مقالة منهجية

توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

DOI:

10.3791/57365

⸱

أغسطس 10, 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Auburn University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم طريقة لتحديد وعزل عدد كبير من GM-CSF مدفوعة النقوي الخلايا باستخدام فرز الخلايا عالية السرعة. ويمكن تحديد خمس السكان متميزة (المتكفل النقوي المشتركة وفروعه المحببات/بلعم ووحيدات، الضامة المشتقة من الوحيدات والمشتقة من الوحيدات DCs) استناداً إلى تعبير Ly6C و CD115.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مؤخرا تم الاعتراف بثقافات المشتقة من الوحيدات الخلايا الجذعية (مودك) التي تم إنشاؤها من نخاع العظام الماوس باستخدام "عامل تحفيز مستعمرة" بلعم المحببات (GM-CSF) لتكون غير متجانسة أكثر مما كانت موضع تقدير. وتتضمن هذه الثقافات بشكل روتيني مودك كذلك الوحيدات المستمدة الضامة (موماك)، وحتى بعض الخلايا الأقل نمواً مثل وحيدات. والهدف من هذا البروتوكول توفير أسلوب متناسق لتحديد الهوية، والفصل بين العديد من أنواع الخلايا الموجودة في هذه الثقافات كما أنها تضع، حتى أن وظائفها المحددة قد يكون مزيدا من التحقيق. الاستراتيجية الفرز المعروضة هنا يفصل الخلايا أولاً إلى السكان أربعة استناداً إلى التعبير عن Ly6C و CD115، اللذين يتم أعرب عابر من الخلايا كما أنها تضع في ثقافة يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية. تشمل هؤلاء السكان أربعة المتكفل النقوي المشتركة أو CMP (Ly6C و CD115)، المتكفل المحببات/بلعم أو GMP (Ly6C +، CD115-)، وحيدات (Ly6C +، CD115 +)، والمشتقة من الوحيدات الضامة أو موماك (Ly6C-، CD115 +). يتم أيضا إضافة CD11c إلى استراتيجية الفرز التمييز بين اثنين من السكان داخل Ly6C-، CD115-السكان: اجتماع الأطراف (CD11c-) ومودك (CD11c +). وأخيراً، اثنين من السكان يمكن تمييز كذلك داخل Ly6C-، CD115 + السكان استناداً إلى مستوى الطبقة MHC التعبير الثاني. موماكس التعبير عن المستويات الدنيا من الطبقة MHC الثاني، بينما سليفة DC المشتقة من الوحيدات (مودب) تعرب عن أعلى MHC الدرجة الثانية. يسمح هذا الأسلوب لعزل عدة السكان تنمويا متميزاً في أرقام موثوقة كافية لمجموعة متنوعة من التحليلات الفنية والإنمائية. نسلط الضوء على أحد قراءات وظيفية مثل، التفاضلية ردود هذه أنواع الخلايا على التحفيز مع "أنماط الجزيئية باثوجيناسوسياتيد" (بامبس).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استزراع خلايا نخاع العظام مورين مع سيتوكين "عامل تحفيز مستعمرة" بلعم المحببات (GM-CSF) يستخدم على نطاق واسع كوسيلة لتوليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (مودك؛ ويعرف أيضا باسم DC التحريضية) في، إعداد كبيرة 1 2،3،،من45. هذه الخلايا كانت مفيدة للغاية في مجموعة متنوعة من الدراسات المتعلقة بالخلايا الجذعية (DC) الدالة 6،،من78. بشكل عام، هذه الخلايا نخاع العظام مورين تربى لمدة 6-8 أيام وتستخدم فيما بعد لدراسة الخلية الجذعية الدالة 5. هذه الثقافات منذ فترة طويلة وقد نظر معظمها متجانسة، تتكون من أغلبية مودك المتباينة. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن في نهاية هذه الفترة 6-8 يوم الثقافة، هناك في الواقع العديد من مودك، فضلا عن مجموعة فرعية كبيرة من المتباينة الضامة المشتقة من الوحيدات (موماكس) 9،،من1011. وقد مدد الدراسات الخاصة بنا هذه النتائج تبين أن مجموعات فرعية أخرى من خلايا أقل نمواً، مثل مودك السلائف (مودب) ووحيدات، تظل في الثقافات في الترددات المنخفضة حتى بعد 7 أيام 10. وهكذا، يمكن أن تعكس الدراسات المتعلقة بالخلايا الجذعية (DC) دالة باستخدام الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا النظام الردود الواردة من مجموعة أوسع من أنواع الخلايا مما سبق تقدير.

لقد تعلمنا الكثير من دراسة مودك GM-CSF-ولدت المتصلة بوظيفة هذه الخلايا في المراحل النهائية للمفاضلة 12،،من1314. بيد أننا نفهم إلى حد كبير أقل حول المسار التنموي لهذه الخلايا 2،،من1516 ومن كيف ومتى هم يعرضون محددة المهام مثل: القدرة على الاستجابة "مسببات الأمراض المرتبطة الجزيئية" أنماط (بامبس)، البلعمه، مستضد تجهيز وعرض 13، والأنشطة المضادة للبكتيريا. بروتوكول لعزل عدد كبير من فروعه DC يحركها Flt3L التقليدية والسلائف قد أبلغ عنها 17. عزل هؤلاء السكان متميزة تحقق استخدام إستر سوكسينيميديل "كاربوكسيفلوريسسين" (CFSE)-الملون خلايا نخاع العظام (لتعقب تقسيم الخلايا) والثقافة في Flt3L لمدة 3 أيام. الخلايا ثم استنفاد الخلايا إيجابية لينج وفرزها إلى السلف والسلائف من السكان استناداً إلى تعبير CD11c 17. وكان نهج آخر لينين للفريق لتحديد المتكفل المبكر من العاصمة في ثقافة يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية لفرز الخلايا استناداً إلى CD31 و Ly6C 18. وكان الهدف الأولى لإنشاء أسلوب مماثل للحصول على فروعها والسلائف من مودك يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية. بسبب أنواع الخلايا المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة GM-CSF، نحن تكييف النهج وفرز استراتيجية تستند إلى التعبير عن الجزيئات التي تم الإعراب عنها في مراحل مبكرة ولاحق للتنمية. ونحن في نهاية المطاف قرر أن Ly6C، CD115 (مستقبلات السائل الدماغي النخاعي-1)، وكانوا CD11c على علامات أفضل للتمييز بين هذه الخلية أنواع 10.

وهنا نقدم طريقة لعزل الخلايا على عدة مراحل متميزة للتنمية على طول الطريق من التمايز يقودها جنرال موتورز-CSF: المشترك النقوي السلف (CMP)، بلعم المحببات السلف (GMP)، الوحيدات، المشتقة من الوحيدات بلعم (موماك) والمشتقة من الوحيدات DC (مودك). السكان موماك يمكن كذلك عزلهم يستند إلى على مستوى الطبقة MHC التعبير الثاني، يكشف عن مودك سلائف سكان (مودب) 10. فنحن نستخدم خلية تنشيط الفلورية عالية السرعة الفرز استراتيجية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لعزل هؤلاء السكان 5 استناداً إلى التعبير عن Ly6C و CD115 و CD11c. ثم نظهر في دراسة هذه الخلايا بالوظيفية فحوصات الكشف عن استجاباتها لتحفيز بمب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أقر جميع أعمال الحيوان برعاية الحيوان المؤسسية جامعة أوبورن واستخدام اللجنة وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة".

1-التحضير لجمع نخاع العظام

  1. تحضير الوسائط كاملة 250 مل بإضافة حل للمتوسطة روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 تستكمل مع مصل العجل الجنين 10% والجلوتامين 2 مم و 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol إلى الجزء العلوي من 0.22 ميكرومتر تصفية فراغ قارورة وحدة، وتطبيق فراغ.
    ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة كاملة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
  2. تحضير محلول الإيثانول 70% بخلط 350 مل إيثانول 100% مع 150 مل العقيمة ح2س في قارورة 500 مل.
  3. مجموعة من أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  4. تعقيم الملقط ومشرط ومقص في الإيثانول 70%.
  5. استخدام ماصة مصلية، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام كاملة إلى ثلاثة أطباق بيتري 60 ملم.
  6. استخدام ماصة مصلية، إضافة 30 مل وسائط كاملة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.

2-مجموعة من خلايا نخاع العظام مورين

  1. Euthanize ماوس C57BL/6 بالخدر2 CO وفقا للقواعد المقررة في عام 2013 الرابطة الطبية البيطرية الأميركية (وبرايتون) مبادئ توجيهية بشأن القتل الرحيم.
  2. إزالة وقطاع الخلفيتين.
    1. تشبع الخلفيتين والجذع مع الإيثانول 75%، وإجراء تخفيضات الضحلة عن طريق الجلد حول الورك مع مقص منحنى الأنسجة. استخدام الملقط، إيمانا راسخا سحب الجلد من الورك إلى أسفل نحو الكاحل، يكشف عن العضلات. استخدام مقص لإزالة رفرف الجلد.
    2. إزالة الساق كله هند بالقطع عن طريق العظام فقط فوق عظم الفخذ/الورك.
      ملاحظة: بالإضافة إلى تعقيم المنطقة، سوف المعونة في تقديم تخفيضات نظيفة والحيلولة دون تلوث العينات الشعر الإيثانول.
    3. إذا الساقين ستنقل إلى موقع جديد لحصاد نخاع العظام، تغرق في الساقين في وسائل الإعلام كاملة.
  3. تعمل في مجال السلامة الأحيائية عقيمة مجلس الوزراء، نقل الساقين إلى واحدة من أطباق بيتري المجهز سابقا.
  4. استخدام مقص لقص فقط أدناه الكاحل، وعناية إزالة جزء كبير من النسيج الضام العضلات ومرنة قدر الإمكان. نقل العظام تنظيفها إلى طبق بتري استعداد الثانية.
    ملاحظة: على الرغم من أنه ليس من الضروري إزالة جميع العضلات، الكثير من الأنسجة المتبقية يمكن أن تجعل من الصعب طرد نخاع العظام.
  5. فصل في عظم الفخذ والركبة والساق.
    1. استخدام الملقط، عقد فريق الخبراء في الركبة وتحديد موقع النخاع.
      ملاحظة: يجب أن تكون مرئية كخط أحمر خافت داخل تجويف العظام في الجزء العلوي من عظم الفخذ، وفي نهاية الساق نخاع العظام.
      1. باستخدام مقص، جعل التخفيضات الثلاثة كما يلي.
        1. قص الساق فقط أعلاه حيث يظهر النخاع لإنهاء.
        2. قص أسفل الركبة.
        3. قص فقط فوق الركبة.
        4. إذا كان يزال متصلاً الورك لعظم الفخذ، قص أسفل الورك.
      2. إعادة الأجزاء الثلاثة إلى طبق بتري وكرر هذه العملية على الساق الأخرى.
  6. مسح نخاع العظم من عظم الفخذ والساق.
    1. تعبئة حقنه 10 مل مع وسائل الإعلام كاملة من أنبوب 50 مل المخروطية، وكاب بإبرة ز 23.
    2. عقد العظام مع الملقط أعلاه طبق بيتري استعداد الثالث، أدخل الإبرة في القناة العظام ودفع وسائل الإعلام من خلال طرد الخلايا (التي قد تخرج سليمة "توصيل" أو كمجموعات عدة). كرر حتى يمكن رؤية لا المزيد من الألوان من خلال العظام. إعادة ملء المحاقن مع وسائل الإعلام عند الاقتضاء.
  7. سحق في epiphyses.
    1. بينما لا يزال في طبق بتري الثاني، عقد الركبة بشدة مع الملقط، واهرسيها الركبتين مع غيض المحاقن. أن يستمر epiphyses لم تعد حمراء.
  8. استخدام المحاقن، نقل الخلايا من طبق بتري الثاني والثالث إلى أنبوب 50 مل. تفكك حتى كتل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً. حاول عدم توليد فقاعات. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. خلايا الدم الحمراء
    1. إزالة المادة طافية مع ماصة المصلية، وإزاحة بيليه بالتحريك، وخلايا الدم الحمراء التي تفرخ في 1 مل من "المخزن المؤقت لتحلل" ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. استخدام ماصة مصلية إضافة 40 مل من المخزن المؤقت لحبس (هانكس متوازن الملح الحل).
  10. استخدام ماصة مصلية، تصفية الخلايا على الرغم من مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  11. استخدام ماصة مصلية، إزالة خلايا طافية ويغسل مع 40 مل من وسائل الإعلام كاملة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن إزالة النسب لمفاوية إيجابية من نظام مراقبة الأصول الميدانية أو تنقية العمود المغناطيسية. ومع ذلك، لا يتم الاحتفاظ لمفاوية طويلة الأجل في الثقافة. على الرغم من أن عددا كبيرا من الخلايا إيجابية النسب موجودة في Ly6C-CD115-السكان في نخاع العظام السابقين فيفو، كلها تقريبا لا توجد بها يوم 5 (الشكل 2).
  12. استخدام ماصة مصلية، إزالة المادة طافية، والثقافة خلايا نخاع العظام في وسائل الإعلام كاملة مع 10 نانوغرام/مل من الماوس المؤتلف GM-CSF في كثافة 1 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: عادة، 4 × 107 مجموع الخلايا يمكن حصادها بعد تحلل خلايا الدم الحمراء. ومع ذلك، نتوقع أقل من 2 × 107 للمبتدئين، وتصل إلى 5 × 107 خلايا حصادات ذوي الخبرة.
  13. استخدام ماصة مصلية، نقل الخلايا إلى لوحات زراعة الأنسجة، واحتضان في 37 درجة مئوية في شركة 5%2. في حالة استخدام لوحة 24-حسنا، البذور كل جيدا مع 2 مل تعليق خلية.
  14. كل 48 ساعة، استخدم ماصة مصلية إزالة نصف من وسائط الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام كاملة جديدة و GM-CSF.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الثقافات إلى 9 أيام. ومع ذلك، تكوين التغييرات على مر الزمن. انظر القسم 3 للحصول على مزيد من المعلومات.

3-اختيار اليوم للفرز

  1. التراكيب السكانية خلية تغير مع مرور الزمن، وحدد يوم الذي غلة أعلى عدد من الخلايا المطلوب.
  2. انظر الجدول 1 للفرز وظيفة العائد المتوقع من الخلية لكل السكان بعد أيام 3 و 5 و 7 من الثقافة في GM-CSF الواحدة 1 × 107 الخلايا.

4-صبغة استراتيجية

  1. استخدام مختبرين صغيرة من الخلايا لتحضير عينات مراقبة. إدراج عنصر تحكم أونستينيد، عينات مراقبة التعويض ملطخة بجسم واحد فقط الفلورسنت كل منهما، والأسفار-ناقص-واحد يتحكم في أي أجسام جميع يتم إضافة استثناء واحد، إلى عنصر تحكم للأسفار غير محددة في هذه القناة. في حالة استخدام العلامات غير المباشرة، وتشمل الابتدائي الثانوي وحدها، وحدها، والابتدائية والثانوية.
    ملاحظة: فيكوريثرين (PE) والأجسام المضادة اللوفيكوسيانين (APC) معلم توفر فصل متميزة مع الحد الأدنى من التسييل عبر عند استخدامها معا. لكن إذا كانت خيارات fluorochrome محدودة، CD115 هو أعرب عن عند مستوى منخفض نسبيا، بينما يتم التعبير عن Ly6C على مستويات عالية جداً. ولذلك، فلوروتشروميس أكثر إشراقا من المستصوب لمكافحة CD115، ويتم اختيار فلوروتشروميس Ly6C المضادة لمنع التسييل على.
  2. إعداد 100 مل من "المخزن المؤقت" المياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية (FWB) عن طريق خلط مل 97 من الفوسفات مخزنة المالحة برود دولبيكو (دببس) مع 3 مل مصل العجل الجنين في أنبوب 50 مل مخروطية، ووضع في حمام الثلج.
  3. استخدام ماصة بلطف، ولكن دقة، "الماصة؛" خلايا صعودا وهبوطاً لإزاحة أي خلايا ملتصقة فضفاضة.
  4. استخدام ماصة مصلية، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    1. إذا تجاوز حجم الخلية 50 مل، نقل الخلايا إلى العدد اللازم من أنابيب والجمع في الخطوة المصبوغة.
  5. بلطف من أجل إيقاف المادة طافية، وتغسل الخلايا الأعلاف بإضافة 30 مل FWB مع ماصة مصلية. الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتكرار الغسيل.
    ملاحظة: إذا كان من المتوقع موت الخلايا عالية، يمكن غسلها الخلايا مع FWB مع منخفضة تصل إلى 0.5% مصل العجل الجنين (FCS). سيمنع هذا التثاقل الخلية.
  6. تعليق ووصمة عار الخلايا كل جسم لإرشادات الشركة المصنعة.
    1. تعليق 5 × 107 خلايا في 1 مل FWB وإضافة 2 ميكروغرام في كل Ly6C المضادة ومكافحة--CD115 المسمى مع فلوروفوريس (من اختيار للباحث). إضافة لزيادة تمييز CMP من مودك (كلاهما Ly6C-و CD115-)، 2 ميكروغرام للأجسام المضادة-CD11c (CMP هي CD11c–؛ هي مودك CD11c+). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: الرقم 3 تم إنشاؤها باستخدام Ly6C-PE و CD115--آسيا والمحيط الهادئ.
  7. استخدام ماصة مصلية، إضافة 10 مل FWB، وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  8. بلطف من أجل إيقاف المادة طافية، وتغسل الخلايا الأعلاف بإضافة 30 مل FWB مع ماصة مصلية. الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتكرار الغسيل.
  9. قبل تعليق الخلايا، نفض الغبار أنبوب دقيق لإزاحة بيليه. استخدام ماصة مصلية تعليق الخلايا في خلية 1 × 107 /مل من FWB، وتصفيتها من خلال تصفية خلية 35-ميكرومتر. استخدام ماصة مصلية نقل الخلايا التي تمت تصفيتها في الأنبوب البولي بروبلين، ووضع على الجليد حتى جاهزة لفرز.
    ملاحظة: إذا كان بولي بروبلين غير متوفر، يمكن استخدام أنابيب البوليسترين المغلفة البروتين (اللبن المجفف الخالي أو السفح) خفض ملزم.

5-تعيين غيتس استناداً إلى عينات التحكم

ملاحظة: لمنع تعطيل الخلية بسبب ضغط تيار تدفق عالية السرعة، استخدم فوهة ميكرومتر 100 – 130 لفرز الخلايا.

  1. تشغيل عنصر التحكم أونستينيد (راجع الخطوة 4، 1) من خلال فارز الخلية، وتطبيق بوابة لاستبعاد الحطام الصغيرة (مبعثر الأمام منخفضة؛ منتدى التعاون الأمني) والغاية الحبيبية (مبعثر الجانب عالية؛ SSC) الجسيمات.
    1. لتحليل تنطبق فقط مراحل لاحقة (وحيدات، موماك/مودب ومودك)، النابضة لتضمين الخلايا أكبر (FSC عالية) فقط.
    2. إذا المستخدمة الجدوى البقع، استخدم هذه لاستبعاد أحداث الملون، وغير قابل للحياة (على سبيل مثال يتضح في الشكل 1).
  2. تشغيل نماذج تحكم فلوري واحد عن طريق فارز الخلية، وضبط التعويض حسب الحاجة.
  3. تشغيل عينة من عينة المسمى متعدد. مراقبة السكان متميزة أربعة: Ly6C + CD115-(غمبس)، Ly6C + CD115 + (وحيدات)، Ly6C-CD115 + (موماكس/مودب)، و Ly6C-CD115-(CMPs/مودكس). تطبيق بوابة لعزل كل من السكان الرئيسية الأربعة.
    ملاحظة: مشاركة CMPs ومودك Ly6C-CD115-النمط الظاهري. بيد أنها يمكن أن تكون متباينة استناداً إلى التعبير CD11c: CMP تفتقر إلى CD11c، في حين أعرب مودكس CD11c.

6-مجموعة من السكان المعزولين

  1. إعداد أنابيب جمع بإضافة السفح ما يكفي لتحقيق 20 في المائة على الأقل التركيز النهائي عندما الكامل. على سبيل المثال، في حالة استخدام أنابيب 5 مل، إضافة 1 مل السفح قبل الفرز، وإزالة الأنبوب عندما يصل إلى حجم إجمالي 5 مل.
  2. لمنع امتصاص الغشاء دوران، والأجسام المضادة، تبقى جميع العينات (مختلطة وفرز) في 4 درجات مئوية خلال عملية الفرز.
    1. إذا لم يكن هذا ممكناً، الاحتفاظ بالانبوب الذي يحتوي على الخلايا لفرز على الجليد بقدر الإمكان ونقل مختبرين إلى فارز حسب الحاجة.
    2. بالإضافة إلى ذلك، نقل فرز عينات الجليد كل 20-30 دقيقة.
  3. بعد أن تم جمع العدد المطلوب من الخلايا، استخدم ماصة مصلية نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل جديد. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    1. تأكيد النقاء مع نوعا ما بعد التحليل في مختبرين الصغيرة من كل السكان التي تم جمعها.
  4. إزالة المادة طافية، وتعليق في 10 مل FWB وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تكرار لمجموعة من يغسل اثنين.
    ملاحظة: أنه يمكن أن تكون صعبة لإزالة جميع المادة طافية دون إزاحة بيليه. إرفاق تلميح ماصة لخط فراغ يمكن أن تساعد في إزالة. إذا لم يكن هذا متوفراً، اقترح أن تجمع المادة طافية في أنبوب طازجة في حالة الانفصال بيليه.
  5. إزالة المادة طافية بعد الغسيل الثاني.
  6. إذا كان التصميم التجريبي الخاص بالمستخدم يفرض إعادة استزراع الخلايا، اتبع الخطوات 2.12 – 2.14. وبخلاف ذلك، إذا كان سيتم استخدام الخلايا للتحليل الفوري، إعداد الخلايا وفقا للبروتوكول المطلوب.
    ملاحظة: يتم تضمين مثال نموذجي التحليل الوظيفي في الشكل 4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في محاولة للحفاظ على العديد من القنوات المتاحة للتحليل كالخلايا الممكنة، وقابلة للتطبيق بشكل روتيني اختيرت استناداً إلى مبعثر أمامية وجانبية، باستثناء أحداث صغيرة جداً ومحبب جداً (بوابة نموذجية يتم تطبيق على كافة المؤامرات دوت في الشكل 1A). لتحديد ما إذا كانت هذه الاستراتيجية النابضة موثوق استبعاد الخلايا الميتة، ونحن ملطخة 7 الأمينية والاكيتنوميسين د (7-عاد) (الشكل 1B). 7AAD بقع الحمض النووي في خلايا ميتة ويموتون بسبب نفاذية الغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويسهل هذا البروتوكول عزلة يحركها من السائل الدماغي النخاعي جنرال موتورز السلف والسلائف أنواع الخلايا بإعداد كافية لعدة أنواع من التحليلات بما في ذلك فحوصات الكيمياء الحيوية، فحوصات وظيفة الخلوية في المختبر، أو تقطير في فيفو. هذا الأسلوب يمثل تقدما كبيرا في مجال تطوير الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات، تمكين عزل موثوق بها وتحديد الخلايا في بداية هذا المسار للتنمية، فضلا عن تلك الأنواع من خلية متمايزة أكثر شيوعاً معزولة في دراسات سابقة.

وقد اعتمدت البروتوكولات السابقة لعزل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب على لا تعارضات بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للمساعدة التقنية من "أليسون الكنيسة الطيور" في أوبورن جامعة مدرسة من الطب البيطري التدفق الخلوي المرفق، لتمويل من المعاهد الوطنية للصحة EHS R15 R15 AI107773 والخلوية وبرنامج البيولوجيا الجزيئية في جامعة أوبورن لفصل الصيف تمويل البحوث لاستعراض البرامج والميزانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMI 1640Corning15-040-CV
مصل عجل الجنين (FCS)HyCloneSV30014.04لتكملة الوسط الكامل و FWB
GlutaMAXGibco35050لتكملة متوسط كامل
2-mercaptoethanol (2-ME)MP 190242 الطبية الحيويةلتكملة متوسط كامل
75 ملي فلتر فراغحراري علمي156-4045لتعقيم الوسائط الكاملة
ACK Lysis BufferLonza10-548Eلتحلل خلايا الدم الحمراء
HBSS العازلةCorning21-020-CMلإنقاذ الكريات البيض بعد تحلل خلايا الدم
الحمراء محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) ، يجب أن يكون Dulbecco'sLonza17-512Fخاليا من السموم الداخلية ؛ مبردة عند 4 درجات ؛ ج
35 وميكرو ؛ م مرشح الخليةفالكون352235لتفكيك الكتل قبل المرور عبر مقياس الخلوي.
GM-CSFBiosourcePMC2011تركيز قابل للاستخدام يبلغ 10 نانوغرام / مل
لوحة معالجة بالأنسجة المزروعةVWR10062-896لخلايا نخاع العظام بعد الحصاد
Anti-Ly6C ، Clone HK1.4Biolegend128018
Anti-CD115 ، Clone AFS98Tonbo Bioscience20-1152-U100
Anti-CD11c ، Clone HL3BD Biosciences557400للتمييز بين CMP و MoDCs
MoFlo XPD Flow CellularBeckman CoulterML99030
BD Accuri C6BD Biosciences660517
100٪ إيثانولPharmco-Aaper111000200CSPP
60 مم Petri DishCorning، Inc353002
50 مل أنبوب مخروطيVWR21008-242
C57BL / 6 الفئرانمختبر جاكسون000664أنثى ؛ 10-20 أسبوعا
من العمر Biosafety HoodThermo Scientific8354-30-0011
10 مل حقنةBD Biosciences301604
23 G إبرةBD Biosciences305145
جهاز طرد مركزي 5810 & nbsp ؛ Reppendorf22625501
FlowJo Software v10BD Biosciencesالإصدار 10flowjo.com

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985(2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327(2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Ly6C CD115 CD11c MHC Class II GM CSF FACS

مقالات ذات صلة