مقالة منهجية

Seq كاريب ورقاقة Seq: أساليب لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين وتفاعلات البروتين-الحمض النووي في الخلايا الجذعية الجنينية

DOI:

10.3791/57481

⸱

مايو 25, 2018

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف أساليب أداء Seq رقاقة وخرائط كاريب-Seq، بما في ذلك إعداد المكتبة لتسلسل الجيل القادم، لتوليد ابيجينوميك العالمية، والجيش الملكي النيبالي المرتبطة الكروماتين في دإط الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الذاتي تجديد والتمايز محكوم بإشارات خارجية والشبكات المضمنة المنظمين جينية، عوامل النسخ والترجمة بعد إدخال تعديلات على هيستونيس التي كومبيناتوريالي تؤثر الجينات الدولة تعبير الجينات القريبة. كما تبين أيضا الجيش الملكي النيبالي للتفاعل مع البروتينات المختلفة لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. إيمونوبريسيبيتيشن رنا المرتبطة الكروماتين (كاريب) تليها الجيل التالي التسلسل (كاريب-Seq) طريقة جديدة لمسح الكشف المرتبطة بالبروتينات الكروماتين، بينما الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن تليها (تسلسل الجيل المقبل تشيبسيق) وأسلوب الجينوميات قوية خريطة موقع تعديل بوستترانسلاشونال هيستونيس، وعوامل النسخ والمعدلات جينية على نطاق عالمي في دإط الخلايا. هنا، يمكننا وصف أساليب لأداء Seq كاريب ورقاقة-Seq، بما في ذلك بناء مكتبة لتسلسل الجيل القادم، لتوليد الحمض النووي الريبي العالمية المرتبطة الكروماتين وخرائط ابيجينوميك في خلايا ES.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينظم الاتصال بين إشارات خارج الخلية ومجموعة من النسخي المنظمين، بما في ذلك معدلات هستون، وتعديل الترجمة بعد انتهاء ذيول هيستون قرارات مصير الخلايا الجذعية الجنينية (ES). هذه التفاعلات تيسير الوصول الكروماتين والتعبئة والتغليف من الكروماتين في واحدة من دولتين: يوتشروماتين، ومفتوحة ونشطة ترانسكريبتيونالي، وهيتيروتشروماتين، وصغير وعموما ترانسكريبتيونالي الخاملة. عوامل النسخ مع الانتماءات الملزمة الخاصة بتسلسل الحمض النووي ومعاون المعدلات جينية مع المناطق يوتشروماتيك للمشاركة في التحكم في التعبير الجيني. أساليب تسلسل الجيل القادم، بما فيها رقاقة Seq1، قد ساعدت في رسم خرائط الجينوم على نطاق شبكات النسخي التي أساسية بالنسبة لوفاق الخلية التجديد الذاتي وبلوريبوتينسي2،3،4 ،،من56. وعلاوة على ذلك، بينما إيمونوبريسييشن الحمض النووي الريبي تليها الجيل التالي التسلسل (RIP-Seq)7 تقييمات لتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي تشير إلى أن الحمض النووي ملزم البروتينات تتفاعل مع الكشف لتنظيم أحداث النسخي7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12، حققت بضعة دراسات التعريب على نطاق الجينوم للكشف المرتبطة الكروماتين12، أو التفاعلات العالمية بين التعديلات الجيش الملكي النيبالي وهيستون. الكشف منذ فترة طويلة غير الترميز (لنكرناس) هي فئة واحدة من الكشف التي تم العثور عليها لتنظيم نشاط البروتينات المرتبطة الكروماتين13،،من1415. على سبيل المثال، هو زيست لنكرنا الذي ينظم، في خلايا الثدييات الإناث، المنظمة كروموسوم إكس واحد، عن طريق تعيين16،ريبريسورس جينية17. الطيف الكامل من الكشف المرتبطة بلونين غير معروفة إلى حد كبير. هنا، يمكننا وصف بروتوكول رواية، إيمونوبريسيبيتيشن الحمض النووي الريبي المرتبطة الكروماتين (كاريب) تليها الجيل التالي التسلسل (كاريب-Seq)، لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين على نطاق الجينوم في دإط الخلايا، بما في ذلك إعداد المكتبة تسلسل الجيل المقبل، ورقاقة-Seq خريطة شغل عالمي هستون التعديلات وعوامل النسخ والمعدلات جينية. خلافا لسائر أساليب Seq التمزق7، يتضمن كاريب-تسلسل الخطوات crosslinking وسونيكيشن، والتي تسمح للتعرف مباشرة على الكشف المرتبطة بلونين. معا، Seq رقاقة أداة قوية لتحديد تفاعلات البروتين على نطاق الجينوم الحمض النووي، بينما كاريب Seq وسيلة قوية لمسح الكشف المرتبطة بمكونات الكروماتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-ثقافة الماوس دإط الخلايا في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق.

ملاحظة: يتم تقليديا مثقف الماوس دإط الخلايا في وسائط الإعلام على طبق خلية ثقافة مغلفة بالجيلاتين وطبقة أحادية من الماوس الليفية الجنينية (MEF)، التي كانت ميتوتيكالي المعطل (إيميفس). ومع ذلك، يجب إزالة MEFs قبل المصب تحليلات جينية أو التعبير للحيلولة دون تلوث الكروماتين MEF المرتبطة والجيش الملكي النيبالي.

  1. إعداد طبقة وحدة التغذية: الجيلاتين معطف صفيحة ثقافة خلية 6-جيدا بإضافة 2 مل جيلاتين 0.1% في المياه، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
  2. إعداد دميم 10% جلوكوز عالية الوسائط التي تحتوي على 2 مم ل الجلوتامين، 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين x 1/ستربتوميسين.
  3. عزل ميفس من E13.5 إلى E14.5 الفئران18،19 أو اقتنائها من مورد تجاري. إلغاء تنشيط ميتوتيكالي ميفس بالتعامل مع ميتوميسين ج أو تشعيع جاما باستخدام البروتوكولات القياسية19. وبدلاً من ذلك، إبطال ميتوتيكالي ميفس (إيميفس) يمكن الحصول عليها من مورد تجاري.
  4. استزراع MEFs. قبل الحارة وسائط MEF عند 37 درجة مئوية، وذوبان الجليد قنينة مجمدة من إيميفس والثقافة في 10% FBS MEF وسائط الإعلام على 37 درجة مئوية مع 5% CO2. لوحة MEFs في الخلايا ~ 200,000 كل من طبق الثقافة 6-جيدا جيدا.
  5. استزراع خلايا ES على طبقة من الخلايا المغذية (إيميفس).
    1. ح 12-24 بعد الطلاء إيميفس، قبل الحارة أنبوب 50 مل ES خلية الإعلام (دميم عالية-الجلوكوز، ليف (10 نانوغرام/مل)، 15% ES FBS مؤهل بالخلية، زراعة الخلايا المؤهلة 1 × 2-mercaptoethanol، 1 × الجلوتامين والأحماض الأمينية غير الأساسية (نا)، 1 × البنسلين/ستربتوميسين)، في 37 درجة مئوية مع أول أكسيد الكربون 5%2.
    2. نضح الوسائط من لوحات ثقافة الخلية التي تحتوي على إيميفس، وإعادة تعليق دإط الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام (بعد ذوبان الجليد في 37 درجة مئوية)، ولوحة الخلايا على طبقة إيميفس. عند وضع الطبق الثقافة في الحاضنة، من المهم لتحريك الطبق في شكل "t" لتوزيعها بالتساوي الخلايا ومنع تجميع نحو مركز الطبق.
  6. ممر دإط الخلايا على الأطباق المغلفة الجيلاتين خالية من علبة التغذية بالورق. ممر دإط الخلايا قبل أن تصبح المتلاقية. دإط الخلايا المستعمرات الحفاظ على التجديد الذاتي أفضل إذا كانت المستعمرات متباعدة بشكل متساو ولا المتلاقية. وجود العديد من المستعمرات خلية ES التي لمس يشير إلى أن كثافة الخلايا عالية جداً.
    1. معطف صحن ثقافة 6-جيدا مع الجيلاتين كما هو موضح أعلاه. احتضان 0.25% التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية ~ 10-15 دقيقة إلى التربسين الحار مسبقاً.
    2. بعد ذلك، ممر دإط الخلايا بالغسيل مع 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الأولى وإضافة 1 مل من محلول يدتا التربسين 0.25%. الانتظار 1-2 دقيقة للمستعمرات لفصل. ننأى المستعمرات إلى تعليق خلية واحدة من بيبيتينج مع طرف 1 مل ل 5 مرات ~.
    3. استخدام مجهر للتأكد من تفكك خلية واحدة فقط من خلايا ES. إلى إخماد رد فعل، أو "تحييد" التربسين، إضافة 10% FBS MEF وسائط الإعلام. الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق، ونضح وسائط الإعلام.
    4. تعليق إعادة بيليه الخلوية في 2 مل من وسائل الإعلام (ES الخلية) وتستكمل مع الجليكوجين synthase كيناز-3 (GSK3) المانع (CHIR99021؛ GSK3i)، أو 2 طاء الشروط (مكي/GSK3i) (2-3 ميكرومتر GSK3i: CHIR99021، 1 ميكرومتر مكي: PD0325901).
    5. نضح الجيلاتين من طبق ثقافة الخلية، وإضافة 2 مل وسائط التي تحتوي على بتوليدا للطبق، ووضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية (الشكل 1A-د). تثبيط المزدوج GSK3i ومكي تشجع الدولة الأرض السذاجة بلوريبوتينسي دإط الخلايا في غياب الخلايا المغذية (إيميفس) ودون المصل20. ينبغي أن تكون خلايا ES باساجيد اثنين إلى ثلاث مرات لإزالة ميفس قبل الشروع في كروسلينكينج.

2-كروسلينكينج دإط الخلايا للرقائق وكاريب

  1. حصاد دإط الخلايا بغسلها مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 0.25% التربسين استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا لعدة دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجنب الإفراط في تريبسينيزيشن دإط الخلايا، مما يؤدي إلى موت الخلية. استخدام مجهر لتقييم الانفصال من خلية مفردة.
  2. إخماد الهضم التربسين كما هو موضح أعلاه باساجينج دإط الخلايا، والطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق.
  3. تعليق إعادة الخلايا الموجودة في الوسائط MEF المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) (10% FBS/دميم) في 2 × 106 خلايا/مل.
  4. أن التشعب الخلايا، إضافة 37% فورمالدهايد الحل إلى تركيز نهائي 1%، واحتضان الخلايا في أنبوب مخروطي (15 مل أو 50 مل) في 37 درجة مئوية لعكس الدقيقة 8 الأنبوبة عدة مرات خلال الفترة 8 دقيقة لتحقيق التثبيت متجانسة.
    ملاحظة: وقت التثبيت يمكن أن يكون تجريبيا الأمثل كاريب. إذا تم تعديل وقت التثبيت، ينبغي أيضا تعديل عدد دورات sonication. أيضا، درجة الحرارة 37 درجة مئوية يزيد من كفاءة كروسلينكينج مقابل كروسلينكينج في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن يكون درجة حرارة التثبيت الأمثل تجريبيا.
  5. للتوقف عن رد فعل التثبيت، إضافة م 1.25 عكس جليكاين (مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية) بتركيز من 0.125 م. أنبوب 8 لفة في الدقيقة باستخدام دوار لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي العينة في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح وسائط الإعلام.
  6. أغسل بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني مبردة مسبقاً (4 درجة مئوية) والطرد المركزي العينة في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح برنامج تلفزيوني. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة أخرى. بعد ذلك، الكوة 15 × 106 خلايا كل أنبوب 15 مل.
  7. تجميد بيليه الخلية بوضعه في النتروجين السائل لمدة 1 دقيقة، على الثلج الجاف لمدة 5 دقائق، أو وضع على الفور في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين ثابتة دإط الخلايا الكريات لمدة تصل إلى 6 أشهر دون انخفاض الجودة في تجارب المتلقين للمعلومات.

3-الكروماتين sonication للرقائق وكاريب

  1. تحسن وفاق ثابت الخلية بيليه على الجليد. إعادة تعليق بيليه الخلية في المخزن المؤقت سونيكيشن (2.5 مل). لعوامل النسخ أو المنظمين جينية (عوامل البروتين)، تعليق إعادة بيليه في TE 1 x, 1 مم بمسف، 1 x مثبط بروتيناز كوكتيل. لإدخال تعديلات على هستون، تعليق إعادة بيليه في 1 x TE، 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي، 1 مم بمسف، مثبط بروتيناز x 1.
    ملاحظة: حين إضافة الحزب الديمقراطي الصربي يعزز كفاءة سونيكاتيون، فإنه قد لا تكون مفيدة لتقييم بعض العناصر المكونة الكروماتين أو عوامل النسخ.
  2. الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة)، sonicate الكروماتين مع دورات 14-18 (30 ثانية في 30 ثانية بقية) في السعة 40%. الكروماتين المرتبطة الحمض النووي الريبي إيمونوبريسيبيتيشن (كاريب)، خفض عدد دورات سونيكيشن (8-10 دورات). سبب الخلوية، والتثبيت، وتقلب سونيفير، ينبغي تحديد شروط sonication تجريبيا.
  3. الملحق المخزن المؤقت سونيكيشن مع 28 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% للبروتين-العوامل، 28 ميليلتر من ديوكسيتشولاتي الصوديوم، ومل 0.28 10% X100 تريتون، ومزيج جيد.
    ملاحظة: إضافة هذه المكونات إلى المخزن المؤقت سونيكيشن يولد ريبا المخزن المؤقت.
  4. الطرد المركزي العينة في 10,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لمسح قبل الكروماتين. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد والمضي قدما في إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين.
  5. وبدلاً من ذلك، يمكن تخزين الكروماتين سونيكاتيد في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. ومع ذلك، تخزين الكروماتين سونيكاتيد في-80 درجة مئوية قد تؤدي إلى تدني نوعية لرقاقة البروتين-عامل.

4-رقاقة وعملية كاريب

  1. إضافة 40 ميليلتر بروتين A أو G المغناطيسي الخرز إلى 1.5 مل، أنبوب ملزمة منخفضة. إضافة 600 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل الخرز. ضع الأنبوب على رف يحتوي على مغناطيس واحتضان الأنبوب لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإزالة برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق الخرز المغناطيسية في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 2-4 ميكروغرام من جسم الأنبوب مع الخرز المغناطيسية. احتضان وتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة في دورة في الدقيقة 8 استخدام المدورة إلى تيسير الربط جسم الخرز المغناطيسية. إدراج الأنبوب على الرف المغناطيسية، وتبني عليه لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل الخرز المغناطيسية. يتم إجراء الغسيل مع برنامج تلفزيوني لإزالة إيجس الحرة. احتضان وتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بين خطوات الغسيل. إرفاق الأنبوب بالمغناطيس وإزالة برنامج تلفزيوني.
  4. استخراج (4 × 106 خلايا كل رقاقة) مع الخرز المغناطيسي إيمونوبريسيبيتاتي الكروماتين زمنياً البروتينات التي تفرخ الكروماتين سونيكاتيد وتدوير العينة عند 4 درجة مئوية (بين عشية وضحاها).
  5. أغسل حبات مغناطيسية. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة مع المخازن المؤقتة التالية وقم بتدوير العينة لمدة 10 دقائق مع كل المخزن المؤقت: مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت ريبا (الشركة المصرية للاتصالات (10 مم Tric-HCl، يدتا 1 مم) pH 8.0، 1% X-100 تريتون، ديوسيتشولاتي الصوديوم 0.1%، 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي)، مرتين مع 1 مل من المعهد الملكي العازلة ج أونتينينج 0.3 M كلوريد الصوديوم، مرتين مع 1 مل مرة واحدة مع 1 مل من الشركة المصرية للاتصالات ليكل المخزن المؤقت (0.5% صوديوم ديوسيتشولاتي، 0.5% NP40، 0.25 م ليكل)، المخزن المؤقت مع 0.2% X-100 تريتون، ومرة مع 1 مل من الشركة المصرية للاتصالات.
  6. كروسلينكينج دي للرقائق. إعادة تعليق الخرز المغناطيسية في 100 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات. إضافة 3 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% و 5 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل). احتضان العينة عند 65 درجة مئوية (بين عشية وضحاها).
    ملاحظة: من المهم لتغطية هذه الأنابيب أثناء هذه الخطوة مع بارافيلم أو غلاف بلاستيكي لمنع التبخر.
    1. في اليوم التالي، عكس الأنبوب عدة مرات المزيج. بعد ذلك، استخدم الحامل المغناطيس لنقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. ليغسل الخرز المغناطيسي، إضافة 100 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات التي تحتوي على 0.5 م كلوريد الصوديوم، وبعد ذلك الجمع بين سوبيرناتانتس اثنين.
  7. كروسلينكينج دي كاريب. إعادة تعليق الخرز المغناطيسية في 100 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات. إضافة 3 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% و 5 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل). احتضان العينة عند 65 درجة مئوية ل 4 إلى 12 حاء الحضانة يحتاج وقت 65 درجة مئوية يحدد تجريبيا بسبب التباين بين أنواع الخلايا، وظروف sonication والتثبيت، إلخ.
    1. عكس الأنبوب 3-5 مرات مزيج وتطبيق الأنبوب إلى رف المغناطيسية، وبعد ذلك نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
    2. ليغسل الخرز المغناطيسي، إضافة 100 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات التي تحتوي على 0.5 م كلوريد الصوديوم، وبعد ذلك الجمع بين سوبيرناتانتس اثنين.
      ملاحظة: من المهم أن تستخدم الكواشف نوكلاس خالية (على سبيل المثال.، المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، الحزب الديمقراطي الصربي، إلخ.) الحيلولة دون فقدان الحمض النووي الريبي أو أثناء الخطوة دي-كروسلينكينج.
  8. استخراج الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي باستخدام 200 ميليلتر من الفينول: كلوروفورم: إيسواميل الكحول (PCI) (25:24:1، v/v).
    ملاحظة: الجيش الملكي النيبالي ويمكن أيضا استخراج باستخدام مجموعات تجارية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة. اهتز لمدة 30 ثانية، تدور في س 10,000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
    1. أن يعجل بالحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي، إضافة 2 ميليلتر من جليكوبلوي و 20 ميليلتر من خلات الصوديوم م 3 و 600 ميليلتر من الإيثانول. ميكس بعكس ~ 5-8 مرات، ووضع العينة على الثلج الجاف، أو في-80 درجة مئوية على الأقل 1-2 ح.
    2. الطرد المركزي العينة في 10,000 ز س لمدة 30 دقيقة باستخدام أجهزة الطرد مركزي في أعلى جدول المبردة (4 درجات مئوية). الهواء الجاف بيليه < 1 دقيقة وإعادة تعليق 40 ميليلتر من المجلس التنفيذي في المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl). لإعداد مكتبة Seq رقاقة، انتقل إلى الخطوة 6.
  9. إزالة الحمض النووي من عينات الحمض النووي الريبي الملكية الفكرية المرتبطة الكروماتين باستخدام الدناز. إضافة المخزن الدناز x 10 إلى 1 x تركيز العينة كاريب. أضف 1 ميليلتر من الدناز لما يصل إلى 10 ميكروغرام للحمض النووي الريبي (رد فعل 50 ميليلتر). احتضان العينة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 استخراج عينات الحمض النووي الريبي مع PCI. ريسوسبيند في الحرة نوكلاس ح2o.

5-مزدوج--تقطعت بهم السبل كدنا توليف ل Seq كاريب

  1. توليف لكدنا حبلا الأولى. لرد فعل عكسي-النسخ، قم بإعداد رد فعل التالي في أنبوب مصممة لجهاز PCR: 10.5 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي وعشوائية هيكسامير كبسولة تفجير (3 ميكروغرام/ميليلتر) 1 ميليلتر.
  2. احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تجريدها هيكل الثانوية، وتخزينها على الجليد للحد الأدنى 2 مزيج المكونات التالية: 4 ميليلتر من المخزن المؤقت الأول-ستراند 2 ميليلتر من 0.1 م DTT، 1 ميليلتر من دنتب و 0.5 "رناسي بها". المقبل، إلى أنبوب PCR، إضافة 7.5 ميليلتر من مزيج الرئيسي. احتضان الأنبوب لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية. أضف 1 ميليلتر الثاني مرتفع (200 يو/ميليلتر) واحتضان ما يلي: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة، 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
  3. الثاني-حبلا كدنا التوليف. ضع الأنبوب على الجليد. بعد ذلك، أضف المكونات التالية بالترتيب: 91 ميليلتر من ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك) معاملة المياه، 30 ميليلتر من 5 × حبلا الثانية رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميليلتر من دنتب ميكس (10 ملم)، 1 ميليلتر من ليجاسى كولاي الحمض النووي (يو 10/ميليلتر)، 4 ميليلتر من كولاي دنا بوليميريز (10U/ميليلتر) ، و 1 ميليلتر من رناسي كولاي ح (2U/ميليلتر). مزيج من فورتيكسينج برفق واحتضان في 16 درجة مئوية ح 2.
    ملاحظة: الاختلاط بالتحريك أو عكس الأنبوب قد لا تكفي لخلط الكواشف دقة.
  4. إضافة 2 ميليلتر من T4 دنا بوليميريز واحتضان في 16 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نق كدنا (مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، دسكدنا) باستخدام أدوات تنقية PCR. الوت دسكدنا في 40 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي.
  5. كدنا بلغة مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل. القص كدنا (دسكدنا) باستخدام سونيفير حمام الماء وأنبوب 1.5 مل إلى حجم من 250-500 هناك سونيكيشن دسكدنا أمر حاسم في تقليل أحجام جزء لتسهيل تسلسل الحمض النووي الريبي نسخة كاملة.
  6. عند استخدام نموذج قياسي من سونيفير حوض ماء، sonicate العينة 3 × 10 دقيقة، أو 4 × 10 دقيقة.
    ملاحظة: يجب استخدام ثلاث دورات ليصل إلى 1 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، بينما يوصي بأربع دورات 1-5 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي الأنبوب بإيجاز بعد كل دورة سونيكيشن، والحفاظ على حمام مائي بارد بإضافة الثلج الطازج.
  7. عند استخدام سونيفير بيكو، من المستحسن استخدام ست دورات ل 1-5 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي وركوب الدراجات الشروط التالية (30 ثانية على 90 s إيقاف). الطرد المركزي في الأنبوب بإيجاز بعد 2-3 دورات sonication. يمكن تحديد كفاءة سونيكيشن بتحميل جزء من دسكدنا المنفصمة (3-4 ميليلتر) على [اغروس] هلام (2 في المائة). من المهم اختبار تجريبي الظروف سونيكيشن بسبب تقلب بين سونيفيرس.
  8. القيام بإعداد المكتبة كما هو موضح في الخطوة 6 لتسلسل الجيل القادم.

6-شرائح-Seq وبناء مكتبة Seq كاريب

  1. إصلاح نهايات الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات إصلاح نهاية الحمض النووي. يتم استخدام هذه المجموعة لإنشاء الحمض النووي انتهى بلانت. برد الفعل هذا، قم بإعداد ما يلي 1.5 مل، منخفض لربط أنبوب: 34 ميليلتر من الحمض النووي، 5 ميليلتر من دنبتس 2.5 مم، 5 ميليلتر من 10 ملم ATP، 5 ميليلتر من 10 × الإصلاح نهاية المخزن المؤقت (5 مم DTT، خلات المغنيسيوم 100 مم، خلات البوتاسيوم 660 مم ، 300 مم تريس-خلات، الأس الهيدروجيني 7.8)، و 1 ميليلتر من الإصلاح نهاية ميكس إنزيم (T4 بولينوكليوتيدي كيناز، بوليميراز الدنا T4).
  2. احتضان العينة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنظيف رد فعل. الوت نهاية إصلاح الحمض النووي في 32 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي قبل حرارة (65 درجة مئوية). بينما نحن لا كوانتيتاتي عادة تركيز الحمض النووي بعد شريحة، أو الجيش الملكي النيبالي عقب كاريب، قبل إعداد مكتبة، من المستحسن أن تبدأ مع على الأقل 5-10 نانوغرام من رقاقة الحمض النووي الريبي كاريب أو.
  4. إضافة استفحال 3 '"A" إلى نهاية إصلاح الحمض النووي. إضافة المكونات إلى 1.5 مل، أنبوب الربط المنخفض: 30 ميليلتر من الحمض النووي من فوق 5 ميليلتر من 10 × NEB المخزن المؤقت 2، 1 ميليلتر من داتب من الأسهم 10 ملم وميليلتر 11 ح2س 3 ميليلتر من 5 U/ميليلتر كلينوو بلغة (3 '-5' أكسو-) ، ومزج بلطف بيبيتينج.
  5. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. استخدام مجموعة أدوات تنظيف رد فعل لتنقية الحمض النووي. الوت الحمض النووي في 25 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي قبل حرارة (65 درجة مئوية).
  7. اضطر المحول. أضف المكونات التالية على الجليد: ميليلتر 23 من الحمض النووي من أعلى و 3 ميليلتر من T4 الحمض الخلوي الصبغي x 10 ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر ملدنة PE أو الإرسال المتعدد محول (4 ميكرومتر) 3 ميليلتر ليجاسى T4 الحمض النووي (400 ش/ميليلتر)، ومزيج بلطف قبل بيبيتينج.
    ملاحظة: كما يمكن الحصول تسلسل محول من مصدر تجاري.
    اليغنوكليوتيد تسلسل:
    محولات PE
    5 ' فجاتكجاجاجكجتكاجكاجاتجككجاج
    5 ' أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت
    محولات المتنوعة
    5 ' فجاتكجاجاجكاكاكجتكت
    5 ' أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت
  8. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. إجراء التحديد حجم الحمض النووي باستخدام هلام (2%) [اغروس] مسبقة الصب. تشغيل هلام لمدة 10 دقائق.
  10. المكوس المنطقة المقابلة لشركة بريتيش بتروليوم 250-450.
    ملاحظة: بقطع الجل أعلاه أعلاه 200 شركة بريتيش بتروليوم، هناك احتمال انخفاض التلوث من dimers محول أونليجاتيد. من المهم إزالة أي محولات أونليجاتيد قبل الخطوة PCR.
  11. استخدام أدوات استخراج هلام لتنقية الحمض النووي. الوت في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي.
  12. بكر ومكتبة وتنقية للحمض النووي الواصلة عينات تحتوي على محولات إقران-نهاية (PE). إضافة المكونات في أنبوب PCR: ميليلتر 12 من 50% من الحمض النووي من أعلى، 12 ميليلتر من الماء، 25 ميليلتر من مزيج الرئيسي (HF فوسيون)، 1 ميليلتر من التمهيدي PE PCR 1.0 و 1 ميليلتر من التمهيدي PE PCR 2.0.
    ملاحظة: كما يمكن الحصول اليغنوكليوتيد متواليات من مصدر تجاري.
    اليغنوكليوتيد تسلسل:
    PE PCR التمهيدي 1.0
    5 ' آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت
    التمهيدي PCR PE 2.0
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتكتكجكاتككتجكتجاككجكتكتككجاتكت
  13. بكر ومكتبة وتنقية للواصلة عينات تحتوي على محولات PE الفهرس. أضف المكونات: 12 ميليلتر من 50% من الحمض النووي من أعلى و 12 ميليلتر من الماء، 1 ميليلتر من التمهيدي PCR البرازيلي 1.0 (المخفف 1:2)، 1 ميليلتر من التمهيدي PCR 2.0 البرازيلي (المخفف 1:2) و 1 ميليلتر من التمهيدي PCR الفهرس (المخفف 1:2).
    ملاحظة: كما يمكن الحصول اليغنوكليوتيد متواليات من مصدر تجاري.
    اليغنوكليوتيد تسلسل:
    الإرسال المتعدد PCR التمهيدي 1.0
    5 ' آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت
    الإرسال المتعدد PCR التمهيدي 2.0
    5 ' جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت
    بكر التمهيدي مؤشر تسلسل 1-12
    بكر التمهيدي، فهرس 1
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، الفهرس 2
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكاتكجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 3
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتاجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، الفهرس 4
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتكاجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 5
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاكتجتجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 6
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاتجكجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 7
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاتكتجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، فهرس 8
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاجتجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 9
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتجاتكجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 10
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاجكتاجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، المؤشر 11
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتاجككجتجاكتجاجتك
    بكر التمهيدي، مؤشر 12
    5 ' كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكاجتجاكتجاجتك
  14. إجراء PCR ركوب الدراجات استخدام الشروط التالية (تجريدها لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، دورات 18 من 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 s عند 65 درجة مئوية، 30 s في 72 درجة مئوية، مدة 5 دقائق في 72 درجة مئوية، عقد في 4 درجات مئوية).
    ملاحظة: يجب تحديد عدد دورات PCR تجريبيا.
  15. اختيار حجم منتجات PCR. تشغيل الحمض النووي على مسبقة الصب ه-جل "السابقين" (2 في المائة) أو هلام ([اغروس]) محلية الصنع 2% والمكوس منطقة bp 300-500.
  16. استخدام أدوات استخراج هلام لتنقية الحمض النووي من الجل. الوت المنتج النهائي بكر في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للمجلس التنفيذي.
  17. استخدام فلوروميتير لقياس تركيز المكتبة. إجراء تسلسل الجيل القادم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن استجوب بنجاح الربط على نطاق الجينوم H3K4me3، و H3K4me2، و KDM5B في دإط الخلايا باستخدام هذا البروتوكول Seq رقاقة6. دإط الخلايا المستزرعة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق (الشكل 1)، وتصميمهما على النحو المبين أعلاه. سونيكيشن فيما بعد إجراء كما هو موضح في الخطوة 3، 2 من البروتوكول Seq رقاقة، وتقييمه بواسطة تشغيل الحمض النووي على 2% [اغروس] هلام (الشكل 2). المقبل، وأجرى رقاقة كما هو موضح في الخطوة 4 و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رقاقة-Seq طريقة مفيدة لتقييم موقع تفاعلات البروتين الحمض النووي العالمي (مثلاً.، عوامل النسخ/هستون تعديل التعديلات الإنزيمات/هيستون والحمض النووي) في دإط الخلايا، بينما البروتوكول Seq كاريب المطورة حديثا مفيد في استجواب الرابطة على نطاق الجينوم للكشف مع مكونات الكروماتين. رقاقة-Seq هو أداة أساسية تستخدم لتقييم المناظر الطبيعية جينية من خلايا ES وأنواع الخلايا الأخرى. نوعية Seq رقاقة ومكتبات كاريب Seq يعتمد إلى حد كبير على أجسام رقاقة الصف. يمكن تحديد مدى ملاءمة الأجسام المضادة لرقاقة Seq تجريبيا بأداء رقاقة-بكر،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل وأين الدولة الجامعة، كارمانوس معهد السرطان، منحة من الوطني للقلب والرئة والدم معهد (1K22HL126842-01A1) منحت إلى B.L.K. يستخدم هذا العمل "وأين الدولة جامعة عالية الأداء الحوسبة الشبكة" للموارد الحسابية (< https://www.grid.wayne.edu/>). ونحن نشكر كوروب جيجي للمساعدة في تحليل البيانات كاريب Seq.

مساهمات المؤلفين:

B.L.K. تصور طريقة Seq كاريب وصممت ونفذت تجارب Seq رقاقة و Seq كاريب وتحليل البيانات التسلسل وصياغة المخطوط. جميع المؤلفين قد قرأت ووافقت الصيغة النهائية لهذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
العامل المثبط لسرطان الدم في الفأر (ESGRO LIF)EMD Millipore106 < / sup>or 107 < / sup>units
GSK3 & beta CHIR99021 المثبط (GSK3i)المذيب الجذعي: DMSO 10mM
مثبط MEK PD0325901 (MEKi)المذيب الجذعي: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، ارتفاع الجلوكوزInvitrogen11965092
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)Invitrogen10010031
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمرGibco25200056
البنسلين - ستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)جيبكو15140122
2-ميركابتو إيثانول (50 مل) جيبكو31350010
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X)جيبكو11140076
EmbryoMax ES خلية مصل بقري للجنين المؤهل ، 500 ملEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0.1٪ محلول جيلاتينEMD MilliporeES-006-B
GlycineSigmaG7126-500G1.25 M conentration مخزون في
الماء محلول الفورمالديهايدSigmaF8775-500ML
TE (Tris EDTA) الرقم الهيدروجيني 8.0 1Xالجودة البيولوجية351-011-131
محلول فلوريد فينيل ميثان سولفونيل (PMSF)Sigma93482-250ML-F
cOmplete مثبط البروتياز كوكتيلروش11697498001
محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم (20٪) الجودةالبيولوجيةA611-0837-10
Q125 سونيفيرQsonica4422
محلول Triton X-100Sigma93443-100ML
ديوكسي كولات الصوديومSigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Protein G لترسيب المناعةInvitrogen10004D
Dynabeads Protein A للترسيب المناعيInvitrogen10002D
Dynabeads Protein A / Protein G و حزمة كاتب المغناطيسInvitrogen10015D
كلوريد الليثيومSigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini KitQiagen74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (لتنقية mRNA من إجمالي استعدادات الحمض النووي الريبي)Invitrogen61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis مجموعةInvitrogen11917010
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
End-It DNA End-It End-It DNA Finish RepairKit LucigenER81050
Klenow Fragment (3'→ 5 'exo-) NEBM0212L
dATP (10 ملم)Invitrogen18252015
T4 DNA ligaseNEBM0202L
TrackIt 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويInvitrogen10488085
هلام E-gel EX agarose ، 2٪InvitrogenG402002
Phusion عالية الدقة 2X مزيج رئيسي مع HF عازلةThermo FisherF531LPM
ChIPAb + Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - الجسم المضاد الذي تم التحقق من صحة ChIPEMD Millipore17-614
الأجسام المضادة للهيستون H3 (ثنائي ميثيل K4) [Y47] - ChIP Grade (ab32356)Abcamab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6 آبار)القياسية Fisher
Falcon (10 سم)Fisher08772E
Bioruptor بيكوDiagenodeB01010001
Qubit Flurometer 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
MinElute Reaction CleanupQiagen28204
MinElute Gel Extraction KitQiagen28604
الأجسام المضادة للهيستون H4 (ثلاثي ميثيل K20) - درجة ChIP (ab9053)Abcamab9053
Labquake الدوارThermo Fisher400110Q
منصة Illumina HiSeqIllumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238
أطباق زراعة الأنسجة 720083 Kit

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32(2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28(2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة