يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

11.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57376

⸱

أبريل 7, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويرد في هذه الورقة، طريقة لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس بيرميبيليزيد من المورفولوجية. هذا الأسلوب يتطلب مقداراً قليلاً من الأنسجة مقارنة بتقنية عزل المتقدرية الكلاسيكية وما تحقق من النتائج ذات صلة أكثر فسيولوجيا.

الملخص

ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، يمثل نموذجا ناشئة لدراسة الأيض. في الواقع، المورفولوجية لها هياكل مثلى للأعضاء البشرية وامتلاك الأيضية العالية المصانة ولها عمر قصير نسبيا يسمح دراسة مختلف الآليات الأساسية في فترة قصيرة من الزمن. بيد أنه من المستغرب أن إحدى الآليات الأساسية الأيض الخلوية، التنفس المتقدرية، قد لم يتم دقة التحقيق في هذا النموذج. فمن المحتمل لأنه عادة ما يتطلب قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية عدد كبير جداً من الأفراد والنتائج التي تم الحصول عليها لا استنساخه بدرجة عالية. هنا، يتم وصف أسلوب يسمح للقياس الدقيق لاستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا باستخدام كميات ضئيلة من نسيج المورفولوجية. في هذا الأسلوب، تشريح ثوراكسيس وبيرميبيليزيد على حد سواء مع الملقط حادة ميكانيكيا وكيميائيا صابونين، السماح لمركبات مختلفة عبر غشاء الخلية وتعدل التنفس المتقدرية. بعد بيرميبيليزيشن، يتم وضع بروتوكول لتقييم قدرة المجمعات المختلفة لنظام نقل الإلكترون (ETS) لأكسدة ركائز مختلفة، فضلا عن استجابتها أونكوبلير ومثبطات عديدة. ويعرض هذا الأسلوب العديد من المزايا مقارنة بأساليب استخدام العزلة المتقدرية، كما أنها ذات الصلة أكثر فسيولوجيا لأن الميتوكوندريا لا تزال تتفاعل مع المكونات الخلوية الأخرى وهو يحافظ مورفولوجية المتقدرية. وعلاوة على ذلك، نموذج الأعمال التحضيرية أسرع، والنتائج المتحصل عليها يتم استنساخه بدرجة عالية. عن طريق الجمع بين مزايا المورفولوجية كنموذج لدراسة الأيض مع تقييم التنفس المتقدرية، المهم رؤى جديدة يمكن كشف النقاب عنها، خاصة الذباب تشهد فيه مختلف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية شروط.

المقدمة

ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قد استخدمت ككائن نموذج للبحوث الوراثية لعلى مدى قرن1. دراسة هذا الكائن لم يؤد فقط إلى المعرفة الأساسية الهامة حول الميراث المرتبطة2والطفرات معدل3، تطوير الجهاز العصبي و تحديد مصير الخلية4، لكنه برز أيضا في الآونة الأخيرة أداة قيمة لدراسة الآليات الكامنة للعديد من الأمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون5،6. وعلاوة على ذلك، نموذج شعبية لدراسة عملية الشيخوخة، كما أنها يمكن أن تثار في عدد كبير خلال فترة قصيرة من الزمن ولها عمر قصير. كما أنها تمتلك هياكل مثلى للأعضاء البشرية، مثل قلب، oenocytes (مثل تتمثل الخلايا)، وهيئات الدهون (أداء المثل الأنسجة الدهنية البيضاء والكبد)، الأنسولين المنتجة للخلايا (ما يعادل الخلايا β البنكرياس)، فضلا عن هيموليمف نقل نواتج الأيض (يناظر دم الفقاريات)7. وعلاوة على ذلك، وسط مسارات الأيض الوسيطة (بما في ذلك مسار الإشارات الشبيهة بالانسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو ومسارات الهدف ربمسن-تور) هي أيضا عالية حفظت7. لهذه الأسباب، استغلوا مؤخرا المورفولوجية لوصف الآليات الأساسية التي تتحكم في التمثيل الغذائي، خاصة في الحالات المرضية الملازمة للبشرية من الأمراض الأيضية مثل مرض السكري8. هو مكون رئيسي من الأيض ميتوكندريا يدمج مسارات متعددة ويقوم بواحدة من أهم وظائف بيولوجية للحياة، إنتاج ATP، عبر عملية الفسفرة (أوكسفوس). نظراً لدورها المركزي في عملية التمثيل الغذائي للكائن، فمن غير المستغرب أن خلل mitochondrial يشاركون في العديد من الأمراض مثل باركنسون9 والزهايمر من الأمراض10، وكذلك في التصلب العضلي الجانبي 11 , 12-وهم أيضا المحددات الأساسية لعملية الشيخوخة. في الواقع، فهي المنتجة الرئيسية للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الخلية، والتي يمكن أن تكون ضارة للخلية عند تركيزات عالية من خلال الأضرار الأكسدة11. كما ارتبطت الشيخوخة إلى تراكم الحمض النووي mitochondrial التالفة أو تحور13، ميتوفاجي الاختلالات14،15 ، فضلا عن إعاقة نشوء حيوي المتقدرية16. الميتوكوندريا هي أيضا المحددات الرئيسية للتوازن للخلية كما يمكن الاستفادة من ركائز مختلفة لضبط العديد من الوظائف الخلوية حسب وفرة أو ندرة المغذيات الكبيرة17،18.

في الواقع، المواد الغذائية المختلفة في الوجبة الغذائية (الكربوهيدرات والدهون والبروتينات) هي هضمها واستيعابها وتنقل في الخلايا. أنهم ثم تتحول في سيتوسول، وينقلون ركائز المشتقة في مصفوفة الميتوكوندريا حيث تنتج مكافئات الحد، مثل NADH والقوات المسلحة الهايتية219. ثم تتأكسد هذه المكافئات مما يقلل من مختلف مجمعات الانزيمية منظومة نقل الإلكترون (ETS). يتم تضمين هذه المجمعات في الغشاء الداخلي المتقدرية، مثل مجمع الأول و "الثاني المعقدة". بالإضافة إلى ذلك، تمثل المجمعات الانزيمية الأخرى مثل نازعة والغليسيرول-3-الفوسفات mitochondrial ونازعه برولين طرق بديلة لدخول الإلكترونات في20،ETS21. هذه المجمعات 'بديل' تتسم بأهمية خاصة في الحشرات، وفقا للأنواع، وأنهم يمكن أن تشارك بنشاط زيادة التنفس20،،من2223،21. يتم نقل الإلكترونات من هذه الاختبارات تغذية النظم إلى أوبيكوينوني وفي وقت لاحق إلى "الثالث معقدة"، ثم إلى "الرابع المعقدة"، حتى يقبلون النهائي، الأوكسجين الجزيئي. نقل الإلكترون هذا يولد قوة دافع بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية القيادة الفسفرة ADP إلى ATP في "مجمع الخامس" (الشكل 1). نظراً للدور المركزي الميتوكوندريا في التوازن للخلية، دراسة الأيض المتقدرية يمثل melanogaster دال- نموذج ذات الصلة باستخدام أداة قوية لتحديد الآليات الكامنة وراء مختلف الفيزيولوجية المرضية الظروف أو تحت تؤكد الخلوية والبيئية. المثير للدهشة ومع ذلك، سوى عدد قليل من الدراسات فعلا قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية24،،من2526. وفي الواقع، تتطلب تجارب تهدف إلى تقييم استهلاك الأوكسجين المتقدرية عزلة الميتوكوندريا. على الرغم من فائدة لقياس وظائف المتقدرية مختلفة (مثل إنتاج روس أو نسبة P/O كعلامة لكفاءة الميتوكوندريا،من2728)، هذه العزلة عموما تتطلب كميات كبيرة بدلاً من ذلك الأنسجة من عدة أفراد24،29. هذا الشرط لكميات عالية من الأنسجة والأفراد عامل هام يحد، خاصة بالنظر إلى أن جميع الأفراد نفس السن، ويفضل أن تكون من نفس الجنس للتجارب، مما يجعل قياس التنفس في وقت مختلف يشير شاقة في أحسن الأحوال. وعلاوة على ذلك، بينما يمكن أن توفر العزلة المتقدرية كبير من التبصر في الآليات الأساسية التي تنظم الأيض المتقدرية، الأساليب المستخدمة لعزل الميتوكوندريا والعديد من العوائق مثل صعوبة الحصول على نتائج قابلة للتكرار ، تعطل شبكة الميتوكوندريا، وتحوير المتقدرية هيكل ووظيفة29،،من3031.

الهدف من هذه الدراسة تقديم بروتوكول قوية لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية استخدام كمية ضئيلة فقط من الأنسجة من عدد قليل جداً من الأفراد. يتألف هذا البروتوكول من قياس الأوكسجين المتقدرية الاستهلاك في الموقع باستخدام ألياف العضلات بيرميبيليزيد29 من ثوراكسيس المورفولوجية في تركيبة مع ريسبيروميتري عالية الدقة32،33، 34 , 35-هذا الأسلوب له أيضا مزايا إضافية مقارنة بطريقة العزل المتقدرية الكلاسيكية نظراً للتفاعل مع العناصر الأخرى للخلية كما جيدا كما المتقدرية هيكل ووظيفة يتم الاحتفاظ أكثر في بيرميبيليزيد ألياف29،،من3136، مما يجعل هذا النهج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. مع أحكام هذا البروتوكول، وظائف الميتوكوندريا يمكن دقة تقييم استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس ثلاثة فقط من المورفولوجية، مع ركائز يسمح تحديد استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة من ETS. ولذلك، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الإجابة على أسئلة رئيسية حول الآليات الأساسية التي تتحكم في عملية التمثيل الغذائي في سياق العديد من الظروف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية بالاستفادة من نموذج المورفولوجية.

لقياس استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة ETS وتقييم ركائز مختلفة كيف تسهم التنفس، وركائز مختلفة (الشكل 1)، أونكوبلير، ومثبطات هي تستخدم30 بعد بيرميبيليزيشن من الأنسجة. على وجه التحديد، يتم إجراء إضافات متتالية من ركائز مختلفة لتحفيز دخول الإلكترونات عن طريق مجمعات مختلفة من ETS. أونكوبلير، السيانيد الكربونيل 4--(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، ثم يضاف بتركيز الأمثل لقياس التنفس غير مقترنة، أي حفز التنفس غير فوسفوريلاتينج لاستهلاك الأوكسجين القصوى. متسلسلة من الموانع من مجمعات ثم تتم الأول، والثاني، والثالث لمراقبة استهلاك الأكسجين المتبقي الذي سبب تفاعلات أكسدة غير ETS. أخيرا، يمكن تقييم القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة بحقن N, N, N '، N، p-ميثيل--فينيلينيدياميني (تمبد)، موفر إلكترون مصطنعة، واسكوربات. من المهم أن نلاحظ أن هذه التجارب تجري في 24 درجةمئوية حيث أنها درجة الحرارة التي تربى الذباب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد الحلول التالية للتشريح و permeabilization للأنسجة.
    1. يعد الحفاظ على الحل: 2.77 الكعكة2اجتا، 7.23 م ك2اجتا، مم 5.77 ATP، مم 6.56 مجكل2، التاورين، 20 مم 15 مم phosphocreatine2غ، غ2ايميدازول 20 مم، ديثيوثريتول 0.5 مم، و 50 ملم كمس، الأس الهيدروجيني 7.1 (يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية).
    2. إعداد حل صابونين: 5 ملغ صابونين في 1 مل من محلول الحفاظ عليها (إعداد يومية جديدة).
  2. إعداد الحلول التالية لقياس التنفس.
    1. إعداد متوسطة تنفس: 120 ملم بوكل، 5 مم خ2ص4، 3 مم حبيس، 1 مم عطا، مجكل 1 مم2، وجيش صرب البوسنة 0.2% (w/v)، الرقم الهيدروجيني 7.2.
    2. تعد ركائز، أونكوبلير، ومثبطات. حل جميع ركائز في ح2س، وحل أونكوبلير فككب فضلا عن مثبطات في الإيثانول المطلق (باستثناء مالوناتي الذي يتم تخفيفه في ح2س). تحييد معظم ركائز، فضلا عن مالوناتي (انظر الجدول للمواد). جميع التركيزات الواردة في البروتوكول تركيزات نهائية داخل الدوائر 2 مل.

2-إعداد ومعايرة ريسبيروميتير عالية الدقة.

  1. أغسل الدوائر، والقبعات، وسدادات من ريسبيروميتير ثلاث مرات مع الإيثانول 70% وثلاث مرات بماء مقطر.
  2. معايرة في تركيز الأكسجين صفر: بيبيت 2.3 مل متوسطة التنفس في الدوائر وإضافة 10 مغ من الصوديوم ديثيونيتي. على الرغم من أن حجم الدائرة القصوى 2 مل، تتم إضافة مل 2.3 لضمان أن يبقى لا فقاعة هواء تحت السدادة عند إغلاق الدوائر. إغلاق الدوائر مع السدادات وقياس تركيز الأكسجين عن 10-20 دقيقة معايرة أقطاب صفر تركيز الأكسجين بمعدل استهلاك الأوكسجين الناتج عن ذلك.
  3. تغسل الدوائر مع الماء ديستيلاتيد واحتضان في الإيثانول المطلقة لمدة 10 دقائق ثم شطف بالماء المقطر.
  4. معايرة في تشبع الهواء: بيبيت 2.3 مل متوسطة التنفس في الدوائر، وإدراج السدادات ونضح المتوسطة الزائدة على رأس السدادات وثم رفع السدادات مع فاصل. هو بيبيتيد المتوسطة التنفس الزائد في الدوائر (حجم إجمالي 2 مل) لتجنب وجود فقاعات الهواء بعد إغلاق الدوائر.
  5. مراقبة استهلاك الأكسجين لمدة 45 دقيقة إلى ساعة، حتى يتم تركيز الأكسجين (تتبع الأزرق) مستقرة حوالي 250 نيوتن متر عند 24 درجة مئوية.

3-تشريح الذباب و Permeabilization للأنسجة

  1. تأكد من أن يتم تنفيذ كافة الخطوات في الجليد.
  2. تخدير ستة الذباب الذكور من نفس السلالة، ونفس العمر والتي أثيرت بشأن النظام الغذائي نفسه على الجليد لتسهيل تشريح الذباب (البرية من نوع w1118، 15 يوما من العمر، يغذيها متوسطة دقيق الذرة).
  3. باستخدام مشرط وملقط الجميلة ذات الرؤوس، تشريح الذباب (إزالة رؤساء والبطن) الإبقاء فقط ثوراكسيس التي تحتوي على عضلات الطيران. يمكن إجراء هذه الخطوة بالعين المجردة. التعامل مع ثوراكسيس الناتجة بالملقط مقلوب الجميلة.
  4. نقل ثلاثة ثوراكسيس تشريح في 25 مم طبق بتري يحتوي على 2 مل من محلول الحفاظ على الجليد باستخدام الملقط.
  5. مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس، ميكانيكيا بيرميبيليزي ثوراكسيس عن طريق إدراج تلميح الملقط إلى ثوراكسيس ومرارا وتكرارا تمزق الأنسجة للحصول على شبكة فضفاضة متصلة.
  6. في صفيحة 24-حسنا، ملء بئرين مع ميليلتر 12.5 الحل صابونين و 1 مل من محلول الحفاظ على الحصول على تركيز نهائية 62.5 ميكروغرام/مل من صابونين. سد الآبار المجاورة اثنين مع 1 مل متوسطة التنفس.
  7. مع الملقط الجميلة ذات الرؤوس، نقل ثلاثة ثوراكسيس بيرميبيليزيد في المحلول المخفف صابونين واحتضان مع الانفعالات خفيفة على شاكر مداري، على الجليد، لمدة 20 دقيقة.
  8. وبعد تفريخ هذه الأخيرة، نقل الألياف في الآبار المجاورة مليئة المتوسطة التنفس مع الانفعالات معتدل، على الجليد، لمدة 5 دقائق شطف صابونين.

4-تحديد الوزن الجاف

  1. جاف ثوراكسيس بيرميبيليزيد على سطح الامتصاص والوجه 3-4 مرات استخدام الملقط مقلوب غرامة للتأكد من إزالة كل الرطوبة.
  2. وزن ثوراكسيس الثلاثة معا في ميكروبالانسي. ملاحظة الوزن التي يتم الحصول عليها كما سيتم استخدامه لتطبيع معدلات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا.
  3. نقل الأنسجة مباشرة في انخفاض متوسط التنفس على الجليد.

5-تحديد معدلات الاستهلاك الأكسجين

  1. فتح دوائر ريسبيروميتير (إزالة السدادات) وإضافة 10 مم من بيروفات و 2 مم من مالات في كل دائرة.
  2. إضافة أنسجة بيرميبيليزيد مباشرة في الدوائر مليئة بالمتوسط التنفس.
  3. استبدال سدادات تستخدم فاصل.
  4. مع حقنه 60 مل، جمع الأكسجين مباشرة من دبابة الأوكسجين وحقن 2-5 مل أكسجين من خلال شعري سداده لكل دائرة للتأكد من نشر الأوكسجين من خلال الأنسجة لن يحد من استهلاك الأوكسجين.
  5. إدراج المحاقن هاملتون في شعري من كل سداده للتأكد من ثوراكسيس البقاء في الدائرة.
  6. إغلاق الدوائر تماما عندما يكون تركيز الأكسجين حوالي 400 نانومتر، تحقيق مستويات الأوكسجين أعلاه تشبع الهواء (حوالي 160% هواء التشبع) داخل الدوائر.
  7. إيقاف وإعادة تشغيل النمامون للتحقق من وجود فقاعات الهواء في الدوائر.
  8. إدخال كتلة الأنسجة وزنه مسبقاً لتطبيع معدلات التنفس بكتلة من الأنسجة (ملغ)، عرض استهلاك الأوكسجين الخاصة بالكتلة (بمول س2 consumed.s-1.mg-1 من الأنسجة).
  9. مرة واحدة واستقرت استهلاك الأكسجين (تتبع الحمراء)، إضافة 5 مم ADP مع حقنه هاملتون.
  10. بعد كل حقن، الشطف الحقن بالماء المقطر، الإيثانول 70%، والماء المقطر مرة أخرى.
  11. بمجرد أن استهلاك الأكسجين مستقر مرة أخرى، حقن 5 ميليلتر من 4 مم ج الفسفرة.
  12. للانتقال إلى حقن متسلسلة من ركائز التالية لتقييم استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا في خطوات مختلفة ETS:
    1. إضافة 5 ميليلتر من برولين م 2.
    2. إضافة 10 ميليلتر من سوكسيناتي م 1.
    3. إضافة 30 ميليلتر من 1 م الجلسرين-3-الفوسفات.
  13. حقن أونكوبلير فككب بطريقة معايرة بخطوات 0.5-1 ميكرومتر (2 ميليلتر من حل 1 مم) حتى تركيز الأمثل الذي تم التوصل إليه، أي التركيز على تحقيق أعلى معدل استهلاك الأكسجين ممكن دون تثبيط (تنبيه: انظر الجدول المواد).
  14. حقن مثبطات التالي تسلسلياً تماما تحول دون تدفق الإلكترونات في ETS بغية قياس استهلاك الأوكسجين المتبقية (روكس) أي ردود غير الجهاز التنفسي مثل ردود الفعل أوكسيجيناسي بين أمور أخرى:
    1. أضف 1 ميليلتر من والروتينون 1 مم (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
    2. إضافة 5 ميليلتر من مالوناتي م 2 (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
    3. أضف 1 ميليلتر من أنتيميسين 5 مم أ (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
  15. إضافة اسكوربات 0.2 مم و 0.5 مم تمبد تسلسلياً في الدوائر، بدءاً من اسكوربات لقياس استهلاك الأوكسجين الرابع المعقدة.
  16. إضافة 20 مم أزيد الصوديوم تمنع رابعا المعقدة (تنبيه: انظر الجدول للمواد).
  17. مجرد الإشارة مستقرة، فتح الدوائر مع فاصل وإعادة الأوكسجين الدوائر عن طريق حقن 2 مل أكسجين النقي وإغلاق الدوائر عندما يكون التركيز حول 250-300 nmol.mL-1.
  18. قياس الإشارات لمدة 10-15 دقيقة وحساب الخلفية الكيميائية، أي استهلاك الأكسجين بسبب أوتوكسيداتيون تمبد.

6-تنظيف ريسبيروميتير

  1. بعد القياسات، شطف الدوائر مع الماء المقطر مرة واحدة وشطف الدوائر ثلاث مرات في الإيثانول 70%.
  2. احتضان في الإيثانول المطلقة لمدة 10 دقيقة لإلغاء تنشيط الموانع.
  3. شطف ثلاث مرات بماء مقطر وملء الدوائر مع الإيثانول 70% واستبدالها السدادات والقبعات حتى الاستخدام التالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تتبع ممثل من استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا استخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه يرد في الشكل 2. بيروفات ومآلات حقن في الدوائر جنبا إلى جنب مع ألياف العضلات بيرميبيليزيد ويشار إلى تنفس CI-تسرب، أيعند المجمع الأول من ETS هي تحفزها NADH إنتاج عن طريق أكسدة بيروفات ومآلات عبر دورة حمض تريكاربوكسيليك (CI). أثناء هذا معدل التنفس، والحفاظ على الأكسجين الميتوكوندريا أساسا للتعويض عن تسرب بروتون، أيالبروتونات عبور من الفضاء intermembrane إلى المصفوفة الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويرد في هذه الدراسة، طريقة لإعداد نموذج قبل قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على المشاكل المختلفة المتعلقة بالبروتوكولات المتقدرية العزلة، لا سيما من حيث المدة وعدد الأفراد المطلوب باستخدام. بدلاً من العمل مع العزلة المتقدرية عادة ما تتطلب كمية كبيرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من عدد من الأفراد، يتم إجراء هذه التجربة على ألياف العضلات بيرميبيليزيد من ثوراكسيس المورفولوجية القليلة. في هذا البروتوكول، يلزم سوى ثلاثة أشخاص لعرض النتائج المثلى. ولذلك، الممكن قياس استهلاك الأو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من العلوم الوطنية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة، منحة الاكتشاف) وجامعة دو مونكتون أن أرستها. لهب يود أن ينوه دعم تمويلي من المعهد الكندي للبحوث الصحية (استوفوا)، ومؤسسة الابتكار نيو برونزويك (نبيف)، وجامعة دو مونكتون. أعمال EHC معتمد من قبل جمعية الزهايمر لكندا، كندا الدماغ، مقدمة، والمؤسسة الكندية لسرطان الثدي، ومؤسسة الابتكار في نيو برونزويك، مؤسسة البحوث الصحية في نيو برونزويك وجامعة دو مونكتون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقياس التنفس عالي الدقة Oxygraph O2KOroboros Instruments, إنسبروك, النمسا10022-02Startup O2K respirometer kit
 
O2K-المعايرة بالتحليل الحجمي Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03محاقن هاميلتون بأحجام مختلفة
 
برنامج DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software for Data Collection
 
ملقط مضاد للمغناطيسية ذو رؤوس دقيقةVWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG ، Goettingen ، ألمانيارصيد شبه متناهي الصغر (توزع من قبل العديد من الشركات)  
 
ذبابة الفاكهة السوداء < م > من النوع البري w1118< / sup>مخزون بلومنجتون ذبابة الفاكهة ، في ، الولايات المتحدة الأمريكيةbr / > حالة التخزين: 24 درجة ؛ ج
الإيثيلين جلايكول بيس (2-أمينوإيثيل إيثر) -< م > ن < م > ، < م > ن < م > ، < م > ن < / م > بريم ؛ < م > ن < / إم > برايم ؛ حمض رباعي الأسيتيكسيجما ألدريتشE4378EGTA
حالة التخزين: RT
KOHسيجما ألدريتشP1767الحذر: تآكل المعادن ، سمية حادة ، تآكل الجلد ، تلف خطير في العين ، سمية مائية حادة.
حالة التخزين: RT
CaCO3< / sub>Sigma-AldrichC4830
حالة التخزين: RT
Na 2< / sub>ATPSigma-AldrichA2383
حالة التخزين: -20 درجة ؛ C
MgCl2.6H2OSigma-AldrichM9272
حالة التخزين: RT
TaurineSigma-AldrichT0625
حالة التخزين: RT
Na2PhosphocreatineSigma-AldrichP7936
حالة التخزين: -20 & deg; C
ImidazoleSigma-AldrichI5513
حالة التخزين: RT
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
حالة التخزين: 2-8 درجة ؛ C
MES هيدراتSigma-AldrichM8250
حالة التخزين: RT
Saponin من لحاء quillajaSigma-AldrichS7900Saponin
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: 5 مجم في 1 مل من محلول الحفظ. تحضير طازجة يوميا.
KClSigma-AldrichP9541
حالة التخزين: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
حالة التخزين: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
حالة التخزين: RT
BSASigma-Aldrich05470
حالة التخزين: 2-8 درجة ؛ C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953ثنائي ثيونيت الصوديوم. تنبيه: مواد ومخاليط ذاتية التسخين ، سمية حادة ، سمية مائية مزمنة حادة.
حالة التخزين: RT
بيروفات الصوديومسيجما-ألدريتشP2256بيروفات
حالة التخزين: 2-8 درجة ؛ تحضير محلول C
: في ماء MilliQ. تحضير طازجة يوميا.
L- (-) - حمض الماليكسيجما ألدريتشM1000Malate
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: في ماء MilliQ. قم بتحييد باستخدام KOH وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
أدينوزين 5'-ثنائي فوسفات أحادي البوتاسيوم ملح هيدراتسيجما-ألدريتشA5285ADP
حالة التخزين: -20 & درجة ؛ تحضير محلول C
: في ماء MilliQ. قم بتحييد باستخدام KOH وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
السيتوكروم ج من قلب الخيولسيجما ألدريتشC7752السيتوكروم ج
حالة التخزين: -20 درجة ؛ تحضير محلول C
: في ماء MilliQ. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
L-ProlineSigma-AldrichP0380Proline
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: في ماء MilliQ. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدة سداسي هيدراتسيجما-ألدريتشS2378سكسينات
حالة التخزين: RT
محلول التحضير: في ماء MilliQ. تحييد باستخدام حمض الهيدروكلوريك وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
sn-Glycerol 3-فوسفات مكرر (cyclohexylammonium) ملحSigma-AldrichG7886Glycerol-3-phosphate
حالة التخزين: -20 درجة ؛ تحضير محلول C
: في ماء MilliQ. قم بتحييد حمض الهيدروكلوريك وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
سيانيد الكربونيل 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازونسيجما ألدريتشC2920FCCP. تنبيه: سمية حادة ، حساسية الجلد ، سمية مائية مزمنة.
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: في الإيثانول المطلق. يحفظ في قوارير زجاجية عند -20 درجة مئوية.
RotenoneSigma-AldrichR8875تنبيه: السمية الحادة ، تهيج الجلد ، تهيج العين ، سمية العضو المستهدف المحدد (نظام التنفس) ، السمية المائية الحادة ، السمية المائية المزمنة.
تحضير المحلول: في الإيثانول المطلق. يحفظ في قوارير داكنة عند -20 درجة مئوية.
حمض مالونيكسيجما ألدريتشM1296مالونات. تنبيه: سمية حادة ، تلف خطير في العين.
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: في ماء MilliQ. تحييد مع KOH. تحضير طازجة يوميا.
Antimycin A من Streptomyces sp< / em>.سيجما ألدريتشA8674Antimycin A. الحذر: السمية الحادة ، السمية المائية الحادة ، السمية المائية المزمنة.
حالة التخزين: -20 درجة ؛ تحضير محلول C
: في الإيثانول المطلق. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
N< / em>,N< / em>,N< / em>′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamineSigma-AldrichT7394TMPD
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: في ماء MilliQ. تخزينها في قوارير داكنة في  -20 درجة مئوية.
(+) - الصوديوم L-ascorbateSigma-AldrichA4034Ascorbate
حالة التخزين: RT
تحضير المحلول: في ماء MilliQ. تخزينها في قوارير داكنة في  -20 درجة مئوية.
NaN3Sigma-AldrichS2002أزيد الصوديوم. تنبيه: السمية الحادة (الفموية والجلدية) ، سمية العضو المستهدف المحدد (الدماغ) ، السمية المائية ، السمية المائية المزمنة.
تحضير المحلول: في ماء MilliQ. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
مركز <

المراجع

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
  3. Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
  4. Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
  5. Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
  6. Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  7. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
  8. Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
  9. Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
  10. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  11. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  12. Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
  13. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
  14. Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
  17. Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
  18. Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
  19. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
  20. McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
  21. Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600(2015).
  22. Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
  23. Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333(2016).
  24. Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
  25. Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
  26. Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
  27. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  28. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
  29. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  30. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  31. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  32. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
  33. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
  34. Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
  35. Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
  36. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  37. Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
  38. Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  40. McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Drosophila Melanogaster
قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.