مقالة منهجية

مقايسة ميكرواري البروتين "تحديد المصلية" محددة مستضد "الضد الردود التالية" المطثيّة العسيرة الإصابة

DOI:

10.3791/57399

⸱

يونيو 15, 2018

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة طريقة ميكرواري بروتين بسيطة للتنميط خلطيه الاستجابات المناعية للوحة 7-من نوع plex للغاية تنقية المستضدات المطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية. ويمكن تمديد البروتوكول لتحديد استجابات جسم معين في الأعمال التحضيرية الغلوبولين المناعي الوريدي [بولكلونل].

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم عرضاً مفصلاً للمقايسة ميكرواري رواية الفائق البروتين للبت في مكافحة مستويات الأجسام المضادةالمطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية وفي الأعمال التحضيرية منفصلة [بولكلونل] الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg). البروتوكول يصف الخطوات المنهجية المتبعة في إعداد عينة، وطباعة صفائف وإجراء الفحص، وتحليل البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تطوير هذا البروتوكول لتدرج عينات سريرية مختلفة بما في ذلك البلازما والخلايا supernatants ثقافة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام ميكرواري البروتين لتحديد مزيج من ايستب (IgG, IgA, IgM)، فئة فرعية (IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، IgA1، IgA2)، والأجسام المضادة سلالة محددة للغاية تنقية كله جيم السموم A و B (توكسينوتيبي 0، سلالة VPI 10463، ريبوتيبي 087)، السمية ب من جيم ب السم فقط--وإذ يعرب عن سلالة (ككوج 20309)، ونموذج سلائف جزء ب السم ثنائي، بكدتب، ريبوتيبي-الخاصة بالطبقة السطحية أسرة البروتينات (التخاطب؛ 001، 002، 027)، والتحكم بالبروتينات (التيتانوس توكسيد والمبيضات البيض). وخلال التجربة، يتم سبر [ميكروارس] مع الأمصال من الأفراد مع الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) دون الإسهال، ضوابط صحية (المفوض السامي)، جيم العدوى (الهيئة)، ومن قبل الأفراد والعلاج IVIg وظيفة علاج اضطراب نقص المناعة المشترك، مجتمعية وبوليراديكولوباثي دملينتينغ التهاب مزمن. أننا نواجه اختلافات كبيرة في بلغت تحييد السم ومستويات محددة من جسم ايستب متعددة بين مجموعات المرضى، التحضيرات التجارية IVIg، والأمصال قبل ويلي IVIg الإدارة. أيضا، هناك ارتباط كبير بين ميكرواري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) لمستويات مفتش الترياق في عينات مصل الدم. هذه النتائج تشير إلى أن ميكرواري يمكن أن تصبح أداة واعدة للتنميط الردود الأجسام المضادة على المستضدات C.difficile في البشر جرى تطعيمهم أو المصابة. مع مزيد من الصقل مستضد الألواح وتخفيض تكاليف الإنتاج، ونحن نتوقع أن التكنولوجيا ميكرواري قد تساعد في تحسين وتحديد إيمونوثيرابيس أكثر سريرياً مفيدة للعدوى جيم بصورة خاصة بالمريض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول التنمية والمصادقة مقايسة ميكرواري البروتين رواية ومخصصة للكشف عن وشبه الكمي للسلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . نستخدمها بنجاح أعمالنا جيم-مقايسة ميكرواري محددة كأداة جديدة واعدة للتحاليل الطبية التركيبية لمحتوى جسم معين في الأمصال المريض1،2، الأعمال التحضيرية IVIg3، و تحديد خصائص الأجسام المضادة ترتبط بنتائج سيئة في الهيئة4. نظهر كيف يمكن تحليل عينات مصلية بيوبانكيد والتحضيرات التجارية من IVIg على شرائح ميكرواري، والسماح للتنميط استنساخه عالية الجودة للردود الخاصة بمسببات المرض جسم جيم في هذا التحليل.

كثير من الأطفال الأصحاء والبالغين قد أضداد المصل يمكن كشفها IgG و IgA للسموم جيم أ وب5،6. هذه يعتقد أن تنشأ في أعقاب التعرض عابر خلال مرحلة الرضاعة وعقب التعرض جيم في مرحلة البلوغ. لهذا السبب، فقد كان IVIg [بولكلونل] يستخدم خارج التسمية لعلاج المتكررة ومداهم ديمقراطيي7،،من89. ومع ذلك، لها دور حاسم وطريقة العمل لا يزال غير واضح. لقد بينت دراسات عديدة أن استجابة مناعية خلطيه للسموم جيم يلعب دوراً في عرض المرض ونتائجه. على وجه التحديد، تظهر أعراض المرضى بمصل زيادة السمية المضادة "مفتش" تركيز مقارنة بالمرضى الذين يصابون بأعراض مرض10. ذكر ارتباط يمكن إثباته لمتوسط السمية لمكافحة "ألف مفتش" التتر و 30 يوما جميع أسباب وفيات11. كشفت عدة تقارير أيضا عن اقتران مع حماية ضد الردود التكرار والأجسام المضادة للسم أ وب عدة مولدات المضادات غير السمية (Cwp66، Cwp84، FliC، فليد، والبروتينات الطبقة السطحية (SLPs))12،13 , 14 , 15-هذه الملاحظات قد حفزت تطوير أول المناعي السلبي المخدرات تستهدف جيم السم ب (بيزلوتوكسوماب)، الذي أقرته مؤخرا لنا الغذاء والدواء والأدوية الأوروبية الوكالة لمنع التدخلات المتكررة16. استراتيجيات التطعيم باستخدام السموم المعطل أو الشظايا السمية المؤتلف، أيضا قيد التنمية17،،من1819. لا شك في أن تحفز هذه النهج العلاجية الجديدة الحاجة إلى تقييم الاستجابات المناعية خلطيه لمولدات المضادات المتعددة في العينات ذات الأحجام الكبيرة.

واليوم، هناك نقص ملحوظ في المتاحة تجارياً الفائق فحوصات قادرة في نفس الوقت تقييم السلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . وهناك حاجة غير ملباة لتطوير مثل هذه الاختبارات لتيسير جهود البحث في المستقبل والتطبيقات السريرية. [ميكروارس] البروتين هي أسلوب لشل أعدادا كبيرة من البروتينات تنقية منفردة كمجموعة منظمة مكانياً من البقع على سطح المستندة إلى شريحة مجهرية باستخدام نظام روبوتية، التي يمكن أن تكون20 جهة اتصال أو عدم الاتصال طباعة أداة21. وقد تمثل البقع الخلائط المعقدة مثل ليساتيس خلية أو الأجسام المضادة، هوموجيناتيس الأنسجة، والبروتينات الذاتية أو المؤتلف أو الببتيدات، وسوائل الجسم أو المخدرات22،23.

بروتين ميكرواري التكنولوجيا يوفر مزايا متميزة أكثر من أليسا الداخلية القياسية التقنيات التي استخدمت تقليديا لتقييم مكافحة--جيم جسم الردود. وتشمل هذه زيادة قدرة على الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة المتعددة-ايستب-محددة ضد فريق أوسع من أهداف البروتين، وانخفاض حجم الاحتياجات لمولدات المضادات، والعينات، والمواد الكاشفة، وتعزيز قدرة على إدماج أكبر عدد replicates التقنية، بالإضافة إلى مراقبة الجودة الداخلية متعددة (QC) تدابير1. وهي بالتالي أكثر حساسية ودقة واستنساخه [ميكروارس] أكبر مجموعة ديناميكية. وهذه العوامل تجعل [ميكروارس] بديلاً أرخص ويحتمل أن تكون مواتية الساس لكشف البروتينات المعروفة على نطاق واسع. ومع ذلك، يؤدي مساوئ التكنولوجيا ميكرواري أساسا من التكاليف الأولية الكبيرة المرتبطة بإنشاء فريق مستضدات تنقية عالية وإعداد منصة تكنولوجية.

بروتين [ميكروارس] وقد استخدمت على نطاق واسع على مدى العقدين الماضيين كأداة تشخيصية والأساسية لبحث في التطبيقات السريرية. تطبيقات محددة تشمل التعبير البروتين التنميط، ودراسة العلاقات إنزيم الركازة، فحص العلامات البيولوجية، وتحليل التفاعلات بين الميكروبات والمضيف، والتنميط جسم خصوصية23،24، 2526،،،من2728. [ميكروارس البروتين/مستضد العديد من جديد الممرض في] قد أنشئت، بما في ذلك الملاريا (المنجلية)29، وفيروس نقص المناعة البشرية-130،31من الإنفلونزا، مرض الالتهاب الرئوي الحاد (السارس)32، الحمى النزفية الفيروسية33 ، هيربيسفيروسيس34و35من السل.

يتصل هذا البروتوكول بإنشاء سهولة التشغيل جيم. صعب مستضد رد الفعل ميكرواري المقايسة، الذي يمكن القياس الكمي دقيقة ودقيقة ومحددة متعددة-ايستب والردود الخاصة بسلالة جسم إلى جيم صعب مولدات المضادات في الأمصال و IVIg [بولكلونل]. هنا، نحن تشمل الممثل نتائج تتصل أداء الإنزيم ميكرواري مقبولة بالمقارنة مع أليسا، فضلا عن دقة التحليل وإمكانية تكرار نتائج التشكيلات الجانبية. هذا التحليل يمكن زيادة تطويرها للشخصية الأخرى العينات السريرية، ويضع معايير جديدة للبحث في الأساس الجزيئي للهيئة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد لوحة ميكرواري

  1. تمييع المستضدات جيم مع المخزن مؤقت طباعة [برنامج تلفزيوني-توين-تريهالوسي (50 مم)] في تركيز المثلى (التي كانت مسبقاً قبل تشغيل الأمصال المريض): السم (200 ميكروغرام/مل)، والسمية ب (100 ميكروغرام/مل)، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، وتنقية أصلي التخاطب كلها مستمدة من ريبوتيبيس 001 و 002 و 027 (200 ميكروغرام/مل).
    ملاحظة: تم الحصول على السم ب من السم ب-الإعراب عن سلالة ككوج 20309 (90 ميكروغرام/مل).
    1. تضعف الضوابط الإيجابية، ليساتيس المبيضة، والتيتانوس مع المخزن المؤقت الطباعة في 100 ميكروغرام/مل. وأخيراً، يؤدي إلى تمييع الغلوبولين المناعي البشري المنقي مطابقة ايستب جسم اختبار متسلسل، بدءاً من 50 ميكروغرام/مل عبر تخفيف 10 في المخزن المؤقت للطباعة لإنشاء منحنى معايرة.
  2. نقل 10 ميليلتر من تخفيف في المخزن المؤقت للطباعة في لوحة 384-جيدا.
  3. وتغطي اللوحة بختم اللوحة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.

2-طباعة الصفائف مع روبوت الاتصال

  1. الحرارة دبوس السيليكون باستخدام s الموقد الغازي باليد 3 × 2 والشطف في الماء النظيف 3 × 3 s.
  2. ضع لوحة ميكرواري إلى خرطوشة التحميل من أررايير.
  3. ضع الشرائح أمينوسيلاني على درج الشريحة.
    ملاحظة: يمكن لدرج الشريحة استيعاب الشرائح 27: ثلاثة صفوف من تسع شرائح. يتم ترتيب الشرائح في اتجاه عمودي ابتداء من الجانب الأيسر من الصف السفلي وبقية المساحات مغطاة بشرائح فارغة ضمان شمول جميع الثقوب على درج الشريحة.
    1. اضغط موافق والتحقق من أن تم تشغيل فراغ وكافة الشرائح آمنة. اترك الشرائح في البيئة الرطبة من أجل ح 1 على الأقل قبل البدء الطباعة.
      ملاحظة: تقدم الشرائح أمينوسيلاني في حقيبة مختومة مع ديسيككانت. بمجرد فتح، تعاد أي الشرائح غير مستخدمة فورا إلى مجففة لتخزين ما يصل إلى تاريخ انتهاء الصلاحية.
  4. قم بإعداد برنامج الطباعة المناسبة لطباعة المستضدات المطثيّة العسيرة . إطلاق "جناح تطبيق الاتفاقات" وفتح ملف معلمات تشغيل الطباعة المطلوبة من الدليل '"بي Gridding يدير"'. حدد ملف المطثيّة العسيرة لطباعة جميع المستضدات المطثيّة العسيرة في البيلوروسية.
  5. عند النقر المزدوج فوق الرمز ميكرواري على النافذة الرئيسية سوف تظهر نافذة كلفة ثلاثة تسمى 'ميكروارايينج المعلمات'.  علامات التبويب الثلاثة هي "المصدر،" و "الهدف"، و "خيارات". تظهر علامة التبويب "مصدر" تفاصيل العدد العينات المستخدمة في لوحة ميكرواري. علامة التبويب "الهدف" يبين تفاصيل عن الكيفية التي الشرائح يتم تحميلها، حيث الصفيف يجب أن تتم طباعة على الشريحة وتحرير تخطيط الشريحة (تنسيقات صبري 16). علامة التبويب "خيارات" يبين تفاصيل البروتوكول الغسيل وأداة يتم استخدامها على سبيل المثال. يغسل بعد كل عينة المكتملة. تنظيف دبوس السليكون بين عينات لتجنب أي تلوث الصليب بين العينات المختلفة.
  6. خيارات البرمجة الموجودة ضمن خيارات > "تفضيلات تشغيل" شريط أدوات "جناح تطبيق الاتفاقات". توجد علامات تبويب 9 للعمل من خلال هذا المقطع وأنتم نقل علامة تبويب واحدة كاملة إلى المرحلة التالية بالنقر فوقه. النقر فوق الزر "موافق" سوف تتخذ لكم من "تفضيلات التشغيل." في علامة التبويب "عام" في "تفضيلات التشغيل"، هناك عدد من خانات الاختيار المتاحة تحت هذا الباب تتعلق بكيف سوف تتصرف الصك عند بدء تشغيل برنامج. تحقق من خانة "حمام رئيس الوزراء قبل بدء تشغيل"، سيخضع جميع يغسل ثلاث محطات تسلسل فتيلة قصيرة قبل بدء التشغيل. وسوف تغسل الاختيار المربع، "غسل في بدء تشغيل" أداة دبوس قبل زيارة المصدر الأول. حدد المربع "المياه والصرف الصحي في نهاية تشغيل"، سيتم غسلها الأداة pin بعد زيارة المصدر الأخير. يمكن للمستخدم تعيين عدد دورات الغسيل. في علامة التبويب "تفضيلات التشغيل" "المناخ"، ابدأ الترطيب. الإعداد نستخدمها على النحو التالي: تبدأ نسبة 55%، تشغيل نسبة 55%، والحد الأدنى من الرطوبة 55%، الهدف الرطوبة 60%. عدم بدء التشغيل حتى تم التوصل إلى الهدف الرطوبة وخلاف ذلك البقع سيكون حجم خطأ والمكتبة سوف تتبخر سريعاً.
  7. في شريط القائمة من TAS، انقر فوق الزر الذهاب الخضراء.  بدء التشغيل ومراقبة بشكل دوري أرايير أثناء تشغيل الطباعة لتكون معينة في كل شيء على ما يرام.
    ملاحظة: هذا يمكن تحليل العينات 15 في نفس الوقت على كل شريحة كما صبري واحد يستخدم كعنصر سلبي. تصميم سوباريس يتحدد بعدد البروتينات المطبوعة (مولدات المضادات) ويتطابق عدد البيولوجية المطبوعة.
    ملاحظة: بعد طباعة كل عينة، الرأس يتحرك نحو أحواض الغسيل للسماح غمس متعددة من الدبوس في اثنين أغسل الحمامات التي تحتوي على ماء مقطر و 0.002% 20 توين ل 1.5 s في كل حمام، تليها الشطف pin مع المياه النقية فائقة وتجفيف الدبوس في محطة الغسيل الرئيسي ل 4 s.

3-تخزين الصفيف

  1. الاحتفاظ بالشرائح المطبوعة المخزنة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في مجففة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح المطبوعة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

4-صفيف السبر

  1. بعناية بوضع الشرائح المطبوعة في حامل شريحة لتنسيق الدوائر المتعددة جيدا 16.
    ملاحظة: الدوائر، وعلى عمق حوالي 7.5 ملم، وقد توفر سطح سخية لنسبة حجم تيسيرا لخلط وغسل الخطوات.
  2. السماح لجميع الكواشف الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال. ما لم يحدد خلاف ذلك، تنفيذ كافة الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 100 ميليلتر من المصفاة توين ألبومين المصل البقري 5% (BSAT؛ استخدام مرشح حقنه 0.2 ميكرون) كل كتلة، وتغطي الشرائح، واحتضان لهم مع الهز ح 1.
  4. يغسل الشرائح 5 × 1 دقيقة في 120 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة مع 20 توين (ببست؛ 0.1% توين) كل بئر بالهز. لا تدع الشرائح تجف.
  5. ذوبان الجليد عينات المصل في الثلج لمدة 20 دقيقة، وتمييع كل عينة مع مادة جسم متاحة تجارياً مع خلفية الحد المكون (انظر الجدول للمواد).
    1. تحسين تخفيف عينات المصل وفقا الغلوبولين المناعي اختبارها كما هو مبين في الجدول 2.
  6. نقل 100 ميليلتر من عينات المصل المخفف لجميع الكتل باستثناء واحد، والذي سيتم استخدامه كعنصر تحكم سلبية؛ أن هذه الكتلة، إضافة 100 ميليلتر من جسم مادة فقط. احتضان الشرائح مع الانفعالات لطيف ح 1.
  7. تغسل شرائح 5 × 3 دقيقة في 120 ميليلتر من ببست (0.1% توين) كل بئر بالهز.
  8. إضافة 100 ميليلتر من جسم الإنسان لمكافحة بيوتينيلاتيد الماعز المخفف بجسم مادة.
    1. تحسين تخفيف جسم الثانوية حسب الغلوبولين المناعي اختبارها كما هو موضح في الجدول 2. تغطي الشرائح واحتضانها لهم مع الهز لطيف ح 1.
  9. يغسل الشرائح 5 × 3 دقيقة في 120 ميليلتر من ببست كل بئر بالهز.
  10. إضافة 100 ميليلتر من ستريبتافيدين Cy5 لكل كتلة المخفف في 1:2000 في جيش صرب البوسنة 5%. تغطي الشرائح بإحباط لحمايتهم من الضوء في حين تهتز لمدة 15 دقيقة مع الانفعالات لطيف.
  11. تغسل شرائح 5 × 1 دقيقة كل في 120 ميليلتر من ببست كل بئر بالهز، تليها يغسل 2 من 1 دقيقة في برنامج تلفزيوني إلا بالهز.
  12. تدور الشرائح لمدة 5 دقائق في 300 غرام x تجفيفها.
  13. نضع الشرائح في مربع الظلام للنقل والتخزين في درجة حرارة الغرفة.
  14. الشروع في مسح صفائف فورا لضمان اتساق إشارة بعد التحقيق.
    ملاحظة: بيد سبر شرائح يمكن تخزينها في الظلام والممسوحة ضوئياً في غضون أسبوع واحد من التدقيق.

5-مسح الصفيف

  1. التبديل على الماسح الضوئي الليزر (انظر الجدول للمواد) 30 دقيقة قبل إجراء المسح الضوئي للاحماء الليزر. تحميل برنامج الماسح الضوئي، وقم بتوصيل الكمبيوتر بالماسح الضوئي.
  2. ضع شريحة ذات الوجه الوجه المطبوع لأعلى في الماسح الضوئي حتى على ضوء اللعب يتحول أخضر خالص.
  3. اضغط على زر الإعدادات وقم بضبط الإعدادات التالية عند مسح الشرائح على النحو التالي: وضع المسح الضوئي، والوسيط؛ اقتناء، 635 فقط؛ وضع اقتناء، دليل على ذلك. كسب، 20؛ الطاقة ومنخفضة؛ نوع الشريحة، الشريحة غير مسمى؛ التركيز، والتركيز التلقائي. إيقاف "التمرير التلقائي" وتعيين قراءة الرمز الشريطي إلى بكسل حجم 10 و 35 المسح الضوئي.
  4. حفظ الصور الناتجة كالرمادي 16-بت تنسيق TIFF صورة متعددة. اضغط على زر الشبكة الاستيراد وتحديد قائمة صفيف مناسبة.
    ملاحظة: توضح القائمة صفيف حجم وموضع سوباريس وأسماء المواد المطبوعة المرتبطة بكل مؤشر من مؤشرات الميزة.
    1. محاذاة إلى الشبكة للبقع على الشريحة.
  5. تحليل الصور بالضغط على زر عملية التحديد الكمي لقياس كثافة إشارة الأسفار من كل بقعة وحفظ النتائج في تنسيق نصي يسمى جينيبيكس النتائج (لائحة برلمان غرينلاند).
    ملاحظة: يحتوي الملف لائحة برلمان غرينلاند على المتغيرات التعريب وتحديد الأهداف مستضد في الصفيف وأيضا شدة الأسفار الوسطية والخلفية المحلية يمثل الربط جسم إشارة قيم لكل نقطة.

6-بيانات التحليل

  1. حساب الوسيط ل replicates لكل مستضد بعد الطرح الخلفية استخدام برمجيات تحليل ميكرواري حرة دعا المرحلة عكس البروتين الصفيف (ربا) محلل, وحدة نمطية داخل لغة R الإحصائي على وكراً36.
  2. ارسم المنحنى القياسي واقحم الإشارات لكل مستضد بالنسبة إلى المنحنى القياسي الغلوبولين المناعي باستخدام الرسوم البيانية العلمية التجارية وبرامج الإحصاءات (انظر الجدول للمواد) لحساب مستويات الأجسام المضادة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 المخطط انسيابي تصف الخطوات الرئيسية في بروتوكول وصف. ويبين الشكل 2 اختبارات ارتباط سبيرمان مما يدل على اتفاق كبيرة بين ميكرواري واليسا ل IgG و IgA المضادة السم أ وب المستويات في الأمصال اختبار المريض. ويبين الشكل 3 فئة الأجسام المضادة IgG و IgA التفاضلية استجابات جسم معين بالسمية والسمية ب السم ثنائي (بكدتب) في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي دون إسهال وديمقراطيي المرضى الذين يعانون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا ذلك ميكرواري منصة مناسبة لتحديد الاستجابات المناعية خلطيه جيم البروتين المستضدات في الأمصال المريض (الشكلان 3 و 6) والتحضيرات التجارية من IVIg (الشكل 5). وقد أثبتنا أيضا أن تقنية ميكرواري أداء جيدا بالمقارنة مع أليسا التقليدية (الشكل 2)، ويبين إمكانية تكرار نتائج ممتازة، مع التقلبات داخل وبين عاصي تقع ضمن حدود مقبولة من الدقة ( الجدول 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البحث "زمالة هيرميس" نجم علا وموناغان تانيا ومن خلال تمويل مستقل من مركز أمراض الجهاز الهضمي في نوتنغهام و NIHR نوتنغهام الجهاز الهضمي الأمراض الطبية مركز البحوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BioRobotics MicroGrid II صفيفDigilab ، Malborough ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةN / Aمصفوفة الاتصال المستخدمة في الاكتشاف الآلي للمستضدات على الشرائح.
الماسح الضوئي InnoScan 710.InnopsysN / Aماسح ضوئي للشرائح المصفوفة الدقيقة الفلورية مع ليزر أحمر (Cy5) لقراءة التفاعل.
إصدار برنامج MAPIX 7.2.0InnopsysN / Aقياس شدة إشارة البقع.
دبوس تلامس السيليكونتقنيات التوليف المتوازيSMT-P75اطبع العينات على الشرائح.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426لتخزين الشرائح الجديدة والمطبوعة.
لوحة Genetix ذات 384 بئرX7022UNلتحضير المستضدات.
غطاء اللوحةSigma Aldrich ، المملكة المتحدةCLS6570-100EAلتقليل تبخر العينات.
AminosilaneSchott,  ألمانيا1064875الشريحة المفضلة لطباعة المستضدات.
حاملات الشرائحGraceBio Labs ، الولايات المتحدة الأمريكية204862قسم الشرائح إلى 16 مجموعة فرعية متطابقة. هذه الحوامل قابلة لإعادة الاستخدام وقابلة للإزالة وآبار مانعة للتسرب .& nbsp ؛
المبيضات البيضاء تحللNIBSCPR-BA117-Sالتحكم الإيجابي
توكسيد الكزاز   ؛أثينا للبحوث والتكنولوجيا04/150التحكم الإيجابي
الغلوبولين المناعي G (IgG) ، البلازما البشرية الطبيعية  ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090707الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى G IgG ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي G1 (IgG1) ، البلازما البشريةالطبيعية   ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090707-1الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى G1 IgG1 ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي G2 (IgG2) ، البلازما البشرية الطبيعية  ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090707-2الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى G2 IgG2 ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي G3 (IgG3) ، البلازما البشريةالطبيعية   ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090707-3الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى G3 IgG3 ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي G4 (IgG4) ، البلازما البشريةالطبيعية   ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090707-4الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى G4 IgG4 ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي أ (IgA) ، البلازما البشرية  ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090701الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى A (IgA) ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي A1 (IgA1) ، البلازما النخاعية البشرية  ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090701-1Mالغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى A1 (IgA1) ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي A2 (IgA2) ، البلازما النخاعية البشرية  ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090701-2Mالغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى A2 (IgA2) ، البلازما البشرية.
الغلوبولين المناعي M (IgM) ، البلازما البشرية  ؛ أثينا للبحوث و  التكنولوجيا   16-16-090713الغلوبولين المناعي البشري الأصلي المنقى M (IgM) ، البلازما البشرية.
الماعز البيوتينيل الأجسام المضادة IgG المضادة للإنسان ، سلسلة جاماالخاصة ب Vector LabsBA-3080الماعز المضاد للإنسان IgG (&gamma ؛ سلسلة محددة) - يتفاعل الجسم المضاد للبيوتين على وجه التحديد مع IgG البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
مفصلة IgG1 مفصلية مفصلية للفأر المضادة للإنسان BIOTSouthern Biotec9052-08 يتفاعل الجسم المضاد للبيوتين IgG1 المضاد للإنسان على وجه التحديد مع IgG1 البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
الفأر المضاد للإنسان IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08   يتفاعل الجسم المضاد للبيوتين IgG2 المضاد للإنسان على وجه التحديد مع IgG 2 البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
ماوس مضاد للإنسان IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08     يتفاعل الجسم المضاد للإنسان IgG3-biotin المضاد للماعز على وجه التحديد مع IgG3 البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
الفأر المضاد للإنسان IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08   يتفاعل الجسم المضاد IgG-biotin المضاد للإنسان على وجه التحديد مع IgG البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
مضاد للإنسان IgA ، خاص بسلسلة ألفا ، مصنوع في الماعز -مختبرات النواقلBA-3030يتفاعل الجسم المضاد للبيوتين المضاد للإنسان IgG - البيوتين على وجه التحديد مع IgG البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
الفأر المضاد للإنسان IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08الماعز المضاد للإنسان IgG - البيوتين يتفاعل على وجه التحديد مع IgG البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
الفأر المضاد للإنسان IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08   يتفاعل الجسم المضاد IgG -biotin المضاد للإنسان على وجه التحديد مع IgG البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
الفأر المضاد للإنسان IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 يتفاعل الجسم المضاد IgG-biotin المضاد للإنسان على وجه التحديد مع IgG البشري ولكن ليس مع الغلوبولين المناعي الآخر.
0.2 مم فلتر حقنةحراري علمي723-2520تصفية 5٪ BSA.
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتش ، المملكة المتحدةA7284استخدم 5٪ BSA لحجب الشرائح.
مخفف الأجسام المضادةداكو ، المملكة المتحدةS3022لتخفيف المصل والجسم المضاد الثانوي.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011الكشف عن التفاعل المناعي.
المطثية العسيرة المنقاة A و B (النمط السام 0 ، سلالة VPI 10463 ، النمط الريبوستي 087)مجموعة السموم ، الصحة العامة في إنجلتراNA
منقى كامل C. العسيرة السم B (CCUG 20309 توكسين B يعبر فقط عن السلالة)مجموعة السموم ، الصحة العامة في إنجلتراNA
شكل السلائف من الجزء B من السم الثنائي ، pCDTbجامعة باث & nbsp ؛NAأنتجت في الإشريكية القولونية من بنية جينية مؤتلفة اصطناعية بالكامل. تسلسل الأحماض الأمينية على أساس التسلسل المنشور من 027 النمط الريبي (http: www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
تنقية أصلية كاملة خاصة بالنمط الريبوجيني (001 ، 002 ، 027) بروتينات الطبقة السطحيةمدينة دبلن   ؛NA
Vigam (إعداد IVIg 1)مستشفيات جامعة نوتنغهام NHS TrustN / A
Privigen (إعداد IVIg 2)مستشفيات جامعة نوتنغهام NHS TrustN / A
Intratect (إعداد IVIg 3)مستشفيات جامعة نوتنغهام NHS TrustN / A
شرائح البيوتينيلية سموم جامعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529(2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842(2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349(2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452(2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Clostridium difficile Antibody DetectionAntigen specific Antibody ResponseSerum Sample AnalysisArray Printing ProcedureFluorescence Intensity MeasurementELISA Correlation AnalysisIsotype Subclass DeterminationToxin A Toxin B DetectionPatient specific Immunotherapy Optimization

مقالات ذات صلة