Integrase الفيروسات التراجعية المؤتلف والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أن تشكل مجمع نشطة انزيماتيكالي المعروف باسم إينتاسومي. ويمكن استخدام إينتاسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية، والحركية. هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تجميع وتنقية إينتاسوميس فيروس مزبد النموذج.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أ تحديد الميزة وخطوة ضرورية لدورة حياة لفي هو دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف. ترميز كافة الفيروسات القهقرية إنزيم integrase (في) الذي يحفز التساهمية ضم الفيروسية للمضيف الحمض النووي، والذي يعرف باسم نقل حبلا. الاندماج قد يكون على غرار في المختبر مع المؤتلف في النسخ العكسي والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الجينوم الفيروسي. كي الخص رد فعل الاندماج التي تحدث في فيفو، تكامل أوثق مجمعات يتم تجميعها في المؤتلف وليغومرات الاصطناعية بالغسيل الكلوي في المخزن مؤقت انخفاض تركيز ملح. يمكن تنقية التكامل المعقدة، ودعا إينتاسومي، بحجم الاستبعاد اللوني. في حالة نموذج مزبد الفيروس (فف)، إينتاسومي تيترامير في وهما الحمض النووي ليغومرات وسهولة يفصل في موحودي والحرة أوليجومير الحمض النووي. قد جزيئي كفاءة التكامل إينتاسوميس فف تحت مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية فهم أفضل لديناميات وآليات التكامل للفيروسات الرجعية.
المقدمة
يتم دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف خطوة إلزامية في دورة الحياة لجميع الفيروسات القهقرية1. إينتيجراسي الإنزيم الفيروسي (في) يحفز التساهمية ضم كل نهاية لجينوم الحمض النووي الفيروسي إلى المضيف الحمض النووي. أثناء عدوى خلوية، في هو جزء من مجمع ما قبل الاندماج الذي يتوسط التكامل. في المؤتلف الرصاصية مع مزدوجة ليغومرات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أيضا تنفيذ الاندماج في الحمض النووي المستهدف في المختبر2. مشتركة تكامل فحص في المختبر يستخدم بلازميد سوبيركويليد كهدف الحمض النووي. التكامل بين كلا ليغومرات الحمض النووي الفيروسي (فدنا) بلازميد ينتج منتج خطي ويطلق ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الصلب من فدنا
- الجمع بين 1 X عشرة المخزن المؤقت (الأسهم عشرة X 10: 100 مم تريس-HCl، pH 8.0، 1 م كلوريد الصوديوم، يدتا 10 ملم)، 10 ميكرومتر اليغو 1 (أتتجتكاتجاتتتجتاتاتجاجتجكجكككجاكاج 3 '5'، 100 ميكرومتر الأسهم)، و 10 ميكرون 2 اليغو (كتجتكججكجككاكتكاتاتاكاااتككاتجاكا 3 '5'، 100 ميكرومتر الأسهم) في وحدة تخزين نهائي 1.5 مل . اليكووت 25 ميليلتر في أنابيب التفاعل المتسلسل (PCR) 0.2 مل بوليميريز ستين.
ملاحظة: اعتماداً على التطبيق، قد يتم تعديل ليغومرات مع فلوروفوريس أو علامات نهاية 5 '-2 اليغو أو أمينية تي داخلية في القاعدة 13 من 5'-نهاية 1 اليغو. يجب تنقية ليغومرات معدلة من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) قبل الصلب. وقد وجدنا أن 5 '-نهاية Cy3 أو Cy5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إينتاسوميس فف يتم تجميعها في المؤتلف وفدنا. بعد التجميع، يتم تنقية إينتاسوميس قبل ثانية (الشكل 1). هو جزيئي نشاط الإدماج لكل جزء مع سوبيركويليد الحمض النووي الهدف و [اغروس] هلام التفريد (الشكل 2). هو تصوير هذا جل مع الماسح ضوئي فلورسنت للكشف عن أتبر (وفلوروفوري، إذا تم استخدام المسمى فلوروفوري فدنا). استخدام برنامج تحليل الصور، يمكن استخدام وحدات بكسل الفرقة لحساب كفاءة التكامل (الشكل 3). الكسور بتكا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وظائف النسخ العكسي تشكل مولتيميريك معقدة مع الحمض النووي الفيروسي لتنفيذ التكامل ومواصلة دورة الحياة الفيروسية. قد يكون العدد في مونومرات كل إينتاسومي تيتراميرس أو أوكتاميرس، أو ربما أعلى ترتيب مولتيميرس11،12،،من1314. إينتاسوميس بفف هي تيترامير المؤتلف مع ليغومرات الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي تحاكي الحمض النووي الفيروسي وينتهي3. وقد استخدمت هذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قلة الحمض النووي | IDT | N / A | مخصص الحمض النووي Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen / Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 مل مرشحات الطرد المركزي | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | البروبان SV-DTT | |
| BIS-TRIS ، > = 99.0٪ (المعايرة بالتحليل الحجمي) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl 2< / sub> | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4< / sub> | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| نصائح تحميل الجل ، 1 - 200 & L | كورنينج | CLS4853-400EA | |
| شفرة الحلاقة ؛ أحادي الحواف. 100 / عب. عبوة من 100 | منها من فيشر Scientific | 12-640 | |
| مع غشاء PES > 250 مل | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| مقاطع أنابيب غسيل الكلى | مختبرات الطيف | 132734 | |
| 6-8 كيلو دالتون 10 مم أنابيب غسيل الكلى | الطيف الطبية | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life | Sciences 17517201 | |
| عالية الدقة قياسية Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| بروميد الإيثيديوم | ثيرمو فيشر العلمي | BP1302 | |
| البرتقال جي | فيشر العلمي | 0-267 | |
| Hyladder 10kb ، 500 ممر | Denville Scientific | CB4225-4 |
المراجع
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
