pluripotent (iPS) الخلايا والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES)، ينظمها مثبطات، عوامل النمو، و/ أو صغيرة الجزيئات النشطة بيولوجيا في ثقافة وسائل الإعلام. في الآونة الأخيرة، تم الاعتراف العظة المادية الحيوية، لا سيما صلابة خلية الثقافة الحيوية، لتكون عاملاً مهما في توجيه مصير الخلايا الجذعية الانتشار والتمايز1،2، 3،4،،من56. ولذلك، بدأ الباحثون عدة للتحقيق في مصير الخلايا الجذعية، التي تستزرع في الهلاميات المائية، على التمايز، أساسا باستخدام polyacrylamide الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة.

يمكن التحكم صلابة الحيوية الالتصاقات المحورية ومورفولوجيا الخلايا، خلية النمط الظاهري والتصاق الخلايا الجذعية، لا سيما في ثنائي الأبعاد (2-d) زراعة1،2،،من35. الاستشعار عن بعد Mechano الحيوية بالخلايا الجذعية عموما يسيطر التصاق تركيز إشارات عبر مستقبلات إنتغرين. نمييا، نونموسكلي الميوسين كونتراكتيليتي تعتمد على معهد مراجعي الحسابات الداخليين من سيتوسكيليتون أكتين يلعب دوراً حاسما في عملية ميتشانوسينسينج للخلايا الجذعية في الخلية 2-د زراعة النظم3،،من45، 7،،من89،،من1011.

انجلر وزملائه بوضع فكرة مثيرة لاهتمام أن الخلايا الجذعية البالغة، مثل الخلايا الجذعية (خدمات إدارة المباني) نخاع العظام المزروعة في خلية الثقافة الحيوية مع صلابة مماثلة لانسجة محددة، تميل إلى التفريق في الخلايا التي نشأت من 5من أنسجة محددة. خدمات إدارة المباني الخلايا المحتضنة على polyacrylamide ناعمة 2-د الهلاميات المائية مغطاة بطبقة الكولاجين النوع الأول (مع صلابة مماثلة لانسجة المخ) في التوسع في وسائل الإعلام كانت المستحث تلقائياً تفرق في وقت مبكر العصبية الأنساب، بينما مثقف خلايا خدمات إدارة المباني في الهلاميات المائية مع تصلب مماثل للعضلات أو الأنسجة العظام collagenous وجد أن يحفز التمايز في وقت مبكر الأنساب myocytes وخلايا الاوستيوبلاستس، على التوالي، في الهلاميات المائية polyacrylamide 2-د3،5. وحققت العديد من الباحثين مصير تمايز الخلايا الجذعية المستزرعة في polyacrylamide الهلاميات المائية المعطل تداولها مع الكولاجين النوع الأول من12،،من1314،،من1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21-ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تقارير بعض متناقضة1،18،22،،من2324 موجودة لفكرة معروفة واقترح قبل انجلر et al. 5 هذا بسبب انجلر في فكرة5 وضعت فقط على polyacrylamide الهلاميات المائية ونتائجها قد نشأت من الخصائص المحددة لمادة بيولوجية (polyacrylamide)، وليس فقط من الرمز المادي (تصلب) من مادة بيولوجية. ولذلك، من المهم تطوير نوع آخر من المائية، التي يمكن التحكم بصلابة قبل crosslinking من الهلاميات المائية. ولهذا الغرض، وضعت الهلاميات المائية بيوينيرت، التي أعدت من البولي فينيل حمض الكحول-co-إيتاكونيك (ف-IA) مع صلابة مختلفة، التي كان يسيطر عليها درجة كروسلينكينج مع متغيرة crosslinking وقت25، 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32-يمكن زراعة الخلايا الجذعية في نونموديفيد ف-IA الهلاميات المائية، فضلا عن ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بمصفوفات خارج الخلية (ECMs) وأوليجوبيبتيديس. في دراسة سابقة25، كانت تزرع الخلايا الجذعية البشرية المكونة للدم (هسكس) من دم الحبل السري في ف-IA الهلاميات المائية مع قيم صلابة مختلفة تتراوح الجيش الشعبي الكوري 3 إلى 30 معامل التخزين الجيش الشعبي الكوري حيث فيبرونيكتين أو أوليجوبيبتيدي المستمدة من وكان المطعمة فيبرونيكتين (CS1, ايلدفبست) إلى الهلاميات المائية ف-IA. ولوحظ عالية السابقين فيفو التوسع في حظيرة هسكس في الهلاميات المائية ف-IA المطعمة ب CS1 أو فيبرونيكتين، الذي عرض صلابة متوسطة تتراوح بين 12 الجيش الشعبي الكوري إلى 30 كيلو باسكال25.

لا تزرع iPS البشرية وخلايا ES في زراعة الأنسجة التقليدية البوليستيرين (TCP) الأطباق33،34 لوفاق البشرية وخلايا iPS تتطلب ملزمة محددة إلى ECMs، مثل فيترونيكتين أو لامينين للحفاظ على ما بلوريبوتينسي خلال الثقافة طويلة الأجل. ولذلك، صممت عدة هياكل المطعمة أوليجوبيبتيدي الهلاميات المائية ف-IA مع خصائص صلابة الأمثل وإعدادها في تشكيلات من سلسلة واحدة، وسلسلة واحدة مع جزء مشترك، وسلسلة مزدوجة مع جزء مشترك، ونوع تشعبت سلسلة32. تسلسل أوليجوبيبتيدي اختيرت من مجالات ربط إنتغرين و glycosaminoglycan ECMs. الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع أوليجوبيبتيديس المستمدة من فيترونيكتين مع سلسلة مزدوجة أو الجزء المشترك، الذي يكون معامل تخزين في حوالي 25 الجيش الشعبي الكوري، دعم ثقافة طويلة الأجل ES البشرية وخلايا iPS لما يزيد على 12 من الممرات تحت خالية من كرة والكيميائية 32من شروط محددة. الجزء المشترك وسلسلة مزدوجة مع جزيئات التصاق الخلية في الهلاميات المائية يسرت الانتشار والخلايا بلوريبوتينسي البشرية وفاق والبرامج المتكاملة32. هنا، المطعمة بروتوكول لإعداد الهلاميات المائية ف-IA (مع معامل تخزين من الجيش الشعبي الكوري 10 إلى 30 الجيش الشعبي الكوري، الذي تم قياسه تحت ظروف رطبة في الهواء) مع أو بدون أوليجوبيبتيديس أو هو وصف ECMs. ويبين كيف أن الثقافة ومرور العديد من الخلايا الجذعية (بما في ذلك الخلايا الجذعية السائل السلوى والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وحقوق دإط الخلايا والخلايا البشرية المتكاملة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ووافقت لجان الأخلاقيات للمستشفى لاندسيد تايوان (مجلس الهجرة واللاجئين-13-05) والجامعة المركزية الوطنية التجارب في هذه الدراسة. أجريت جميع التجارب وفقا لجميع المبادئ التوجيهية الحكومية والمؤسسية ذات الصلة وقابلة للتطبيق واللوائح خلال هذه الدراسة.

1-حل وإعداد وسائل الإعلام

  1. تنقية البوليمر
    1. نق ف-IA مع مجموعة حمض الكربوكسيلية مع درجة التحلل من > 96.5 في المائة قبل الغسيل ف-IA مع الإيثانول. 20 غراما من فالف في 200 مل إيثانول في دورق مخروطي 500 مل وتحرض على محرض مغناطيسي ل 24-30 h. تبادل الإيثانول مع الإيثانول الطازجة كل ح 8-10.
    2. إزالة ف-IA من الإيثانول بالترشيح باستخدام قمع [بشنر].
    3. ف الجاف-IA من فراغ التجفيف في درجة حرارة الغرفة ح 24.
      ملاحظة: من المستحسن لتنظيف الفخ في نظام التجفيف الفراغ (عن طريق إزالة الإيثانول) في كثير من الأحيان، لا سيما خلال ساعات قليلة، لأن الفخ الذي يميل إلى انسداد بعد إزالة كمية كبيرة من الإيثانول من جوعه ف
  2. إعداد الحل ف-IA
    ملاحظة: إضافة البوليمر ببطء شديد في المذيب (الماء). من المستحسن أن تتخذ على الأقل 15 دقيقة لإضافة ف-IA في المذيب. إذا تم إضافة المذيب إلى البوليمر، وسوف لا يجوز حل البوليمر تماما. كن حذراً لا لتوليد الغليان المتفجرة من الحل ف-IA. استخدام النظارات الواقية أثناء إعداد الحل ف-IA. عملية تدفئة الحل ف-IA ضروري لحل يحالون ف البلورية فمن المقترح (والأفضل) لإعداد الحل ف-IA في غرفة نظيفة نسبيا تجريبية، إذا كان ذلك ممكناً.
    1. حل ف-IA في المياه النقية إلى تركيز وزن 0.050% لتجربة زراعة الخلية أو وزن 0.50% تركيز لقياس رهيوميتير: على سبيل المثال، يحل 50 مغ من ف-IA في 100 مل الماء النقي لثقافة الخلية و 500 ملغ من ف-IA في 100 مل دي الماء المتأين (DI) لقياسات رهيوميتير.
    2. تحرض حل ف-IA ح 1 على صفيحة.
      ملاحظة: لتجنب غليان المتفجرة، لا حرارة في حل ما يزيد على 95 درجة مئوية. الغليان المتفجرة من الحل البوليمر في درجة حرارة عالية قد تؤدي حروق الجلد. ولذلك، أداء التدفئة من ف-IA بعناية فائقة، ورصد درجة حرارة الحل ف-IA أثناء التسخين.
    3. بعد أن كان الحل ف-IA تبرد في درجة حرارة الغرفة، تحرض الحل ف-IA في درجة حرارة الغرفة ل h. 48 إجازة حل ف-IA الساخنة على صفيحة دون تدفئة، وثم تركها دون إثارة الشغب في درجة حرارة الغرفة ح 20-24 التأكد من وجود فقاعات الهواء غير موجودة في الحل ف-IA.
  3. إعداد الحل كروسلينكينج
    1. جعل تكوين crosslinking الحل 1.0 وزن ٪ glutaraldehyde من حل 25 ٪ glutaraldehyde مائي، وزن 20.0 Na2حتى4 باستخدام 99% > نقاء، و 1.0 وزن ٪ ح2حتى4. على سبيل المثال، واحد 6 أو 12 لوحة الثقافة الخلية جيدا، وإضافة 100 ميليلتر من حل glutaraldehyde، 2 غ كبريتات الصوديوم، و 100 ميليلتر من حامض الكبريتيك إلى 10 مل الماء النقي.
  4. دإط/PS الخلية البشرية ثقافة وسائل الإعلام
    ملاحظة: استخدام DMEM/F12 وسائط الإعلام وأساسي 6 الوسائط والوسائط 8 أساسي لثقافة الخلية.
    1. إعادة تجميد 50 X 8 الأساسية الملحق ببطء للحل بين عشية وضحاها بذوبان الجليد في ثلاجة 4 درجات مئوية.
    2. إضافة زجاجة واحدة من الملحق 8 أساسي X 50 في زجاجة واحدة من الوسائط 8 الأساسية القاعدية. فصل وسائط الإعلام إلى مختبرين الصغيرة (50 مل في كل) في أنابيب الطرد المركزي 100 مل، ثم تخزين الوسائط في-20 درجة مئوية.

2 إعداد طبق المائية ف-IA

  1. إعداد الفيلم ف-IA
    1. حقن قاسمة 1 مل الحل ف-IA طبق TCP 35 ملم، والجاف للطبق في فرن 45 درجة مئوية لمدة يومين لإنتاج فيلم ف-IA في مقاعد البدلاء نظيفة.
  2. كروسلينكينج الأطباق المائية ف-IA
    1. تزج الأفلام ف-IA في حلاً crosslinking مائي 0.5، 1، 2، 4 و 6، 12، 24، و 48 ساعة.
      ملاحظة: 'ف-IA-X' (مثلاً، ح فالف-12) يشير إلى كروسلينكيد المائية IA ف على ح س (مثلاً، ح 12).
    2. بعد كروسلينكينج، شطف الهلاميات المائية ف-IA مع الماء النقي في درجة الحرارة المحيطة، وثم الاحتفاظ الهلاميات المائية في الماء النقي في درجة الحرارة المحيطة في مقاعد البدلاء نظيفة.
    3. تعقيم الهلاميات المائية ف-IA من الغمر في محلول إيثانول 75.0 volume/volume% لمدة 1 دقيقة، شطف ف-IA الهلاميات المائية في المياه النقية ست مرات، وثم الاحتفاظ الهلاميات المائية ف-IA في المياه النقية حتى تستخدم لزراعة الخلية.
  3. إعداد أطباق المائية ف-IA المطعمة مع أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة
    1. تنشيط الهلاميات المائية ف-IA عبر الانغماس في 1 مل من محلول مائي يحتوي على 10 ملغ/مل ن-(3-Dimethylaminopropyl)-ن 'هيدروكلوريد-اثيلكاربودييميدي (EDC) و 10 ملغ/مل ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) ل 1 ح في 37 درجة مئوية أو ح 4 في 4 درجات مئوية.
    2. شطف الهلاميات المائية ف-IA مع 1 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2) 3 مرات وتزج الهلاميات المائية ف-IA في برنامج تلفزيوني محلول يحتوي على 1 مل أوليجوبيبتيدي (100-1,500 ميكروغرام/مل) أو إدارة المحتوى في المؤسسة (10-100 ميكروغرام/مل) عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تسلسل أوليجوبيبتيدي و ECMs المستخدمة لزراعة الخلايا الجذعية ويرد في الجدول 1.
    3. بعد تطعيم أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة، يغسل الهلاميات المائية ف-IA مع الماء النقي 3 مرات.
      ملاحظة: الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع Y ميكروغرام/مل من أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة (Z) هي يشار إليه ف-IA-سح-Z أو ف-IA-ح-XZ-Y، حيث X تشير إلى وقت كروسلينكينج (ح)، ص يشير إلى تركيز أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة، ويشير إلى Z أوليجوبيبتيدي مختلفة أو إدارة المحتوى في المؤسسة.

3-الإنسان ES/iPS خلية ثقافة

  1. أسلوب المرور وصيانة ES البشرية غير متمايزة، وخلايا iPS
    1. الحفاظ على وفاق البشرية (مثلاً، WA09 أو H9) خلايا أو المؤسسة البشرية (مثلاً، HS0077) الخلايا على ماتريجيل في وسائل الإعلام 8 أساسي في أطباق 6 سم باستخدام القياسية البشرية ES/iPS خلية ثقافة البروتوكولات28،32.
    2. احتضان خلايا ES/iPS الإنسان القرب من روافد مع 2.0 ملغ/مل ديسباسي الثاني في وسائل الإعلام دميم/و-12 في 37 درجة مئوية لمدة 8-10 دقيقة وشطف ثم خلايا ES/iPS الإنسان مرتين مع وسائط الإعلام DMEM/F12.
    3. بعد إضافة 2 مل دميم/و-12 وسائل الإعلام للبشرية ES/iPS خلية ثقافة الأطباق، فصل ضعيف المستعمرات ملتصقة مكشطة خلية باستخدام أو بواسطة بيبيتينج.
    4. جمع الخلايا البشرية ES/iPS إلى أنابيب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي خلايا ES/iPS الإنسان في 160 × ز لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد الطرد المركزي، تجاهل DMEM/F12 وتعليق الخلايا ES/iPS البشرية في 1 مل الإعلام E8، وثم حساب كثافة الخلية باستخدام عداد خلايا.
    6. تلقيح خلايا ES/iPS بعد تعديل الكثافة المناسبة (1-5 × 104 خلايا كل سم2 باساجينج أو كرد) في أطباق ثقافة جديدة (ف-IA الهلاميات المائية المطعمة أوليجوبيبتيدي أو بإدارة المحتوى في المؤسسة).

4-توصيف خصائص الخلية البشرية ES/iPS

  1. تقييم النشاط الفوسفاتيز القلوي (AP)
    1. قياس نشاط الفوسفاتيز القلوي (AP) البشرية ES/iPS الخلايا استخدام تلطيخ يعيش الفوسفاتيز القلوية القياسية.
  2. إيمونوستينينج
    1. تنفيذ إيمونوستينينج لهيئة تنظيم الاتصالات-1-81، 4 سا، Sox2، و Oct3/4 على خلايا هس والوركين للتحقيق في بلوريبوتينسي بعد28،التقليدية بروتوكول32.
    2. إضافة وحدة تخزين 0.5 مل من بارافورمالدهيد 4% (حجم/حجم) في كل طبق جيدا 24 التي كانت مثقف ES/iPS الخلايا البشرية، وفي وقت لاحق، احتضان الأطباق لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية إصلاح الخلايا.
    3. نضح الحل بارافورمالدهيد من كل بئر. ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني في البئر ونضح برنامج تلفزيوني شطف الخلايا. القيام بعملية الشطف 3 مرات.
    4. بيرميبيليزي أغشية الخلية بإضافة 0.5 مل من 0.3% (حجم/حجم) الحل تريتون-X 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. نضح الحل تريتون-X 100 وإضافة 300 ميليلتر من ألبومين المصل البقري 2% (وزن/حجم) (BSA) في برنامج تلفزيوني (حجب المخزن المؤقت) في كل بئر، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. إزالة المخزن المؤقت حظر بيبيتينج، ثم بعد ذلك إضافة الأجسام المضادة الأساسي المطلوب (Oct3/4 (1: 200)، Sox2 (1: 200)، سا-4 (1: 200)، و Tra-1-81(1:200) ماصة، انظر الجدول 2) في كل بئر، قد تضعف الأجسام المضادة التي تشير فيها إلى 1: 200 مع برنامج تلفزيوني 200-fold والمحتضنة لمدة يوم واحد في 4 درجات مئوية.
    7. نضح الحل جسم الأولية، وتغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من 0.05% 20 توين في حل برنامج تلفزيوني 3 مرات في درجة حرارة الغرفة.
    8. إضافة 300 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 200، انظر الجدول 2)، والتي هي محددة لنوع فرعي مفتش الابتدائي، في حل جيش صرب البوسنة 2% (الوزن/الحجم) في كل جيدا واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    9. تغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من 0.05% 20 توين في حل برنامج تلفزيوني 3 مرات في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    10. تحليل الخلايا ملطخة بالأسفار مجهرية أو مجهرية [كنفوكل].
  3. تشكيل هيئة امبريويد
    1. التحقيق بلوريبوتينسي خلايا البشرية ES/iPS بتشكيل هيئة امبريويد (المجلس التنفيذي) في الفقرات 10 و 20.
      ملاحظة: قرب 80% التقاء في لوحات 6-جيدا كافياً للتحضير لتشكيل المجلس التنفيذي.
    2. شطف ES البشرية أو خلايا iPS مع 2 مل من وسائط الإعلام دميم/و-12 مرتين، وثم تزج الخلايا في 1.5 مل وسائط الأساسية 6.
    3. قطع قرب خلايا ES أو المؤسسة البشرية المتلاقية 80% إلى حوالي 32 قطع استخدام 200 ميليلتر النصائح. بعد ذلك، فصل الخلايا من الأطباق باستخدام مكشطة خلية.
    4. جمع الخلايا ES/iPS البشرية ونقل إلى طبق مرفق معالجات 6-جيدا.
    5. تبادل الوسائط 6 الأساسية التي بيبيتينج وسائل الإعلام القديمة وإضافة وسائط جديدة كل يومين.
      ملاحظة: الثقافة الخلايا في تعليق لمدة أسبوعين في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    6. بعد الحديدية علقت المتجانسة في الوسائط الأساسية 6، نقل الحديدية الثقافة على الأطباق TCP 24-بئر مغطاة بوزن 0.1 ٪ الجيلاتين، والثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط الأساسية 6 لمدة أسبوع إضافي.
    7. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة ضد علامات الخلايا المستمدة من ثلاث طبقات جنينية germline [برس (الأنسجة)، والتحكيم (الأديم الظاهر)، بيتا ثالثا-Tubulin (الأديم الظاهر)، والإدارة البحرية السويدية (mesoderm)] وتقييم الخلايا بواسطة الأسلوب إيمونوستينينج الموصوفة أعلاه.
  4. تشكيل تيراتوما
    1. التحقيق بلوريبوتينسي خلايا البشرية ES/iPS بتشكيل تيراتوما في الفقرات 10 و 20.
      ملاحظة: 5 أطباق من القرب من التقاء 80% في لوحات 6-جيدا تكفي لتشكيل تيراتوما (على الأقل 3 × 106 خلايا ضرورية للتجارب تشكيل تيراتوما).
    2. شطف الخلايا مع 2 مل الإعلام دميم/و-12 مرتين، ثم قم بإضافة 1.5 مل دميم/و-12 وسائل الإعلام للاطباق ثقافة الخلية.
    3. قطع حوالي 80% المتلاقية ES أو iPS الخلايا البشرية إلى ما يقارب 32 قطعة باستخدام 200 ميليلتر نصائح. بعد ذلك، فصل الخلايا من الأطباق باستخدام مكشطة خلية.
    4. جمع الخلايا البشرية ES/iPS إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي الخلايا في 160 × ز لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد الطرد المركزي، تعليق الكريات الخلية في 100 ميليلتر DMEM/F12، ومزيج ثم الخلية الكريات مع 100 ميليلتر ماتريجيل (نسبة حجم 1:1).
    6. نقل تعليق خلية في محقن يبرد قبل-20 درجة مئوية. حقن، في المجموع، على الأقل 3 × 106 خلايا تحت الجلد في الذكور إيماءة-إخضاعها (إيماءة. CB17-/JNarlبركدامشمولان) الفئران (5-8 أسابيع).
    7. بعد 5-8 أسابيع، تشريح teratomas والإصلاح مع الحل بارافورمالدهيد 4.0% (وزن/حجم) وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية.
    8. إصلاح في تيراتوما مع البارافين وشريحة teratomas جزءا لا يتجزأ من البارافين ووصمة عار والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) باستخدام بروتوكول قياسي28،32.
      ملاحظة: قد ترسل الباحثون الأنسجة teratoma الثابتة للشركة لإصلاح في تيراتوماس مع البارافين، teratomas شريحة جزءا لا يتجزأ البارافين، ووصمة عار العينة مع ح & ه، التي عادة ما تستخدم في قسم علم الأمراض في المستشفيات.
  5. زراعة الخلايا الجذعية البشرية المستمدة من الدهنية (إعلان)
    1. حارة الثقافة الإعلام (التي تحتوي على 1% فطري المضادات الحيوية و 10% الجنيني البقري المصل (FBS) دميم)، 0.25% من التربسين-يدتا، وبرنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية في حمام مياه مسبقة لاستخدام.
    2. تغسل الخلايا البشرية إعلان قبل بيبيتينج 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل طبق الثقافة 6-سم حيث يتم استزراع الخلايا.
    3. أضف 1 مل من محلول يدتا التربسين (0.25 في المائة) في أطباق الثقافة 6-سم واحتضان الحل في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. مراقبة الخلايا في أطباق الثقافة 6 سم تحت المجهر للتأكد من أن يتم فصل الخلايا.
    5. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل أجهزة الطرد مركزي، وإضافة وحدة تخزين متساوية من وسائط الثقافة (دميم التي تحتوي على مضاد حيوي فطري 1% و 10% FBS) في أنبوب الطرد المركزي لتحييد التربسين-يدتا.
    6. الطرد المركزي الخلايا في ز × 250 لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. بعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج، دون الإخلال ببيليه الخلية.
    8. ريسوسبيند الخلايا في ثقافة وسائل الإعلام، والبذور ثم الخلايا في كثافة مناسبة (5-10 × 103 خلايا كل سم2 باساجينج أو كرد) في أطباق ثقافة جديدة (ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع وبدون أوليجوبيبتيديس وإدارة المحتوى في المؤسسة).
  6. السائل السلوى البشرية تنبع الثقافة الخلية (AFS)
    1. الحارة وسائط زراعة (مكدب دميم/201 (2:3) تحتوي على 20% مصل بقرى الجنين (FBS)، 5 نانوغرام/مل بفجف و 1% مضاد حيوي فطري)، 0.25% من التربسين-يدتا، وبرنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية في حمام مياه مسبقة لاستخدام.
    2. غسل الخلايا البشرية في المؤسسة من خلال بيبيتينج 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل طبق الثقافة 6-سم حيث يتم استزراع الخلايا.
    3. أضف 1 مل من محلول يدتا التربسين (0.25 في المائة) في أطباق الثقافة 6-سم، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. ملاحظة يتم فصل الخلايا على أطباق الثقافة 6-سم تحت المجهر للتأكد من الخلايا.
    5. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل أجهزة الطرد مركزي، وإضافة وحدة تخزين متساوية من ثقافة الإعلام (مكدب دميم/201 (2:3) تحتوي على 20% الجنيني البقري المصل (FBS)، 5 نانوغرام/مل بفجف ومضاد حيوي فطري 1%) في أنبوب الطرد المركزي لتحييد التربسين-يدتا.
    6. الطرد المركزي الخلايا في ز × 250 لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. بعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية قبل بيبيتينج.
    8. ريسوسبيند الخلايا في وسائط الإعلام زراعة والبذور ثم الخلايا في كثافة مناسبة (5-10 × 103 خلايا كل سم2 باساجينج أو كرد) في أطباق ثقافة جديدة (ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع وبدون أوليجوبيبتيدي وإدارة المحتوى في المؤسسة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع أوليجوبيبتيدي المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة (أوليجوكم) أو إدارة المحتوى في المؤسسة مع مرونة مختلفة أعدتها بعد رد فعل مخطط، كما هو مبين في الشكل 1 ألف، باستخدام أنواع مختلفة من أوليجوكم (الشكل 1B). مرونة من الهلاميات المائية تنظمها كثافة crosslinking التطبيقية (الوقت) (الشكل 1). ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع المستمدة من فيترونيكتين أوليجوبيبتيديس، الذي يحتو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتم وضع ف-IA-أوليجوكم والهلاميات المائية ف-IA-إدارة المحتوى في المؤسسة مع صلابة متفاوتة لتوسيع المدى الطويل ES البشرية وخلايا iPS الاحتفاظ بهم بلوريبوتينسي لأكثر من عشر فقرات في ظروف خالية من كرة، فضلا عن ثقافة المؤسسة الخلايا البشرية، إعلان الخلايا، والخلايا الجذعية المكونة للدم25،،من2832. ف-IA الهلاميات المائية المعطل تداولها مع أوليجوكم مرشح ممتاز لمواد زراعة الخلية للتحقيق في تأثير مواد الثقافة الخلية على مصير التمايز وانتشا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا البحث كان جزئيا تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا، وتايوان تحت أرقام المنح-003 106-2119-M-008، 105-2119-M-008-006، و 104-2221-E-008-107-MY3. وأيد هذا البحث أيضا "مشروع مستشفى لاندسيد تايوان" (حاصلين-لش-105-أ-001). من المعترف به أيضا معونات "البحث العلمي" (رقم 15 ك 06591) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان. أ هيجوتشي تود أن تقر للبرنامج الدولي للشراكة العلمية (ايسب-0062) "وكالة الجامعة" للدراسات العليا والبحوث، جامعة الملك سعود، الرياض 11451، المملكة العربية السعودية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
GTPGPQGIAGQRGVVPH اليابانلا شيءالمواصفات: Oligopeptide
الاختصار: Cyclic RGD ، cRGD
GACRGDCLGAPH Japannoneالمواصفات: Oligopeptide
الاختصار: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH Japanلا شيءالمواصفات: Oligopeptide
اختصار: CS1
EILDVPSTPH Japanلا شيءالمواصفات: قليل الببتيد
الاختصار: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH اليابانلا شيءالمواصفات: Oligopeptide
اختصار: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH اليابانلا شيءالمواصفات: Oligopeptide
اختصار: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JAPANNONEالمواصفات: Oligopeptide
اختصار: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH اليابانلا شيءالمواصفات: Oligopeptide
اختصار: VN2C
GCGGKGGGPQVTRGDVFTMPPH اليابانلا شيءالمواصفات: مصفوفة خارج الخلية
الاختصار: rVN
VitronectinThermo Fisher العلميةA14700المواصفات: مصفوفة خارج الخلية
اختصار: FN
FibronectinSigma-Aldrichمواصفات F2006: مادة الطلاء المتوفرة تجاريا
اختصار: Synthemax II
Synthemax IICorning3535المواصفات: بوليمر
بولي فينيل كحول - حمض كو إيتاكونيكاليابان VAM & مواصفات PovalAF-17: مادة
GlutaraldehydeSigma-AldrichG5882المواصفات: Na
2< / sub>SO4< / sub>Sigma-Aldrich239313المواصفات: كيميائي
H2< / sub>SO4< / sub>Sigma-Aldrich339741المواصفات: Chemical
اختصار: EDC
N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE7750المواصفات: الكيميائية
الاختصار: NHS
N-hydroxysuccinimideSigma-Aldrich56480المواصفات: كيميائي
بارافورمالديهايدسيجما-ألدريتشP6148المواصفات: مادة
كيميائية Triton-X100Sigma-AldrichT8787المواصفات: مكشطة خلية مستهلكة لثقافة
الخلية Corning3008تخصيص: مستهلكة ثقافة الخلية
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693المواصفات: وسط زراعة الخلية
أساسي 6Thermo FisherA1516401تخصيص: وسط زراعة الخلية
أساسي 8A1517001علمي Thermo Fisherالمواصفات: وسط زراعة الخلية
DMEM / F12Thermo Fisher العلمي11330-032المواصفات: وسط زراعة الخلية
DMEMThermo Fisher العلمي12800-017المواصفات: وسط زراعة الخلايا
MCDB 201Sigma-AldrichM6770المواصفات: ES
خلية بشرية ESWiCell Research Institute، Inc..مواصفات WA09: خلية iPS
خلية iPS البشريةRiken CellBank HS0077المواصفات: 35 مم
الاختصار: TCP
TCP طبقCorning353001المواصفات: 60 مم
اختصار:
TCP TCP طبقCorning353002تخصيص: 24 طبق بئر
24 طبق بئرCorning353047تخصيص: حجب وكيل
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA8806المواصفات: كاشف الكشف
عن الفوسفاتيز القلوي وصمة عار حيةThermo Fisher العلميةA14353المواصفات: كاشف الكشف
هيماتوكسيلين ويوزينسيجما ألدريتش1.05175المواصفات: طبق تكوين
EB 6 بئر طبق مرفق منخفض للغايةCorning3471المواصفات: مادة الطلاء
الجيلاتينSigma-AldrichG9391المواصفات: مادة الطلاء
MatrigelCorning354230المواصفات: الفئران
NOD-SCID الفئرانمختبرات البحوث التطبيقية الوطنيةلا شيءتخصيص: مصل
الأبقار الجنينالصناعات البيولوجية04-001-1Aتخصيص: مضاد حيوي
المضاد الحيوي المضاد للفطرياتThermo Fisher العلمي15240-062المواصفات: الجسم المضاد للجسم المضاد
ل NanogInvitrogenMA1-017المواصفات: الجسم المضاد للجسم المضاد
ل SSEA4Abcamab16287المواصفات: الجسم المضاد للجسم المضاد
ل OCT3 / 4InvitrogenPA5-27438المواصفات:
الجسم المضاد ل Sox2Invitrogen48-1400المواصفات: الجسم المضاد للجسم المضاد
للعضلات الملساء الأكتينInvitrogenPA5-19465المواصفات: الجسم المضاد للجسم المضاد
ل AFPInvitrogenPA5-21004المواصفات: الجسم
المضاد GFAPInvitrogenMA5-15086المواصفات: الجسم المضاد
Alexa Fluor 555 &ndash ؛ الماعز المترافق الأجسام المضادة للفأرInvitrogenA-21422المواصفات: الجسم المضاد
Alexa Fluor 488 & ndash ؛ الماعز المترافق الأجسام المضادة للأرانبInvitrogenA-11008المواصفات: الجسم المضاد
الكيميائية العلمي مصل

المراجع

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493(2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778(2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312(2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136(2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647(2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146(2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدراتهيدروجيلات P-IAالزرع الخالي من المكونات الحيوانية الغريبةالتحكم في صلابة الهيدروجيلتطعيم الأوليغوببتيدتمايز الخلايا الجذعيةالمجهر الفلوريبروتوكول تمرير الخلاياتخليق المواد الحيويةالمصفوفة خارج الخلوية
ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.