مقالة منهجية

غرس اليكتروسبون ترقيع الأوعية الدموية مع الهيكل الأمثل في نموذج الفئران

DOI:

10.3791/57340

⸱

يونيو 27, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Key Laboratory of Bioactive Materials (Ministry of Education), College of Life Sciences, Nankai University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، أسلوب اليكتروسبينينج معدلة لاختلاق PCL ترقيع الأوعية الدموية مع ألياف سميكة والمسام الكبيرة، ووصف وضع بروتوكول لتقييم الأداء في فيفو في نموذج الفئران لاستبدال الشريان الاورطي البطني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لاختلاق ماكروبوروس PCL الاختلاس والأوعية الدموية، ووصف وضع بروتوكول تقييم باستخدام نموذج الفئران لاستبدال الشريان الاورطي البطني. غالباً ما تمتلك ترقيع الأوعية الدموية اليكتروسبون المسام الصغيرة نسبيا، والتي تحد من اختراق الخلية الطعوم وتعيق التجديد وإعادة عرض النيو-الشرايين. في هذه الدراسة، كانت ملفقة PCL ترقيع الأوعية الدموية مع ألياف أكثر سمكا (5-6 ميكرومتر) وأكبر المسام (~ 30 ميكرومتر) باستخدام تقنية معالجة معدلة. تم تقييم الأداء على المدى الطويل للاختلاس بغرس في نموذج الفئران الشريان الاورطي البطني. وأظهر تحليل الموجات فوق الصوتية أن الطعوم لا تزال البراءات دون تمدد الأوعية الدموية أو تضيق تحدث حتى بعد 12 شهرا زرع. هيكل ماكروبوروس تحسين إينجرووث خلية وهكذا شجعت الأنسجة مجدد في 3 أشهر. الأهم من ذلك، لا توجد أي إشارة ليعيد البناء الضارة، مثل تكلس داخل الجدار الاختلاس بعد 12 شهرا. ولذلك، اليكتروسبون PCL ترقيع الأوعية الدموية مع ماكروبوروس تعديل تجهيز عقد يحتمل أن تكون بديلاً شريان لغرس طويلة الأجل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترقيع الأوعية المصنوعة من البوليمرات الاصطناعية تستخدم على نطاق واسع في عيادة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية (كفدس). للأسف، في حالة ترقيع الأوعية الدموية الصغيرة-قطر (د < 6 مم) لا تتوفر أي منتجات ناجحة بسبب سالكيه المنخفضة الناجمة عن سرعة تدفق الدم مخفضة، الأمر الذي غالباً ما يؤدي إلى تجلط الدم وفرط إينتيمال، وغيرها 1من المضاعفات.

هندسة الأنسجة يوفر استراتيجية بديلة لتحقيق سالكيه طويلة الأجل والتوازن على أساس سقالة تسترشد تجديد الأوعية الدموية وإعادة الإعمار. بالتفصيل، الاختلاس والأوعية الدموية، كقالب ثلاثي الأبعاد، يمكن أن توفر الدعم الميكانيكية والتوجيه الهيكلية خلال تجديد الوظائف الخلوية الأنسجة الوعائية والنفوذ، بما في ذلك التصاق الخلايا، والهجرة، والانتشار، و إفراز من المصفوفة خارج الخلية2. وحتى الآن، تم تقييمها البوليمرات التركيبية المختلفة لتطبيقات في هندسة الأنسجة الوعائية. من بين هذه البوليمرات، poly(ε-caprolactone) (PCL) التحقيق مكثف نظراً للتوافق الخليوي جيدة وتدهور بطيء تتراوح بين عدة أشهر إلى عامين3. في الفئران الشريان الاورطي نموذجي4،5،6، عرضت ترقيع الأوعية الدموية PCL معالجتها بواسطة اليكتروسبينينج السلامة الهيكلية ممتازة وسالكيه وغزو الخلية بشكل مستمر، وكذلك زيادة ونيوفاسكولاريزيشن في الجدار الابتزاز لمدة تصل إلى 6 أشهر. ومع ذلك، يعيد البناء الأنسجة الضارة، بما في ذلك الانحدار من الخلايا والشعيرات الدموية وتكلس، لوحظت أيضا في تيميبوينتس أطول، حتى لمدة 18 شهرا.

سيلولاريزيشن الفساد والأوعية الدموية عامل رئيسي في تحديد تجديد الأنسجة وإصلاح7. اليكتروسبينينج، كتقنية متعددة الاستعمالات، على نطاق واسع واستخدمت للتحضير ترقيع الأوعية الدموية مع هيكل نانو ليفية8. ولسوء الحظ، هيكل مسام صغيرة نسبيا غالباً ما يؤدي إلى تسلل خلية غير كافية في الفساد اليكتروسبون والأوعية الدموية، مما يحد من تجديد الأنسجة اللاحقة. لحل هذه المشكلة، حاولت تقنيات مختلفة لزيادة حجم المسام والمساميه عموما، بما في ذلك الملح/البوليمر النض9،10، تعديل جهاز جامع، وبعد العلاج بالإشعاع الليزر11 ، إلخ. وفي الواقع، هيكل ترقيع اليكتروسبون (بما في ذلك القطر الألياف وحجم المسام مسامية) ارتباطاً وثيقا بال12،شروط تجهيز13. أثناء اليكتروسبينينج، يمكن التحكم قطر الألياف بسهولة عن طريق تغيير المعلمات، مثل تركيز حل البوليمر، ومعدل التدفق، والجهد، إلخ. 14 , 15، وذلك، حجم المسام مسامية تم تعزيز وتبعاً لذلك.

نحن ذكرت مؤخرا طعم اليكتروسبون PCL معدلة مع هيكل ماكروبوروس (ألياف مع قطرها من 5-7 ميكرون والمسام من 30-40 ميكرون). في فيفو غرس باستبدال الشريان الاورطي البطني الفئران أظهرت ارتفاع معدل سالكيه، فضلا عن تجديد اندوثيلياليزيشن والعضلات الملساء جيدة في الجراحة بعد 3 أشهر16. الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة لا أنسجة ضارة يعيد البناء بما في ذلك الانحدار تكلس وخلية حتى بعد سنة واحدة من زرع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الحيوانات التجريبية كان وافق "الحيوانات التجارب الأخلاقية اللجنة من جامعة نانكاى" ونفذ وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1-تصنيع الطعوم PCL اليكتروسبون

ملاحظة: هذه الوثيقة، استخدم أسلوب اليكتروسبينينج لاختلاق ترقيع الأوعية الدموية.

  1. إعداد الحلول PCL 25 wt % و 10% بالوزن، بتذويب PCL في خليط من الميثانول وكلوروفورم، على التوالي، (نسبة حجم 1:5)، في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 12.
  2. تحميل الحل PCL في محقن زجاج 10 مل.
  3. مكان حقنه بإبرة 21-ز.
  4. ضع مغزل الفولاذ المقاوم للصدأ (2 مم في القطر، وطولها 25 سم) على أداة جمع.
  5. ترقيع أكثر سمكا والألياف، استخدام الحل PCL 25% بالوزن، العامل مسافة 17 سم من الحافة إبرة إلى جامع، ومعدل التدفق لمل 8/ح، والجهد 11 كيلوفولت كمعلمات اليكتروسبينينج. ترقيع أرق-الألياف، استخدام الحل PCL 10 wt %، العامل مسافة 20 سم من طرف الإبرة لجامع، بمعدل تدفق 2 مل/ساعة، والجهد من 18 كيلو فولت كمعلمات اليكتروسبينينج.
  6. ضمان وضع الطعوم التي تم الحصول عليها في فراغ بين عشية وضحاها لإزالة المذيبات المتبقية. تعقيم كل الصكوك قبل الإجراء والحفاظ على الأسلوب العقيم في جميع أنحاء.
  7. قبل غرس، تطهير الطعوم التي غمر بها في 10 مل إيثانول 75% لمدة 30 دقيقة وثم تعريضها لضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
  8. قياسات حجم الألياف والمسام: حساب قطر الألياف متوسط استخدام البرمجيات ImageJ استناداً إلى مسح صور المجهر الإلكتروني (SEM).
  9. اختبار الميكانيكية من السقالات:
    1. قص السقالات أنبوبي إلى أقسام 3 ملم في الطول باستخدام شفرة حلاقة. قياس سمك السقالات استخدام ميكرومتر.
    2. ضع السقالات أنبوبي على جهاز اختبار الشد حمولتها 100 أ.
    3. المشبك السقالات مع المسافة بين المشبك 1 مم وسحب طوليا بمعدل 10 ملم/دقيقة حتى تمزق. قياس قوة الشد والاستطالة في نهاية المطاف في استراحة. حساب معامل يونغ من منطقة الخطي الأولى (تصل إلى سلالة 5 ٪) من منحنى الإجهاد-الانفعال.

2-الجرذ الشريان الاورطي البطني غرس النموذجي

ملاحظة: جميع المواد والأدوات المستخدمة في الجراحة عقيمة. أثناء الجراحة، تأكد من أن المشغل ترتدي قناع شاش والقفازات المعقمة لتجنب العدوى. التأكد من درجة حرارة الغرفة يتم الاحتفاظ في 27-30 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان. اتبع المبادئ التوجيهية إياكوك المحلية بشأن التسكين.

  1. استخدام ذكور الفئران "سبراغ داولي" وزنها 240-270 ز كمتلقين للابتزاز والأوعية الدموية. ضمان الفئران قد صام 24 ساعة قبل الجراحة. هدف الفئران الصيام ح 24 فارغة البراز في الأمعاء بما فيه الكفاية، ومن ثم توسيع الأفق للمشغل.
  2. فهم الرقبة الخلفية للفئران والاحتفاظ برأسه أسفل، أدخل إبرة سبرينج في تجويف البطن من أسفل البطن. حمل الفئران للتخدير مع كلورال هيدرات (330 ملغ/كغ) بحقنه داخل.
  3. تأكيد أنيسثيتيزيشن الكافية بضمان أن الفئران قد استرخاء العضلات والتنفس المطرد. ضع الفئران تحت المجهر التشغيل في وضع ضعيف.
  4. تطبيق مرهم الفازلين بيطري العيون في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير. إدارة منع تخثر الدم (100 UI/كغ) مع المحلول الملحي الفسيولوجي هيبارينيزيد الحل (50 UI/mL) بحقن الوريد الذيل قبل الجراحة.
  5. يحلق خارج الفراء في جدار البطن الأمامي باستخدام شفرة حلاقة، وتنظيف الجلد باستخدام حل اليود والكحول الطبي الحل.
  6. تنفيذ شق البطن خط الوسط مع المقص الجراحي والتأكد من أن الشق طولها حوالي 4-5 سم ثم يعرض تجويف البطن.
  7. تتراجع والتفاف الأمعاء مع شاش مبلل مع المحلول الملحي تفضيلي.
  8. تشريح الشريان الاورطي البطني بعناية.
  9. تحديد وسد جميع فروع صغيرة باستخدام خيوط النايلون حيدة 9-0.
  10. المشبك المقطع معزولة (تصل إلى 1 سم في الطول) من الشريان الاورطي استخدام المشابك الأوعية الدموية اثنين. يمكن أن يبقى الشريان الاورطي فرضت لمدة 20-30 دقيقة.
  11. قطاع الشريان الاورطي البطني بين المشابك اثنين باستخدام مقص الصغرى لإنشاء المواقع أناستوموتيك.
  12. استواء طرفي الشريان الاورطي باستخدام حل هيبارينيزيد المالحة (50 UI/mL) لإزالة الدم المتبقي.
  13. تقشر الغلالة استخدام مقص الصغرى.
  14. أناستوموسي الاختلاس مع القطر الداخلي 2 ملم و 1 سم في الطول للشريان الاورطي البطني في الفئران مع نمط خياطة الشكل من ثمانية باستخدام خيوط النايلون حيدة 9-0.
  15. أولاً، بناء أربعة أناستوموسيس وفقا لتسلسل المناصب 06:00 ص في الجهة الدانية، 12، 9 و 3، ثم anastomose حواف قطع في غرز 4 بين اثنين خياطة الجروح. بعد الانتهاء من خياطة الدانية، خياطة الجانب القاصي بنفس الطريقة.
    ملاحظة: كل غرزة مطلوب لضمان الجانب الأصلي قليلاً مضمن في الاختلاس.
  16. إزالة المشبك القاصي للسماح للدم في التدفق إلى الفساد، ثم إزالة المشبك الدانية.
  17. اضغط نهايات خياطة لوقف النزيف استخدام كرة القطن معقمة أو الأسفنج شاش صغيرة. اضغط لحوالي 3 دقائق، حتى الأرقاء.
  18. إرجاع الأمعاء إلى تجويف البطن.
  19. مسح تجويف البطن باستخدام حل المحلول الملحي الفسيولوجي دافئة مع الجنتاميسين (320 U/mL).
  20. خياطة حتى جدار البطن باستخدام خياطة نايلون 3-0 في طبقة العضلات والجلد، على التوالي.
  21. وضع الفئران في قفص نظيفة وجافة ووضع وسادة تدفئة تحت القفص للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان؛ ثم الانتظار للفئران للتعافي من التخدير. حضور للحيوان حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
  22. بعد أن يستعيد وعيه، وضعت الفئران في قفص واحد مع الغذاء والماء. تطبيق اليود على الجرح لمنع العدوى بعد الجراحة. عودة الفئران إلى شركة الحيوانات الأخرى إلا أنه يتعافى تماما.
  23. Euthanize الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية عند نقطة زمنية محددة مسبقاً.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطعوم PCL كانت اكسبلانتيد في 3 أشهر و 12 شهرا قد وتحليلها من قبل تقنيات نسيجية القياسية الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، الفلورة تلطيخ ل α-SMA، ويحققون فون، ماسون trichrome وجيسون فإن بيرهوف (ففج) مية و vWF الايلاستين. أخذت الصور النسيجي باستخدام مجهر تستقيم، وأخذت الصور الفلورة استخدام مجهر fluorescence.

وأعرب عن جميع البيانات يعني ± التنمية المستدامة. اثنين-الذيل إقران الطالب t-تم استخدام اختبار لمقارنة الاختلافات. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلل خلية حاسم بالنسبة للتجديد ويعيد للابتزاز والأوعية الدموية في الجسم الحي16. تسلل خلية محدودة غالباً ما تتصل بمسام صغيرة نسبيا الاختلاس التي تعوق هجرة الخلايا إلى الجدار الاختلاس. ولمواجهة هذه الصعوبة، قمنا بتطوير طريقة معدلة لإعداد اليكتروسبون PCL ترقيع الأوعية الدموية مع هيكل المسام الكبيرة. بالتفصيل، زيادة حجم المسام مع زيادة سمك الألياف التي يمكن التحكم في سهولة بمعالجة معلمات. وأظهرت النتائج أن الخلايا المضيفة يمكن بسهولة التسلل إلى الجدار لهذا الابتزاز ماكروبوروس بعد في فيفو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل ماليا المشاريع تشرف (81522023، 81530059، 91639113، 81772000، 81371699 و 81401534).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كريات بولي (إبسيلون ؛ كابرولاكتون) (PCL) (Mn< / sub> = 80،000) شركةسيجما704067
الميثانولتيانجين شركة الكاشف الكيميائي1060
كحولشركة تيانجين للكاشفالكيميائي 1083
شركة الكواشف الكيميائي الكلوروفورمتيانجينA1007
السكروزتيانجين فنغتشوان الشركة2296
Triton X-100Alfa AesarA16046
Sprague Dawley الفئرانمختبر مركز أكاديمية العلوم
العسكرية المحلول الملحي العاديHebei Tiancheng شركة
Chloral hydrateTianjin Ruijinte شركة كيميائية2223
حقن الصوديوم الهيبارينتيانجين بيوكيم للأدوية
كبريتات جنتاميسينشركة جيانغسو ليانشوي للأدوية
الفأر المضاد لألفا SMA الجسم المضادAbcamab7817
الفأر المضاد للنعومة MYH الجسم المضادAbcamab683
الأرانب متعدد النسيلة المضاد للفئران الإيلاستين الجسم المضادAbcamab23748
الأرانب المضادة لعامل فون ويلبراند الجسم المضاد الأساسيAbcamab6994
الماعز المضاد للفأر IgG (Alexa Fluor 488)Invitrogenab150117
الماعز المضاد للأرانب IgG (Alexa Fluor 488)Invitrogenab150077
5٪ مصل الماعز العاديZhongshan Golden BridgeZLI9022
Hematoxylin و eosin (H& amp; ه)بكين ليجين التكنولوجيا الحيويةDH0006
ماسون ثلاثي الألوانبكين ليجين التكنولوجيا الحيويةDC0032
فيرهوف فان جيسون (VVG)بكين ليجين التكنولوجيا الحيويةDC0059
فون كوسابكين ليجين التكنولوجيا الحيويةDS0003
خيوط جراحية الإبر مع الخيط ، 3-0 الحريرشنغهاي جينهوان شركة المستلزمات الطبيةG3002b
خيوط جراحية الإبر مع الخيط ، 9-0 الحريرشنغهاي Jinhuan شركة المستلزمات الطبيةH901
الطبيةالأدوية شركة حقن الأساسي الأساسي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation. J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).
  2. Zhang, L., et al. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).
  3. Thottappillil, N., Nair, P. D. Scaffolds in vascular regeneration: current status. Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).
  4. Pektok, E., et al. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).
  5. Innocente, F., et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation? Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).
  6. de Valence, S., et al. Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration. Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).
  7. Assmann, A., et al. Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating. Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).
  8. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
  9. Baker, B. M., et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).
  10. Wang, K., et al. Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).
  11. Lee, B. L. P., et al. Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds. Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).
  12. Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. Increasing the pore size of electrospun scaffolds. Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).
  13. Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review. Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).
  14. Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
  15. Rnjak-Kovacina, J., et al. Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering. Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).
  16. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  17. Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).
  18. Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PCL

مقالات ذات صلة