مقالة منهجية

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

DOI:

10.3791/57371

⸱

أبريل 10, 2018

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Uniformed Services University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكننا وصف بروتوكول سهلة وبسيطة لقياس تعزيز جسم تعتمد الإصابة بواسطة Zika المصل النقاهة فيروس حمى الضنك فيروس "مراسل الجسيمات الفيروسية" باستخدام.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد ثبت تعزيز الإصابة يتوقف جسم تلعب دوراً كبيرا في نشوء المرض حمى الضنك الفيروسية. الاختبارات التقليدية التي تقيس قدرة الأجسام المضادة أو مصل لتعزيز الإصابة في خطوط الخلايا غير مسموح به يعتمد على استخدام إخراج الفيروسية في وسائط الإعلام تليها اللوحة فحوصات لتحديد حجم الإصابة. في الآونة الأخيرة، قد درست هذه فحوصات الإصابة بالفيروسات (DENV) حمى الضنك في خطوط الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي. وقد كلا النهجين هذه القيود التي تحد من استخدام هذه التقنيات على نطاق واسع. وهنا، يمكننا وصف مقايسة بسيطة في المختبر استخدام حمى الضنك فيروس مراسل الفيروسية جسيمات (رفبس) التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء والخلايا K562 لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) الإصابة DENV استخدام مصل الدم التي تم الحصول عليها من ريسوس ماكاكويس 16 أسبوعا بعد الإصابة بفيروس زيكا (زيكف). هذا الأسلوب هو موثوق بها وينطوي على الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا ولا تنطوي على استخدام النسخ المتماثل يعيش فيروس المختصة ويمكن أن يؤديها في شكل إنتاجية عالية للحصول على قراءات كمية استخدام التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) العدوى مصفر الأخرى مثل فيروس الحمى الصفراء (يفف)، فيروس "التهاب الدماغ الخيلي الياباني" (جيف)، فيروس غرب النيل (WNV) التي تتوفر فيها رفبس إلخ. سهولة إعداد التحليل، تحليل البيانات، وتفسير النتائج يجعل قابلية عالية لمعظم المختبرات إعدادات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جسم تعتمد تعزيز (ADE) العدوى هي عملية موجبة جسم جزئيا تحسن الاستجابات الناجمة عن النمط المصلي المسيطر فيروس يعزز الإقبال على النمط المصلي المسيطر آخر للفيروس، مما يؤدي إلى زيادة النسخ المتماثل الفيروسية وفريميا. تم توثيق ADE على نطاق واسع في حالات العدوى بالفيروس (DENV) حمى الضنك التي يكثر فيها اللقاح الرئيسية الأربعة. في مجموعة فرعية مرضى، يرتبط ADE بحمى الضنك النزفية (الدنك). ونحن قد أظهرت مؤخرا أن عدوى فيروس (زيكف) زيكا الناجمين عن مستويات مرتفعة إلى حد كبير من DENV جسم تحسن الاستجابات التي تسبب ADE DENV في المختبر والمرجح أن ساهمت في تعزيز DENV فيريميا في فيفو1 , 2-جسم تعزيز تعتمد فحوصات أداة قيمة لتقييم قدرة الأجسام المضادة تعزيز الثانوي عدوى الفيروسات ذات الصلة وتقدم أفكاراً قيمة في الآلية المرضية للالتهابات مصفر وتبلغ تطوير اللقاحات.

هنا يستخدم تحليل ووصف رفبس DENV جنبا إلى جنب مع خلايا K562 التي عادة غير مسموح به للإصابة. رفبس يتم النسخ المتماثل هيكلياً سليمة غير كفء DENV الفيروسية جزيئات ترميز ريبليكون بروتين sub-الجينوم فلورية خضراء (التجارة والنقل) التي يتم التعبير عنها بعد جولة واحدة من النسخ المتماثل3. على هذا النحو، الخلايا التي تصاب رفبس فلوريسسي الأخضر ويمكن الكشف سهولة استخدام التدفق الخلوي أو الفحص المجهري. رفبس المستخدمة في هذا التحليل تم الحصول عليها من مصادر تجارية. ومع ذلك، يمكن إنشاء مكافحة الفيروسات الأخرى والمستخدمة في التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة. ومن ناحية أخرى، هي خلايا K562 إلى التعبير عن مستقبلات FcγIII لوكيميا خلية خط ربط منطقة Fc من الأجسام المضادة، ويصاب حضور دون تحييد تركيزات من جسم4،5.

فحوصات ADE قد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات التحقيق في عوامل الخطر للضنك الشديد وتحديد آليات في المختبر ADE6،،من78. والرزن ADE الموصوفة هنا بسرعة وسهولة استخدامها لتحديد قدرة المصل زيادة الإصابة في المختبر باستخدام رفبس والتدفق الخلوي، بالمقارنة مع فحوصات أخرى تستخدم حاليا، التي تتطلب أما البت في تشكيل اللوحة الوحدات (بفو) في الخلايا فيرو أو تلطيخ جسم من إصابة الخلايا6،،من78،9،10،11، كلاهما مضيعة للوقت والعمل مكثفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على عينات مصل الدم تستخدم للتدليل على البروتوكول الموصوفة هنا من macaques الريسوسي التي كانت السياسات الاتحادية ورعايتهم وفقا للدولة المحلية، ومساكن في اقتران للتقييم والاعتماد لرعاية الحيوانات المختبرية الدولية (آآلاك)-المعتمدة مرفق. جميع التجارب على الحيوانات تم استعراضها والموافقة عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية وعينات تم الحصول عليها من خلال أنسجة بروتوكول مشاركة.

1-يوم 1

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات الموضحة أدناه في السلامة الاندفاق الصفحي عقيمة خزانة تستخدم لزراعة الأنسجة في مختبر BSL-2.

  1. ذوبان الجليد عينات المصل في درجة حرارة الغرفة ونقل 100 ميليلتر من كل عينة مصل الدم إلى أنبوب عقيمة. إلغاء تنشيط الحرارة لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية في حمام مائي أو ثيرموميكسير قابل لضبط درجة حرارة. جعل تخفيف المسلسل إذ تتراوح بين 1:1 1:1,000 الباردة ربمي-10 (ربمي مع 10% مصل بقرى الجنين) باستخدام عينة المصل.
  2. نقل 10 ميكروليتر من عينة المصل المخفف متسلسل لكل بئر من صفيحة الخامس-أسفل 96-جيدا العقيمة. وتشمل مجموعتين من مراقبة الآبار، ربمي-10 مع رفبس فقط ودون عينة المصل، وربمي-10 فقط بدون رفبس ودون عينة المصل. قم بإعداد كل عينة المصل وضوابط ربمي-10 في تريبليكاتيس.
  3. إزالة الضنك-1، رفبس 2 و 3 و 4 من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية. نقل رفبس المذابة فورا الجليد. الحصول على رفبس ميليلتر 170 تقريبا لكل عينة المصل (10 ميليلتر من الآبار رفبس x 3 لكل تخفيف المصل (1:1، 01:10، 1: 100، 1:1، 000) و 10 ميليلتر من الآبار رفبس x 3 لكل ربمي-10 مع RVP فقط التحكم في الآبار).
  4. "الماصة؛" 10 ميليلتر من رفبس إلى كل من 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة تتضمن عينة المصل وإلى ربمي-10 مع رفبس (لا مصل) مراقبة الآبار. لا تقم بإضافة رفبس إلى ربمي-10 فقط (لا عينة المصل ولا RVP) الآبار. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 – 10 مرات. إضافة 10 ميليلتر الباردة ربمي-10 بدلاً من رفبس لكل 10-ربمي الباردة فقط (لا عينة المصل ولا RVP) التحكم في الآبار.
  5. نقل 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة إلى حاضنة واحتضان اللوحة ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2. بينما هو حضانة الخامس-أسفل لوحة 96-كذلك، تنظيف السطح للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% وتشغيل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 دقيقة.
  6. إزالة قارورة T75 المتلاقية تماما من الخلايا K562 من الحاضنة وخلط الخلايا أيضا استخدام بيبيت عقيمة 5 مل ونقل 5 مل خلايا إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل.
    ملاحظة: الاحتفاظ في ربمي-10 خلايا K562 وسوبكولتوريد في/mL61 x 10.
  7. حساب عدد الخلايا عن طريق إزالة 10 ميليلتر الخلايا من أنبوب مخروطي العقيمة 15 مل وتخلط مع 10 ميليلتر تريفان الأزرق. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في الأنبوب المخروطية 15 مل.
  8. الطرد المركزي 15 مل المخروطية مع الخلايا في ز x ~ 1,200 لمدة 10 دقائق، وصب المادة طافية، وريسوسبيند الخلايا في 10 ربمي الحارة بتركيز 80,000 الخلايا/30 ميليلتر من وسائل الإعلام (2.66 × 106 خلايا/mL).
  9. إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة من الحاضنة (الخطوة 1، 6) ونقل 30 ميليلتر من الخلايا K562 لكل بئر من 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 – 10 مرات. نقل 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة إلى حاضنة واحتضان اللوحة عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2.
  10. بعد حضانة ح 1، إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة من حاضنات وأجهزة الطرد المركزي في ز x ~ 1,200 لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي، صب وسائط الإعلام من الآبار عن طريق تحويل اللوحة رأسا إلى حاوية تحتوي على التبييض 10%.
  11. غسل الخلايا في كل بئر من خلال ريسوسبيندينج لهم في 125 ميليلتر من 10 ربمي الحارة ومزيج دقيق مع ماصة الطرد المركزي اللوحة في x ~ 1,200 ز 5 دقيقة صب وسائط الإعلام عن طريق تحويل اللوحة رأسا إلى حاوية تحتوي على التبييض 10%. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين.
  12. بعد الغسيل، إضافة 100 ميليلتر الحار ربمي-10 لكل مزيج جيدا، صعودا وهبوطاً مع بيبيت، واحتضان لوحة ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2.

2-يوم 3

  1. إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة تحتوي على 100 ميليلتر من الخلايا ووسائل الإعلام/جيدا من الحاضنة ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. استخدام الأقنية ماصة، مزيج محتويات كل جيدا ونقل الخلايا ووسائل الإعلام إلى 96 جيدا U-أسفل لوحة أو إلى المسمى قبل 5 مل أنابيب البولي بروبلين.
  2. أشطف كل بئر في الخامس-أسفل لوحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر من 1% بارافورمالدهيد (PFA) في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ونقل إلى الآبار كل منهما في 96 جيدا U-أسفل لوحة أو أنابيب البولي بروبلين المسمى 5 مل من الخطوة 2.1 الاستسلام نهائي تركيز من 0.5% PFA/بئر أو أنبوب. مزيج دقيق باستخدام ماصة الأقنية تغطية اللوحة مع رقائق الألومنيوم والسماح لها الجلوس في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إصلاح الخلايا.
  3. إعداد cytometer تدفق (انظر الجدول للمواد على سبيل المثال) عن طريق تشغيل أونستاينيد K562 الخلايا في معايرة الجانب ومبعثر إلى الأمام جنبا إلى جنب مع الإعدادات الأسفار. قناة fluorescence الوحيد المطلوب هو FL1، كالتجارة والنقل من الأسفار فقط المنبعثة من الخلايا. اكتساب ~ 30، 000 – 50,000 الخلايا من كل عينة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي تدفق سيتوميتير قادر على قراءة صف واحد للحصول على البيانات، والخلايا المصابة مع رفبس فقط سوف تنبعث منها الفلورية الخضراء بسبب وجود بروتينات فلورية خضراء، وهناك حاجة إلى لا قناة أخرى من الأسفار.

3-بيانات التحليل

  1. تحليل البيانات التي يحصل عليها من شأن cytometer التدفق باستخدام أي برنامج تحليل التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد).
    1. مجموعة البوابة الأولى استناداً إلى منتدى التعاون الأمني-أ (الأمام مبعثر – منطقة) مقابل منتدى التعاون الأمني-ح (المبعثر إلى الأمام – الارتفاع) تضمين الخلايا المفردة واستبعاد السيارات-فلوري doublets من تحليل12. ثم، بوابة الخلايا عن طريق بوابة القميص استناداً إلى التعاون بين بلدان الجنوب-أ (الجانب مبعثر – منطقة) مقابل منتدى التعاون الأمني-أ لاستبعاد أي حطام أوتوفلوريسسينت.
    2. تحليل SSC-أ مقابل منتدى التعاون الأمني ببوابات الخلايا للتعبير عن التجارة والنقل استناداً إلى مقابل SSC-أ بروتينات فلورية خضراء-ألف. تحديد النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا لتمييع كل من عينات المصل والتحكم بوضع بوابة حول التجارة والنقل + الخلايا.
  2. تحديد متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + خلايا لكل تمييع عينة المصل ومراقبة الآبار بقسمة إجمالي النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ثلاث آبار 3.
  3. حساب إضعاف-تعزيز الإصابة بقسمة متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في عينات مصلية لتمييع كل مقسوماً على متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ربمي-10 مع رفبس (لا عينة المصل) مراقبة الآبار.
  4. الرسم البياني إضعاف-تعزيز المحور (ص) مقابل إضعاف المحور (س)، وإجراء تحليل إحصائي استخدام ANOVA تليها اختبار توكي وظيفة مخصصة لمقارنات متعددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمصال من 4 الريسوسي macaques تم جمعها 16 أسبوعا بعد الإصابة مع زيكف، واختبار لقدرتها على تعزيز DENV-1، 2 و 3 و 4 من العدوى في الخلايا K562. وكان الحيوانات ذروة فيريميا ~ 1 × 105 نسخ الحمض النووي الريبي زيكف/مل من البلازما يوم 3 بعد الإصابة التي انخفضت إلى المستويات التي كانت فيها الحد الأدنى للكشف قبل 7 أيام بعد الإصابة. تم الكشف عن لا فريميا في البلازما في 16 أسبوعا بعد الإصابة. ثم أجرى الفحص RVP وتم تحليل البيانات التي تم جمعها، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فلافيفيروسيس مثل DENV وزيكف حصة أدلة هامة على التماثل في كلا البروتينات الهيكلية وغير الهيكلية على توليد الأجسام المضادة التي كروسريكت13،14مع بعضها البعض. أظهرت هذه الردود جسم تحسن لتعزيز الإصابة في المختبر مع النمط المصلي المسيطر مغايرة أو أخرى سواء في فيفو المتصلة فلافيفيروسيس1،2. إمكانية عبر زيادة الإصابة بآثار هامة لإدارة المرض، وأيضا لتطوير اللقاحات.

فحوص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد المشروع وصف الأموال من جامعة "العلوم الصحية" خدمات أونيفورميد لجيم. آراء أو التأكيدات الواردة في هذا التقرير هي تلك الخاصة المؤلفين ولا أن يكون تفسيرها كما الرسمية أو التي تعكس آراء وزارة الدفاع، وجامعة "العلوم الصحية" خدمات أونيفورميد أو أي وكالة أخرى تابعة للولايات المتحدة الحكومة.

وجف إجراء جميع التجارب، وتحليل البيانات؛ ججم صممت وأشرفت الدراسة؛ وكتب وجو وجيم الورق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا DENV 1-4 RVPالجزيئيةالمتكاملة RVP-501
K562ATCCCCL-243
RPMICorning10-040-CV
FBSGE lifesceincesSH 30910.0310٪ FBS في RPMI-10
Penicillin-StreptomycinMP الطب الحيوي1670049100 وحدة دولية قلم / مل ، 100 ميكروغرام Strepe / مل في RPMI-10
HEPESCellegro25-060-Cl0.025M في
محلول الأحماض الأمينية غير الضروري RPMI-10 MEM (100 مرة;)SigmaM71451x في RPMI-10
Sodium PyruvateCellegro25-000-Cl1mM in RPMI-10
L-glutamineFisher ScientificMT25005CI 
ألواح معقمة على شكل حرف Vتوماس سيانتيفيك333-8001-01V
BD فالكون بولي بروبيلين 5 مل أنابيب FACS VWR60819-728
ألواح غير معقمة على شكل حرف UFalconRef 353910بديل عالي الإنتاجية لأنابيب FACS
5 مل ، ماصة معقمة ومصليةDenvilleP7127
200uL أطرافماصة معقمةDenvilleP3020 CPS
20uL أطراف ماصة معقمةDenvilleP1121
50-200uL ماصة متعددة القنواتDenvilleP3975-8-B
5-50uL ماصة متعددة القنواتDenvilleP3975-9-B
20٪ فورماديهايدTousimis #1008B
حمام مائيThermoFisherTSCOL35
thermomixerEppendorf2231000387بديل للحمام المائي لتعطيل الحرارة
حاضنة CO2ThermoFisher13-998-213
الإيثانولSigma AldrichE7023
التبييض السائلفيشر ScientificNC9724348
Flowjo 9.8TreeStar، Inc.برنامج تحليل قياس التدفق
الخلوي BD FACSDiva 6.1.2Becton Dikinson
BD LSR II مقياس التدفق الخلويBecton Dikinson
Liquid BleachFisherScientific NC9724348

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252(2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

K562 GFP

مقالات ذات صلة