يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

5.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57414

⸱

أبريل 13, 2018

 , 
1Department of Biology, University of Saskatchewan

في هذه المقالة

ملخص

دليل خطوة بخطوة للتحقيق في فقدان الليزوزومية الحموضة في الأمعاء من C. ايليجانس استخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة الحيوية 6-كاربوكسي-2 '، اسيتات 7'-ديتشلوروفلوريسسين (كدكفدا)

الملخص

ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) هو نموذج نظام الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة طول العمر والمسارات الإنمائية. ومما ييسر هذه الدراسات شفافية الحيوان، والقدرة على توجيه وعكس الاختبارات الجينية، والسهولة النسبية لتوليد البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، واستخدام الأصباغ الفلورية التي يمكن أما أن يكون ميكروينجيكتيد في وقت مبكر الجنين أو إدماجه في غذائها (سلالةكولاي OP50) لتسمية العضيات الخلوية (مثلاً 9-ديثيلامينو-ح 5-بنزو (أ) فينوكسازيني-5-واحد و (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) ميثيليديني] ح-2-بيرل-5-يل-كابان}-N- [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). هنا، نحن نقدم استخدام صبغة حساسة لدرجة الحموضة الفلورسنت البقع lysosomes المعوية، توفير قراءات بصرية للتغيرات الفسيولوجية، ودينامية في الحموضة الليزوزومية في الديدان الحية. هذا البروتوكول ليس قياس درجة الحموضة الليزوزومية، ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى وضع طريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم التغيرات ذات الصلة الفسيولوجية في الحموضة الليزوزومية. كدكفدا هو مركب بيرمينت خلية التي يتم تحويلها إلى نيون فلوروفوري 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (تتيح) عند التحلل من استيراسيس داخل الخلايا. بروتونيشن داخل lysosomes الفخاخ تتيح في هذه العضيات، حيث يتراكم. وقد استخدمت هذه الصبغة سبب لها pKa منخفضة من 4.8، كجهاز استشعار درجة حموضة في الخميرة. هنا يصف لنا باستخدام كدكفدا كمكمل غذائي لتقييم الحموضة المعوية ليسوسوميس في C. ايليجانس. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ليسوسوميس الكالينيزينج في الحيوانات الحية، ، ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية بما في ذلك الدراسات المتعلقة بالشيخوخة، وأوتوفاجي، ونشوء حيوي الليزوزومية.

المقدمة

ظهور المجاميع البروتين مقبول على نطاق واسع أن تكون السمة مميزة للشيخوخة في الخلايا حقيقية النواة1،2،3، وتشكيل التي يعتقد أن من بين السائقين مبدأ الشيخوخة الخلوية4 , 5 , 6 , 7-وهناك أدلة متزايدة على أن الخلايا العمر، تقويض البروتين البصر، مما يؤدي إلى زيادة في تجميع البروتين. انهيار بروتيوليسيس في شيخوخة الخلايا ينطوي على ضعف أوتوفاجي8 ، فضلا عن تدهور البروتين بوساطة بروتوزوم9. أخيرا، يتم زيادة أكسدة البروتين الذي لا رجعة فيه في الخلايا القديمة، وإضعاف زيادة تقويض البروتينات10.

أوتوفاجي كان يعتقد في البداية أن يكون عملية غير انتقائية لتدهور الجزء الأكبر من البروتينات التالفة، ولكن الدراسات الأخيرة أشارت إلى أن أوتوفاجي انتقائي للغاية لتقويض المجاميع البروتين واختلال العضيات التي لا قابلة للتحلل عن طريق آليات إزالة البروتين الأخرى11. أثناء عملية أوتوفاجي، هي المحتبس البروتينات التالفة ومجمعة في حويصلة غشاء مزدوج يسمى في أوتوفاجوسومي. ثم الصمامات هذه أوتوفاجوسومي مع العضيات الحمضية التي تسمى lysosomes، الأمر الذي يؤدي إلى تدهور من البضائع أوتوفاجوسومي12. تمثل نقطة النهاية لمسار أوتوفاجيك lysosomes والمشاركة في العمليات الخلوية المختلفة مثل التحكم النسخي وإصلاح الغشاء والاستشعار المغذيات؛ تسليط الضوء على دورها المركزي في التوازن الخلوية (إعادة النظر في الرقم 13). وأظهرت العديد من الدراسات وجود ارتباط بين انخفاض تعتمد على العمر وظيفة الليزوزومية و اضطرابات الأعصاب المختلفة13. دأبت، استعادة وظيفة الليزوزومية في خلايا كبار السن يمكن أن تؤخر ظهور المتصلة بالشيخوخة تعمل14،15. وتوحي الدراسات التكوين للوسط إينترالومين أن انهيار الدالة الليزوزومية في خلايا كبار السن ليس سبب انخفاضا في إنتاج البروتياز الليزوزومية16. وبدلاً من ذلك، اقترح أن فقدان إينتراليسوسومال الحموضة، مطلبا جوهريا لنشاطها الأنزيمي، قد تكمن وراء انخفاض يحلول بوساطة بروتيوليسيس17. لتكون قادرة على استكشاف هذه الفرضية، من الضروري تطوير الكواشف وبروتوكولات للتحقيق التغيرات الدينامية في تعويض درجة الحموضة في الخلايا الحية بطريقة متسقة وقابلة للتكرار.

الأمعاء من C. ايليجانس الأنسجة الأيضية الرئيسية في الديدان ومنظم حاسمة للتوازن المنهجي وعمر. لقد قمنا بتطوير فحوصات لتقييم التغييرات في حموضة التجويف lysosomes المعوية الديدان لتحديد كيف بوساطة يحلول proteolysis يسهم في الشيخوخة. على الرغم من أن فلوروفوريس حساسة لدرجة الحموضة قد استخدمت سابقا في C. ايليجانس بمناسبة ليسوسوميس المعوية، لم يكن هناك بعد محاولة لوضع بروتوكول ناجحة التي يمكن الكشف عن زيادات صغيرة في الأس الهيدروجيني الليزوزومية في فيفو18. هنا، نحن نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها للكشف عن فقدان الليزوزومية الحموضة في الخلايا المعوية من C. ايليجانس استخدام بروتوكول تغذية بسيطة ومريحة الذي يشتمل فلوروفوري حساسة لدرجة الحموضة (كدكفدا) في الغذاء OP50.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-وصمة عار والصورة lysosomes المعوية

  1. لوحات البذور وسائط النمو السلكية (NGM) مع OP50
    1. إعداد لوحات NGM وفقا للبروتوكول الموصى بها19 والسماح لوحات مغلقة لتجف لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة.
    2. تلقيح البكتيريا OP50 إلى مرق مرق لوريا (رطل) عقيمة وتنمو في حمام حاضنة أو الماء تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 36 ح أو حتى التوجيه التشغيلي بين 0.2 و 0.4. تجنب استخدام ثقافة بكتيرية مع OD > 1 أو OD < 0.2.
    3. مجرد لوحات NGM جافة، ضع قطره (~ 30 ميليلتر) من العدوى OP50 في وسط اللوحة ومن ثم امتد الانخفاض إلى تصحيح تقريبا التي 2 سم × 2 سم في الحجم.
      ملاحظة: يمكن تخزين أي العدوى OP50 المتبقية في 4 درجات مئوية لتصل إلى شهر.
    4. عكس لوحات OP50 بمجرد العدوى قد المجففة (حوالي 10 أو 15 دقيقة)، ومن ثم احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 36.
    5. بعد 36 ساعة، إزالة اللوحات من الحاضنة ومخزن في 4 درجات مئوية حتى استخدامها في وقت لاحق.
      ملاحظة: يجب أن تكون اللوحات جيدة لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية.
  2. المكمل كدكفدا إلى OP50
    1. لتكملة كدكفدا على لوحات OP50، إعداد رصيد عامل من كدكفدا 10 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). يبقى الحل كدكفدا محمية من الضوء ومخزن في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
    2. بلطف ضع 100 ميليلتر من محلول كدكفدا 10 ملم على سطح التصحيح OP50 2 سم × 2 سم، مثل تصحيح كامل موحد مغطاة كدكفدا.
      ملاحظة: من المهم جداً أن تتناول تصحيح كامل من OP50 مع كدكفدا. إذا لزم الأمر، استخدم يصل إلى 150 ميليلتر من كدكفدا لكل لوحة. من المحتم أيضا أن الحل كدكفدا لا يتعدى حدود التصحيح OP50، ﻷن أي كدكفدا الذي يتدفق من التصحيح OP50 لن يتم تضمينها في المواد الغذائية، وسوف يسفر عن انخفاض كثافة المصبوغة.
    3. ضع لوحات OP50 في مربع الظلام على أعلى مقاعد البدلاء حتى يمتص كل حل كدكفدا في التصحيح البكتيرية (عادة حوالي 25 إلى 30 دقيقة).
  3. تلوين الديدان باستخدام كدكفدا
    1. مرة واحدة وقد ساد كدكفدا تماما التصحيح OP50، ضع الديدان لا يزيد عن 20 للوحة الواحدة واحتضان لوحات مقلوب في 20 درجة مئوية للحد ني ح 14.
      ملاحظة: من المستحسن وضع لوحات كدكفدا في مربع مبهمة لتقليل التعرض للضوء.
    2. للتحكم في كمية الاختلافات بين التجارب وتطبيع إشارات كدكفدا، (مستحسن) وصمة عار التعاون مع 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( ديفلورو) البورون (2.5 ميليلتر من حل تقدم طازجة 1 ملم)، صبغ أمين ضعيفة أسيدوتروبيك الأسفار التي غير متغيرة إلى حد كبير على مدى الطيف الأس الهيدروجيني الحمضية (انظر الجدول للمواد للأسماء الشائعة من الكواشف).
      ملاحظة: لا وصمة عار الديدان لأقل من 14 ح هذا قد توفر كثافة المصبوغة كدكفدا غير كافية وتعطي تفسيراً كاذبة للأس الهيدروجيني الليزوزومية.
  4. تحضير الشرائح للفحص المجهري
    1. وضع الشريطين موازية لوسم الشريط حوالي 3 بوصة عن بعضها البعض على سطح مستو سلس، مثل مرآة (الشكل 1).
    2. معطف السطح من النسخة المتطابقة مع رذاذ طارد المياه، وتمحو السائل الفائض.
    3. تذوب [اغروس] 2% (حله في المقطر ح2س) في فرن ميكروويف حتى المسال تماما، ثم ضع قطره 50 ميليلتر من [اغروس] بين الشريطين من الشريط وتغطية بسرعة الانخفاض مع شريحة مجهر، أن الشريحة من عمودي إلى الشرائط من الشريط. بعد وقد توطد [اغروس]، تشكل منصة دائرية تحت الشريحة، اقلب الشريحة وإضافة 10 إلى 15 ميليلتر من أزيد الصوديوم 5 مم (نان3) على لوحة المفاتيح [اغروس].
      ملاحظة: نان3 مثبط السيتوكروم ج أنه عندما تستخدم بتركيزات منخفضة، أنيسثيتيزيس الديدان عكسية حيث أنه سوف لا تتحرك أثناء التصوير.
    4. اختيار الديدان من لوحة OP50 تكملة مع كدكفدا، ونقلها إلى لوحة NGM نظيفة دون أي OP50. السماح للديدان للتحرك لبضع ثوان للسماح لمعظم OP50 المراد إزالتها من على سطح أرض الديدان، وثم نقل الديدان إلى لوح [اغروس] يتضمن أزيد الصوديوم 5 ملم.
    5. تغطية لوحة المفاتيح [اغروس] كشف الغطاء فورا. تأكد من وضع بكشف الغطاء بلطف دون تطبيق الكثير من الضغوط، حيث يمكن أن ينتج هذا الديدان تتضاعف.
      ملاحظة: البكتيريا OP50 تكملة مع كدكفدا فلوريس عندما تصور بالفحص المجهري، ومن ثم من المهم لتنظيف الديدان على أفضل وجه ممكن قبل وضعها على اللوحة [اغروس] يتضمن أزيد الصوديوم. إذا كان الاستعداد أكثر من 6 سلالات من C. ايليجانس (بما في ذلك N2، مراقبة نوع البرية)، من المستصوب إعداد العينات على دفعات 6، ضمانا لأن الديدان لم تجف على منصة [اغروس]. في بعض السلالات، يبدأ الفرج للتمزق بعد فترات طويلة من الوقت بسبب الضغط من كشف الغطاء، ولذلك فمن المهم التخطيط وفقا لذلك.
  5. مجهر [كنفوكل]
    ملاحظة: بعض المجاهر لديها ميزة مضمنة تلقائياً زيادة كثافة الأسفار لتعويض مستويات متغيرة من الأسفار. قد لا تعمل هذه المجاهر جيدا للتصوير الديدان ملطخة كدكفدا، نظراً لطبيعتها ستزيد كثافة العينات الأسفار.
    1. تنفيذ التصوير على الميكروسكوب [كنفوكل] قياسية باستخدام موجات الإثارة/الانبعاثات المحددة إلى 488/530 نانومتر كدكفدا. التقاط صور طائرة واحدة (لا مداخن-Z) من lysosomes المعوية واستخدم فقط ليسوسوميس التي في التركيز (شدة الإشارة القصوى) لتقدير كثافة.
      ملاحظة: ربما بسبب الاختلافات في توافر صبغ، lysosomes الخلايا المعوية الخلفي مباشرة إلى البلعوم الحفاظ على كدكفدا تلطيخ كثافة بغض النظر عن النمط الوراثي أو العمر، ومن ثم ينبغي الحرص على تجنب التصوير lysosomes في هذه الخلايا.
    2. صورة الشريحة التي تحتوي على نوع البرية القديمة يوم 2 N2 الديدان أولاً. عند القيام بذلك، قم بتعديل معالم التصوير [كنفوكل] مثل طاقة الليزر، والثقب، وفتحه لضمان أن لا يتم oversaturated كدكفدا تلطيخ كثافة.
      ملاحظة: بمجرد تعيين هذه الإعدادات، لا تغييرها لكامل مدة التصوير لهذا اليوم.
    3. التقاط الصور 1024 × 1024 بكسل لطائرة واحدة من الأمعاء (3 إلى 4 صور كل دودة) استخدام 60 X عدسة التكبير.
      ملاحظة: سوف تسفر عن طيف انبعاث كدكفدا في الديدان ذروة بارز واحد في 520 nm تزامنت مع به الأسفار عنها الطيف20، توفير قراءات إشارة محددة التي تختلف عن أوتوفلوريسسينسي المعوية (الشكل 3).
    4. تصدير الصور [كنفوكل] الخام (ملفات.lsm) كملفات.tiff لكل قناة.
    5. بعد ذلك، فتح إيماجيج وانقر فوق ملف | فتح لفتح ملف الصورة كمياً. بمجرد أن يتم تحميل الصورة، استخدم أداة التحديد الشكل البيضاوي في إيماجيج لتحديد منطقة للفائدة (العائد على الاستثمار).
    6. وبعد ذلك، انقر فوق تحليل | مقياس لقياس كثافة الأسفار لأن العائد على الاستثمار. حدد 4 – 5 مختلفة lysosomes التركيز في كل صورة وحساب كثافة متوسط fluorescence النسبية لكل منطقة للفائدة (ROI).
    7. لكل صورة، وقياس كثافة fluorescence الخلفية في منطقة الأمعاء بين ليسوسوميس. طرح قيم الكثافة fluorescence الخلفية من قيم الكثافة fluorescence الليزوزومية.
    8. وفي المجموع، جمع حوالي 30 إلى 50 قيم طبيعية الفردية لكثافة كدكفدا (6 إلى 10 الحيوانات) لكل سلالة يجري اختبارها. استخدام هذه القيم لرسم مربع والخط الطولي مؤامرة باستخدام أي البرامج الإحصائية المناسبة.
      ملاحظة: تلطيخ يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لعوامل مثل درجة الحرارة ووقت الحضانة والصحة/سن عموما من الحيوانات مثل أن المقارنات كثافة الأسفار فقط ذات الصلة ضمن عملية العينات في نفس التجربة المصبوغة. ولذلك من المهم أن عملية المراقبة في كل تجربة المصبوغة. حساب الاختلافات الإحصائية (t-الاختبارات) باستخدام أي من البرامج الإحصائية المناسبة.
    9. صورة جميع سلالات من نفس التجربة (الملون في نفس اليوم) في التسلسل، مع الحرص على عدم تغيير أي من المعلمات التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كدكفدا البقع lysosomes بطريقة تعتمد على درجة الحموضة، و pKa منخفضة وامتصاص جاهزة في ليسوسوميس يجعل استشعار الرقم الهيدروجيني مثالي21. كدكفدا تلطيخ كثافة يتناسب عكسيا مع18،الليزوزومية الأس الهيدروجيني (أي المصبوغة يزداد كثافة كانخفاض الأس الهيدروجيني)22. كدكفدا إشارات ضعيفة دائماً في lysosomes الحيوانات تعامل مع 20 مم لدواء الكلوروكين، مثبط لتحميض الليزوزومية، والديدان المستنفد من الخامس-ATPase، الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مجموعة متنوعة من الأحداث الجزيئية والخلوية تسهم في الشيخوخة، متأثر بسمات تاريخ الحياة والعوامل الوراثية. لدينا الدراسة الأخيرة22 تشير إلى أن دورة الإنجابية دوراً هاما في السيطرة على اللياقة البدنية سوما من خلال تنظيم ديناميات الليزوزومية الأس الهيدروجيني. أظهرنا أن يتعزز هذا proteolysis الليزوزومية بوساطة حين استنساخ الحيوانات بنشاط قبل upregulation نسخ الخامس-ATPase، الذي يكفل بدوره lysosomes الحمضية. عند نهاية الاستنساخ، قطرات التعبير الخامس-ATPase، الكالينيزي lysosomes، وتتراكم المجاميع البروتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس السلالات، والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة)، والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI) للتمويل. ونود أن نشكر الدكتور تشين ليزين (إدارة أنظمة الخلية والتشريح، UT الصحة سان أنطونيو) للسماح بالاستخدام غير المقيد لها مرافق مختبر لجميع التجارب التي C. ايليجانس ، فضلا عن الدكتور وانغ اكسينج (المدير المعاون، مرفق التصوير الضوئي ، UT الصحة سان أنطونيو) للحصول على المساعدة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. ونود أيضا أن نشكر الدكتور مايرون إغناطيوس لتقديم الدعم والتشجيع لتسهيل تصوير فيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
OP50 (E. coli< / em>) مركزCaenorhabditis لعلم الوراثةاطلب عبر الإنترنت على https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5 (6) -carboxy-2 '، 7'-dichlorofluorescein diacetate   ؛ThermoFisherC369المعروف باسم cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo (a) phenoxazine-5-one و (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN (1))methylidene] -2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N- [2- (dimethylamino) ethyl] propanamidato) (ثنائي فلورو) البورونThermoFisherL7528المعروف باسم مجهر Lysotracker الأحمر
متحد البؤر (مثل Zeiss LSM 510) ImageJ
قم بالتنزيل مجانا من https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth PowderThermoFisher22700041
Bacto AgarSigmaA5306-1KG
NaClSigmaS9888
Bacto PeptoneFisher ScientificS71604
مسحوق الكوليسترولSigmaC3045   ؛
CaCl2Sigma449709
MgSO4SigmaM7506
K3PO4SigmaP5629
Sodium AzideSigmaS2002
DMSOSigmaD8418
شرائح مجهرVWR48311-703
زلات الغطاءThermoFisher3406
حاضنة
AgaroseSigmaA6013
أو أي سطح
مرآة مستو أملس آخر

المراجع

  1. Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
  2. Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
  3. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  4. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  5. Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
  6. Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
  7. Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones? Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
  8. Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
  9. Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
  10. Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
  11. Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
  12. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
  13. Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
  14. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  15. Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
  16. Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age? Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
  17. Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
  18. Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
  21. Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
  22. Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).
  23. Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
  24. Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
  25. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
  26. Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
  27. Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
  28. Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
  29. Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
  30. Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
  31. Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C elegans cDCFDA Vacuolar ATPase
تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.