مقالة منهجية

تضيء سبل تفعيل Caspase استخدام التكامل Bimolecular Fluorescence

DOI:

10.3791/57316

⸱

مارس 5, 2018

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك)؛ أسلوب المستندة إلى التصوير التي يمكن استخدامها لتصور قرب المستحث للبادئ caspases، وهو الخطوة الأولى في تفعيل تلك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسرة caspase من البروتياز أدواراً أساسية في المبرمج والحصانة الفطرية. ومن بين هذه هي فرعي المعروفة باسم caspases البادئ الأولى لتفعيلها في هذه المسارات. وتشمل هذه المجموعة caspase-2،-8، و-9، فضلا عن caspases التحريضية، كاسباسي-1،-4، و-5. يتم تنشيط جميع caspases البادئ من ثنائي بعد التعيين إلى مجمعات مولتيبروتين محددة يسمى منصات التنشيط. Caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك) هو نهج القائم على التصوير فيها تقسيم البروتينات الفلورية تنصهر للبادئ وتستخدم كاسباسيس لتصور توظيف caspases البادئ لبرامجهم التنشيط وما يترتب على ذلك قرب المستحث. وتوفر هذه الأسفار قراءات لواحدة من أولى الخطوات المطلوبة لتفعيل caspase البادئ. باستخدام عدد من مختلف النهج القائم على الفحص المجهري، هذا الأسلوب يمكن أن توفر البيانات الكمية على كفاءة تفعيل caspase على مستوى سكان، فضلا عن حركية تفعيل caspase وحجم وعدد من تفعيل caspase المجمعات على أساس كل خلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسرة حوزتي caspase معروفة بأدوارها الحاسمة في المبرمج والحصانة الفطرية 1. نظراً لما لها من الأهمية تحديد متى، أين، ومدى كفاءة يتم تنشيط caspases محددة يمكن أن توفر رؤى حاسمة في آليات caspase مسارات التنشيط. البروتوكول على أساس التصوير الموصوفة هنا يمكن تصور الخطوات الأولى في تتالي التنشيط كاسباسي. ويستفيد هذا الأسلوب التفاعلات الدينامية البروتين: البروتين أن تفعيل caspase محرك الأقراص.

Caspases يمكن تقسيمها إلى مجموعتين: caspases البادئ (caspase-1،-2،-4،-5،-8،-9،-10 و-12) و caspases الجلاد (caspase-3،-6، و-7). موجودة في الخلية ك dimers بريفورميد caspases الجلاد ويتم تنشيطها بالانقسام بين وحدة فرعية كبيرة وصغيرة 2. عند تنشيط، أنها تنشق العديد من البروتينات الهيكلية والتنظيمية أدى إلى المبرمج 3. Caspases البادئ هي كاسباسيس الأولى تفعيلها في طريق، وعموما يؤدي تنشيط caspases الجلاد. وعلى النقيض من الجلاد caspases، يتم تنشيط caspases البادئ من ثنائي 4،5. هذا ثنائي يسهل تجنيد مونومرات الخاملة إلى مجمعات محددة الوزن الجزيئي الكبير المعروف بتفعيل الأنظمة الأساسية. الجمعية العامة لتنشيط منصات محكوم بسلسلة من التفاعلات المحددة البروتين: البروتين. هذه هي وساطة من البروتين المصانة التفاعل زخارف موجودة في بروفورم من caspase البادئ وتشمل المجال الموت (دد) والموت المستجيب المجال (الدائرة) و caspase تعيين المجال (بطاقة) 6 (الشكل 1A). عموما تشمل منصات تنشيط مستقبلات بروتين وبروتين محول. عادة ما يتم تنشيط المستقبلات عليه ملزم ليجند، حفز تغيير كونفورماشونال الذي يسمح أوليجوميريزيشن جزيئات عديدة. ثم المجندين المستقبلات أما caspase مباشرة أو محول الجزيئات التي تجلب بدورها في كاسباسي إلى المجمع. وهكذا، تأتي العديد من الجزيئات caspase إلى مقربة من السماح لثنائي. هذا هو المعروف بنموذج قرب المستحث 7. بمجرد ديميريزيد، يخضع كاسباسي حدث، مما يؤدي إلى استقرار في نشاط إنزيم 4،8. على سبيل المثال، يتم تشغيل جمعية أبوبتوسومي Apaf1 بواسطة ج الفسفرة عقب الإفراج عنها من الميتوكوندريا في عملية تسمى الميتوكوندريا الغشاء الخارجي permeabilization (الموقع). Apaf1 المجندين بدوره caspase-9 عن طريق تفاعل الذي هو توسط بطاقة موجودة في كلا البروتينات 9. نتيجة تفاعلات البروتين مماثلة في الجمعية CD95 وفاة حمل إشارات معقدة (القرص) الذي يؤدي إلى تفعيل caspase-8؛ بيدوسومي، التي يمكن تفعيل caspase-2؛ ومختلف مجمعات إينفلاماسومي أن الشروع في تفعيل caspase-1 10،،من1112. وهكذا، يجند caspases البادئ إلى منصات التنشيط محددة بإنشاء إليه مشتركة مما أدى إلى قرب المستحث وثنائي، التي بدونها لن يحدث التنشيط.

Caspase Bimolecular Fluorescence التكامل (بيفك) هو تحليل القائم على التصوير التي وضعت لقياس هذه الخطوة الأولى في تفعيل caspases البادئ، والسماح للتصور مباشرة قرب كاسباسي التي يسببها اتباع منهاج التنشيط الجمعية. يأخذ هذا الأسلوب تستفيد خصائص البروتين انقسام نيون فينوس. كوكب الزهرة هو أكثر إشراقا وأكثر فوتوستابل نسخة من البروتين نيون أصفر (يفب) التي يمكن فصلها في الأجزاء غير الفلورية وتداخل طفيف اثنين: N-المحطة الزهرة (فينوس N أو VN) وج-المحطة فينوس (الزهرة ج أو الرأسمالي). هذه الشظايا الاحتفاظ بالقدرة على ريفولد وتصبح الفلورسنت عند في مقربة من 13. هو تنصهر فيها كل جزء الزهرة إلى برودومين من كاسباسي، وهو الجزء الأدنى من كاسباسي الذي يربط إلى منصة التنشيط. وهذا ما يضمن أن لا تحتفظ caspases النشاط الأنزيمي وذلك التحليل المتزامن لإحداث المتلقين للمعلومات المرتبطة بالأحداث الذاتية من الممكن. وشظايا فينوس ريفولد عند برودومينس caspase يعينون لمنصة التنشيط والخضوع لقربها المستحث. (الشكل 1B). الأسفار فينوس الناتجة يمكن أن ترصد بدقة وعلى وجه التحديد التعريب سوبسيلولار وحركية كفاءة جمعية منصات تفعيل caspase البادئ في الخلايا المفردة. تصوير البيانات يمكن الحصول عليها بالفحص المجهري [كنفوكل] أو بواسطة الفحص المجهري fluorescence القياسية ويمكن تكييفها مع عدد من النهج مجهرية مختلفة بما في ذلك: الوقت الفاصل بين التصوير لتتبع تفعيل caspase في الوقت الحقيقي؛ التصوير عالية الدقة لتحديدات دقيقة للتعريب سوبسيلولار؛ ونقطة النهاية الكمي للكفاءة للتنشيط.

ووضع هذا الأسلوب أولاً للتحقيق في تفعيل caspase-214. بينما برنامج تفعيل caspase-2 يعتقد أن بيدوسومي، تتألف من مستقبلات بيد (بروتين p53 المستحثة مع مجال موت) ومحول ريد (المرتبطة بالتمزق معنوي-1/CAD-3 بروتين مثلى مع مجال موت)، وأبلغ تفعيل caspase-2 بيدوسومي--المستقلة. وهذا يوحي بوجود مناهج إضافية تفعيل caspase-2 15،16. على الرغم من عدم معرفة كامل مكونات النظام الأساسي تفعيل caspase-2، سمح caspase بيفك تقنية للاستجواب ناجحة من مسارات الإشارات caspase-2 في المستوى الجزيئي 14،17. لقد تكيفت أيضا بنجاح هذا البروتوكول بالنسبة caspases التحريضية (caspase-1،-4،-5 و-12) 18 ، وعلى نفس النهج من حيث المبدأ، ينبغي أن تكون كافية لتحليل كل من caspases البادئ المتبقية وبالمثل. هذا البروتوكول يمكن تكييفها على نحو مماثل للتحقيق في مسارات أخرى كانت ثنائي إشارة تفعيل رئيسية. على سبيل المثال، يتم تنشيط البروتينات ستات من ثنائي بعد الفسفرة يانوس كيناز (جاك) 19. وهكذا، يمكن استخدام نظام بيفك وضع تصور لتفعيل القانون الأساسي، فضلا عن العديد من مسارات أخرى تخضع لتفاعلات البروتين الحيوي. ويوفر البروتوكول التالية إرشادات خطوة بخطوة للأخذ بالصحفيين في الخلايا وكذلك منهجيات للحصول على الصور، وتحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الخلايا وأطباق الثقافة

ملاحظة: إجراء الخطوات من 1 إلى 3 في غطاء الاندفاق الصفحي زراعة الأنسجة. ارتداء القفازات.

  1. في حالة استخدام الزجاج أسفل الأطباق، معطف الزجاج مع فيبرونيكتين. تخطي إلى "الخطوة 1، 2" إذا كان استخدام أطباق البلاستيك.
    1. جعل حلاً 0.1 مغ/مل من فيبرونيكتين: تمييع 1 مل 1 ملغ/مل فيبرونيكتين الحل في 9 مل من 1 X PBS.
    2. تغطية الجزء السفلي من الزجاج لكل بئر مع 0.5-1 مل فيبرونيكتين واحتضان لمدة 1-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. استخدام ماصة، جمع الحل فيبرونيكتين وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الحل فيبرونيكتين يمكن إعادة استخدامها عدة مرات.
    4. يغسل الزجاج مرة واحدة مع 1-2 مل 1 X برنامج تلفزيوني، ونضح إيقاف برنامج تلفزيوني.
  2. بلايت 1 × 105 خلايا كل من لوحة 6-جيدا في 2 مل الخلية المناسبة جيدا ثقافة وسائل الإعلام (انظر الجدول 1 لأرقام الخلية لاستخدامها لآبار مختلفة الحجم). في حالة استخدام خط خلية ثابت يعبر عن مكونات بيفك caspase (انظر المناقشة)، لوحة 2 × 105 خلايا والمضي قدما إلى الخطوة العلاج (الخطوة 3).
  3. السماح بالانضمام إلى الطبق بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة الخلايا.

2-تعداء الخلايا إدخال مكونات بيفك caspase

  1. ترانسفيكت الخلايا مع الكاشف تعداء المناسبة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يحدد التعليمات الخاصة بعام 2000 ليبوفيكتاميني، التي تم الأمثل للحد الأدنى من السمية. هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح في خلايا هيلا، MCF7 الخلايا والخلايا LN18. إذا كان استخدام إضافية اتبع تعليمات الشركة المصنعة من الكواشف تعداء والأمثل حسب الحاجة.
    1. إضافة 12 ميليلتر من الكاشف تعداء ميليلتر 750 وسائط المصل انخفاض في أنبوب عقيم.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة 10 نانوغرام من بلازميد مراسل (بلازميد ترميز بروتين فلوري، مثل الأحمر نيون البروتين [العروض]، التي سيتم تسمية الخلايا ترانسفيكتيد) إلى أنبوب معقم 1.5 مل لكل بئر يكون ترانسفيكتيد.
    4. إضافة 20 نانوغرام لكل بلازميد بيفك caspase (مثلاً، 20 نانوغرام caspase-2 برودومين [برو C2]-الرأسمالي و 20 نانوغرام من C2 برو-VN) لكل أنبوبة (الجدول 2).
    5. إحضار كل أنبوبة تصل إلى إجمالي حجم 100 ميليلتر بإضافة المصل انخفاض وسائل الإعلام.
    6. استخدام ماصة p200، إضافة 100 ميليلتر من تعداء كاشف الحل من الخطوة 2.1.2 إلى بلازميد الخليط بطريقة دروبويسي.
    7. احتضان هذا المزيج كاشف بلازميد-تعداء لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. نضح وسائط الإعلام من الخلايا باستخدام ماصة أو بالشفط وثم، باستخدام ماصة p1000، "الماصة؛" 800 ميليلتر من المصل وسائل الإعلام الحرة برفق أسفل الجانب من البئر.
    9. استخدام ماصة p200، إضافة 200 ميليلتر من الحمض الدهني مجمع دروبويسي لكل بئر.
    10. احتضان الخلايا في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية ح 3.
    11. مع الحرص على عدم الإخلال أحادي الطبقة، قم بإزالة الوسائط الحرة المصل الذي يحتوي على مجمعات الحمض الدهني بالشفط باستخدام الشفط أو مع ماصة.
    12. "الماصة؛" 2 مل وسائط النمو الكامل المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) برفق أسفل الجانب من كل بئر.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة ح 24-48 للتعبير الأمثل من البروتين.

3-تنظيم دورات تعريفية لتفعيل caspase

  1. تعامل مع المخدرات أو الحافز الذي يدفع caspase التنشيط حوالي 24 ح تعداء بعد.
    1. إضافة التركيز المطلوب من المخدرات لاستعد قبل (37 درجة مئوية) تصوير الوسائط (وسائط النمو الكامل وتستكمل مع حبيس [20 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5] و [55 ميكرومتر] 2-mercaptoethanol) والمزيج بلطف (الجدول 3).
    2. نضح وسائط الإعلام من الخلايا باستخدام ماصة أو بالشفط وثم، باستخدام ماصة، "الماصة؛" 2 مل الحل من 3.1.1 برفق أسفل الجانب من البئر.
    3. إضافة وسائط التصوير بدون المخدرات إلى بئر واحدة كعنصر تحكم غير معالجة.
  2. احتضان الخلايا في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة 4.3 لتجربة الزمن الفاصل.

4. الحصول على البيانات بيفك Caspase

  1. بيفك Caspase لاكتساب نقطة مرة واحدة
    1. قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء الفلورسنت اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. العثور على الخلايا في إطار تصفية طلبات تقديم العروض والتركيز على الأسفار الجينات مراسل.
    3. استخدام عداد حصيلة يد، حساب كافة الخلايا الحاملات لطلب تقديم العروض في مجال visual. سجل العدد.
    4. مع المحافظة على نفس الحقل البصرية، قم بالتبديل إلى تصفية التجارة والنقل (أو تصفية يفب إذا كانت متوفرة)، واستخدام عداد حصيلة يد، حساب عدد الخلايا الحمراء التي أيضا الخضراء (فينوس-إيجابية). قم بالتبديل ذهابا وإيابا بين اثنين من المرشحات لضمان أن يتم تقييم الخلايا الحمراء فقط لكوكب الزهرة الإيجابية. تسجيل العدد (الشكل 3).
    5. عد الخلايا الحاملات لطلب تقديم العروض 100 على الأقل من كل مجموعة من ثلاثة مجالات فردية اللوحة.
    6. في كل منطقة، بحساب النسبة المئوية للمصابات فينوس transfected الخلايا (أي الخلايا الحمراء التي أيضا الخضراء). متوسط النسب المئوية الناتجة للحصول على الانحراف المعياري.
  2. تصوير ثلاثي الأبعاد ل caspase بيفك
    1. قم بتشغيل المجهر اتباع إرشادات الشركة المصنعة وإطلاق برامج اكتساب.
    2. حدد 60 x أو 63 x النفط الهدف ووضع قطره نفط على الهدف
    3. ضع الطبق الثقافة في مرحلة مجهر استخدام حامل اللوحة الصحيحة.
    4. باستخدام أما من مصدر ضوء ابيفلوريسسينسي وقطعة العين مجهر أو الليزر [كنفوكل] وشاشة الكمبيوتر، انتقل إلى حقل للفائدة.
    5. وتركز على الأسفار المراسل باستخدام الليزر طلب تقديم العروض أو تصفية.
    6. إذا تم استخدام ابيفلوريسسينسي حتى هذه النقطة، التبديل مصدر الضوء بالليزر [كنفوكل] وتصور الصورة الحية من الخلايا المكتسبة بواسطة الكاميرا وعرضها بالبرنامج الحصول على شاشة الكمبيوتر.
    7. باستخدام عصا التحكم وعجلة التركيز، تهذيب، التركيز وموقف من الخلايا حيث تكون الخلايا في مركز عرض الباحث. اختر الخلايا التي تكون مفصولة عن بعضها البعض وليست متداخلة.
    8. إدخال سلطة الليزر نسبة 50% وزمن التعرض في 100 مللي ثانية لكوكب الزهرة وطلب تقديم العروض كنقطة انطلاق لتحديد الإعدادات المثلى لاستخدام للتجربة.
    9. تشغيل التقاط حية وتفقد الصورة الناتجة وهو العرض المصاحب لكل القنوات.
    10. إذا كانت الإشارة منخفضة والصورة من الصعب أن تجعل من أصل، زيادة النسبة المئوية الليزر الوقت السلطة و/أو التعرض بزيادات حتى الإشارة في الصورة تبدو جيدة.
    11. تأكد من أن الإشارة لا تصل إلى الإشباع. فحص عرض الرسم البياني للتأكد من ذروة متميزة مرئياً لكل فلور. إذا كانت الذروة يشمل عرض الرسم البياني الكامل، إدخال خفض إعدادات الطاقة والتعرض لليزر (الشكل 2).
    12. تصور الخلايا التحكم (غير المعالجة أو غير ترانسفيكتيد) بنفس الشروط التأكد من أن الإشارة محددة.
      ملاحظة: ترانسفيكتانتس لون واحد يمكن استخدامها أيضا لعنصر التحكم للانتقال، ولكن إذا كانت الإشارات مكانياً مميزة (مثل الميتوكوندريا مقابل سيتوسوليك) هذا ليس ضروريا.
    13. حدد أو قم بفتح الوحدة النمطية المكدس Z في برنامج المجهر.
    14. استخدام مقبض التركيز، أرقام تقريبية لتنسيق موقف المقابلة لمركز الخلية.
    15. ضبط التركيز في اتجاه واحد حتى لم يعد مرئياً الخلية، حدد هذا الموضع العلوي.
    16. ضبط التركيز في الاتجاه المعاكس حتى الخلية لم يعد مرئياً مرة أخرى وحدد هذا الموضع السفلي.
    17. اختر حجم الخطوة المثلى (عادة حوالي 20 ميكرومتر) والبدء في الحصول على إصدار تعليمات للكاميرا لالتقاط صورة واحدة تلقائياً في كل قناة في كل خطوة من خطوات ميكرومتر 20 بين المناصب العليا والسفلي.
    18. استخدام برامج تقديم ثلاثي الأبعاد لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد (الشكل 4، 1 الفيلم).
  3. الوقت الفاصل بين التصوير من caspase بيفك
    1. قم بتشغيل المجهر على الأقل 1 ساعة قبل التجربة، وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    2. حدد 40 x أو 60 x 63 x النفط الهدف ووضع قطره نفط على الهدف.
    3. ضع الطبق الثقافة في مرحلة مجهر استخدام حامل اللوحة الصحيحة.
    4. في حالة توفر مصدر2 CO، وضع الجهاز التسليم2 CO (عادة شبكي غطاء المرفقة إلى الأنبوب الذي يسلم CO2) على رأس صاحب اللوحة. تعيين أول أكسيد الكربون مستوى2 إلى 5%، وقم بتشغيل وحدة تحكم2 CO من داخل البرنامج. إذا لم يتوفر مصدر2 CO، تشمل 20 مم حبيس المخزن المؤقت وسائط الإعلام.
    5. انتقل إلى حقل transfected الخلايا وتصور الصورة الحية من الخلايا المكتسبة بواسطة الكاميرا وعرضها بالبرنامج الحصول على شاشة الكمبيوتر باستخدام الليزر طلب تقديم العروض.
    6. وفي أعقاب الخطوات 4.2.8-4.2.12، في الإعدادات الإدخال النسبة المئوية الليزر مرة السلطة والتعرض لليزر طلب تقديم العروض. تبقى هذه القيم منخفضة قدر الإمكان في حين لا تزال قادرة على الكشف عن إشارة الفلورسنت.
    7. استخدام عنصر تحكم إيجابية العينة (انظر الجدول 3 للحصول على أمثلة)، اتبع الخطوات 4.2.8-4.2.12 لإدخال الإعدادات للنسبة المئوية الليزر وقت السلطة والتعرض لضوء الليزر يفب. تبقى هذه القيم منخفضة قدر الإمكان في حين لا تزال قادرة على الكشف عن إشارة الزهرة.
    8. لكل بئر من اللوحة، اختر عدد من المواقف المختلفة التي تحتوي على واحد أو أكثر من خلايا معربا عن المراسل.
    9. إدخال الفاصل الزمني بين كل إطار من الوقت الفاصل بين ومجموع عدد الإطارات التي تم اتخاذها. ضمان وجود الوقت للحصول على جميع المواقع المحددة قبل الإطار التالي أن تؤخذ.
    10. إعادة زيارة كل موقف وتصحيح وتحديث التركيز حسب الحاجة.
    11. لتصحيح الانحراف المحورية التي يمكن أن تنجم عن التغيرات في درجة الحرارة أو الاهتزازات الخارجية، قم بتشغيل نظام تصحيح الانحراف التركيز (إذا كان متوفراً).
    12. تبدأ مرور الزمن وحفظ البيانات.
    13. تحليل البيانات باستخدام برنامج التصوير المتاحة (الشكل 5، 2 الفيلم).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد مثال على بيفك caspase-2 الناجم عن تلف الحمض النووي في الشكل 3. كامبتوثيسين، توبويسوميراسي أنا استخدمت المانع، للحث على تفعيل الحمض النووي الضرر وكاسباسي-2. مشري البروتين الفلورسنت الأحمر كمراسل لإظهار أن الخلايا من التعبير عن التحقيق بيفك والمساعدة في تصور العدد الإجمالي للخلايا. الأسفار فينوس يظهر باللون الأخضر وبونكتا كبيرة تمثل caspase-2 الناجم عن قرب. يمكن عد هذه الخلايا لتحديد النسبة المئوية للخلايا فينوس الإيجابية. يمكن أيضا إجراء الاستنتاجات حول ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويناقش هذا البروتوكول استخدام تقسيم البروتينات الفلورية لقياس caspase الناجمين عن قرب. واختير "فينوس تقسيم" لهذه التقنية لأنها مشرقة جداً، عالية فوتوستابل وريفولدينج هو سرعة 13. وهكذا، يمكن أن توفر تحليل فينوس ريفولدينج عند caspase الناجمين عن قرب قريبة من تقديرات caspase البروتين ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي. فينوس مقسمة إلى أجزاء متداخلة قليلاً اثنين، المحطة N من الأحماض الأمينية تتألف الزهرة (فينوس-N أو VN) 1-173، وتفتيت المحطة ج (فينوس-C أو الرأسمالي) تضم بقايا 155-239. البروتينات الفلوري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نعترف بجميع الأعضاء السابقة المختبر بوشير-هايز الذين ساهموا في تطوير هذه التقنية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بجائزة الطيار طب الأطفال مستشفى تكساس للأطفال إلى LBH. ونحن نشكر شاندرا جويا (MD أندرسون، هيوستن، تكساس) للحصول على إذن تشمل البيانات التي نشرت بالتعاون مع فريق لها. تطوير الكواشف ووصف أيده الخلوي والخلية الأساسية الفرز في "كلية بايلور للطب" بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (نييد P30AI036211، NCI P30CA125123، ونكرر S10RR024574) ومساعدة جويل م. سيديرستروم

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6 آبار غير مطلي رقم 1.5 20 مم أطباق قاع زجاجيMattekP06G-1.5-20-F
بروتين منقى بالبلازما البشرية فيبرونيكتينMilliporeFC010-10MG
DPBSSigmaD8537-6x500ML
كاشف ليبوفيكتامين 2000 كاشفInvitrogen11668019
OPTI MEM IInvitrogen31985088
C2-Pro VC البلازميدAddgene49261
C2-Pro VN البلازميدAddgene49262
البلازميداتمتوفرة عند الطلب من خلايا LBH
HeLa التي تعبر بثبات عن مكوناتالمتوفرة عند الطلب من LBH
DsRed mito بلازميدClontech632421يمكن العثور على البلازميدات المماثلة التي يمكن استخدامها كمراسلين فلوريين على Addgene
HEPESInvitrogen15630106
2 Mercaptoethanol 1000XInvitrogen21985023
q-VD-OPHApex BioA1901
الالتهابية Caspase BiFC C2-Pro BiFC

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
  2. Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
  3. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
  4. Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
  5. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  6. Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
  7. Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
  8. Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
  9. Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
  10. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  11. Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
  12. Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
  13. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
  14. Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
  15. Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
  16. Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
  17. Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
  18. Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813(2015).
  19. Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
  20. Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953(2016).
  21. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  22. Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
  23. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
  24. Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
  25. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
  26. Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
  27. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  28. Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
  29. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة