مقالة منهجية

إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

DOI:

10.3791/57491

⸱

يونيو 17, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology at Irkutsk State University, 2Institute of Biology at Karelian Research Centre of Russian Academy of Sciences, 3Baikal Research Centre, 4Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology, and Research (A*STAR), 5University of Oulu, Optoelectronics and Measurement Techniques Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا المقالة مبادئ حقن سريعة، وكسبها من الفلورسنت المجهرية الدقيقة في circulatory system الأسماك الصغيرة والتصور في فيفو من المجهرية الدقيقة في دم الأسماك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تطبيق الإدارة النظامية للجسيمات الصغيرة الحجم في حي للتصور المفرج، العقاقير واللقاحات، زرع الخلايا المحورة وراثيا وأجهزة الاستشعار البصرية صغيرة. ومع ذلك، ميكروينجيكشنز عن طريق الحقن الوريدي في الحيوانات الصغيرة، والتي تستخدم في الغالب في المختبرات البيولوجية والبيطرية، صعبة جداً وتتطلب موظفين مدربين. هنا، نحن تثبت طريقة قوية وفعالة لإدخال المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية للكبار الزرد (دانيو rerio) بحقن في الكلي الأسماك. تصور المجهرية الدقيقة أدخلت في المفرج، نقترح تقنية تصوير إينترافيتال بسيطة في الخياشيم السمكية. في فيفو رصد درجة الحموضة الدم الزرد كان إنجازه باستخدام الفلورية المغلف حقن التحقيق، سنارف-1، لإثبات واحدة من التطبيقات الممكنة لوصف تقنية. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً لتغليف صبغة حساسة لدرجة الحموضة ويوضح مبادئ حقن سريعة والتصور كبسولات رقيقة جداً التي تم الحصول عليها في فيفو تسجيل إشارة الفلورسنت. تتميز الطريقة المقترحة لحقن بمعدل وفيات منخفض (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما. يمكن تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة في أنواع الأسماك الصغيرة الأخرى، مثل أسماك الغابى والميداكا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إدارة الجسيمات الصغيرة الحجم في جسم حيوان مهمة هامة في مجالات مثل المخدرات و تسليم اللقاحات1والمفرج التصور2و زرع الخلايا المحورة وراثيا3وزرع أجهزة الاستشعار البصرية صغيرة 4 , 5-إجراءات غرس جسيمات microscale في نظام الأوعية الدموية في الحيوانات المختبرية الصغيرة غير صعبة، خاصة بالنسبة للكائنات المائية الحساسة. لعينات البحث شعبية مثل الزرد، فإنه ينصح أن يكون توضيح هذه الإجراءات باستخدام بروتوكولات الفيديو.

ميكروينجيكشنز إينتراكاردياك والشعرية تتطلب موظفين مدربين ومرافق الجراحة فريدة لتقديم ميكروبجيكتس في الدم الزرد. سابقا، قد اقترح حقن يدوي الرجعية-المداري3 كطريقة سهلة وفعالة لإدارة كل الخلايا. ومع ذلك، في تجربتنا، بسبب صغر مساحة الشبكة الشعرية العين، يستغرق الكثير من الممارسات لتحقيق النتيجة المرجوة من هذا الأسلوب.

هنا، نحن تصف طريقة لغرس يمثل قوية وفعالة في نظام الدورة الدموية عن طريق الحقن اليدوي مباشرة في أنسجة الكلي الزرد الكبار، وغنية بالشعيرات الدموية والأوعية الكلوية. يستند هذا الأسلوب على البروتوكول الفيديو لزرع الخلايا في الكلي الزرد6، ولكن تم القضاء على الخطوات microsurgical مؤلمة وتستغرق وقتاً طويلاً. الطريقة المقترحة تتسم بانخفاض معدل الوفيات (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما.

جزء هام من البروتوكول المقترح هو التصور من مزروع المجهرية الدقيقة (إذا كانوا الفلورسنت أو الملونة) في الشعيرات الدموية الخيشومية، مما يسمح لتحقق نوعية الحقن، وإجراء تقييم نسبي تقريبي لعدد حقن الجسيمات، والكشف عن إشارة الطيفية للقياسات الفسيولوجية مباشرة من الدم الجائل. كمثال للتطبيقات الممكنة لوصف تقنية، نبدي البروتوكول في فيفو قياسات pH دم الزرد استخدام مجس فلورسنت المغلف، سنارف-1، اقترح أصلاً في بورفينسكايا وآخرون. 20175.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات التجريبية أجريت وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي للتجارب على الحيوانات، ووافق عليها "الحيوان مواضيع البحوث اللجنة من معهد علم الأحياء" في إركوتسك جامعة ولاية.

1-تصنيع كبسولات رقيقة جداً

ملاحظة: تعد كبسولات رقيقة جداً تحمل صبغة فلورسنت استخدام جمعية طبقة بطبقة مكونة من7،بولييليكتروليتيس المشحونة معاكس8. وأجريت جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة.

  1. لتوليف المسامية ميكروكوريس3 كربونات أرفق صبغة الفلورسنت، مزيج 2 مل الحل سنارف-1-ديكستران (يمكن استخدام معظم صبغة الفلورسنت البوليمر زمنياً مثل فيتك-جيش صرب البوسنة) بتركيز ~ 2 مغ/مل مع 0.6 مل كل حل من الحلول 1 مول/لتر من كاكل2 و Na2CO3 تحت التحريك السريع.
    ملاحظة: إيلاء اهتمام لحساسيات مختلفة من الأصباغ الفلورية إلى فوتوبليتشينج؛ إذا كان يتم استخدام مجس فلورسنت حساسة للضوء (مثل سنارف-1)، فلابد من التلاعب وتخزين المجهرية الدقيقة مع كالقليل من الضوء قدر الإمكان.
  2. بعد 5-10 ق من الانفعالات، نقل التعليق 2 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ق في 10,000-12,000 ز بيليه ميكروكوريس3 كربونات الكالسيوم.
  3. تجاهل المادة طافية ويغسل النوى مع ~ 2 مل مياه ريسوسبيند بيليه بالهز.
  4. كرر الإجراء الطرد المركزي والغسل ثلاث مرات في المجموع. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
  5. احتضان ميكروكوريس لمدة 1 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية للحد على التجميع.
    تنبيه: لا تنسى لحماية الأذنين مع سماعات الرأس.
  6. أن تودع في الطبقة الأولى البوليمر على القوالب ريسوسبيند النوى في مل ~ 2 حل 4 مغ/مل من poly(allylamine hydrochloride) (PAH) في 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم.
    1. الحفاظ ميكروكوريس في الحل لدقيقة ~ 5 مع الرج المستمر.
    2. وبعد 15 ثانية للطرد المركزي، تجاهل المادة طافية مع الهيئة العامة للإسكان غير منضم. أغسل ميكروكوريس مغطاة بالمياه على الأقل 3 مرات عن طريق الطرد المركزي متعددة والغسيل الخطوات. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
    3. احتضان ميكروكوريس لمدة 1 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية للحد على التجميع.
      ملاحظة: إذا كانت صبغة الفلورسنت التطبيقية الأيوني، بدء من بولي (الصوديوم 4-ستيرينيسولفوناتي) (PSS) في 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم (راجع الخطوة 1، 7).
  7. كرر الخطوة 1.6 مع مل ~ 2 حل 4 مغ/مل من PSS (كما تحتوي على 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم) بإيداع الطبقة الثانية البوليمرية في القوالب.
  8. كرر الخطوات من 1.6 و 1.7 ست مرات بإيداع 12 طبقات البوليمر.
    ملاحظة: لا ينصح لتأخذ استراحة طويلة (ح ~ 12 أو أكثر) قد تم إيداع في الإجراء حتى ~ 3-5 طبقات لكربونات الكالسيوم3 ميكروكوريس دون تغطية قد تميل إلى ريكريستاليزي. ملاحظة أن التغطية PSS الأسباب تجميعاً أعلى من ميكروكوريس، ووقفه طويلة من المستحسن إلا عند الهيئة العامة للإسكان أو بولي-L-يسين المطعمة بالبولي إيثيلين غليكول (PLL-ز-شماعة) هي طبقة قصوى.
  9. احتضان ميكروكوريس المغطاة في 2 مغ/مل PLL-ز-شماعة (~ 1 مل كل microtube) على الأقل ح 2.
    1. أغسل ميكروكوريس بالمياه عن طريق الطرد المركزي متسلسلة واستثارة الخطوات. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
  10. للحصول على كبسولات رقيقة جداً جوفاء، حل القوالب3 كربونات الكالسيوم بإضافة 2 مل من 0.1 mol/L الإيثيلين حمض (يدتا) الحل (المعدل للأس الهيدروجيني 7.1 مع هيدروكسيد الصوديوم) إلى ميكروكوريس مغطاة.
    1. بعد دقيقة ~ 5 من الحضانة، الطرد المركزي كبسولات رقيقة جداً 45 ثانية وتجاهل المادة طافية مع يدتا.
    2. كرر الخطوات من 1، 10-1.10.1 مرتين.
  11. أغسل كبسولات رقيقة جداً مع 0.9% كلوريد الصوديوم ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عدة خطوات داخل 45 s متبوعاً بالغسيل الخطوات. بعد آخر خطوة الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: الحل النهائي ميكروكابسولي للحقن يجب أن تظل عقيمة (على سبيل المثال عن طريق إضافة الأمبيسلّين، 0.1 مغ/مل)، ووسائل الإعلام يجب أن يكون متوافق حيويا هدف التحقيق (وسائل الإعلام متساوي التوتر مع الأس الهيدروجيني المحايدة).
  12. تقدير تركيز استعداد كبسولات رقيقة جداً في هيموسيتوميتير تحت مجهر الأسفار. اتخاذ سلسلة من الصور من كبسولات رقيقة جداً وقياس القطر حول استخدام البرمجيات9 أو ما يعادلها ImageJ كبسولات رقيقة جداً مائة التحقيق في توزيع حجم استخدام الرسم بياني.
  13. متجر الحصول على تغليف المسبار في الظلام.
    ملاحظة: بعد عدة الغسالات في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم، يمكن تخزينها في كبسولات رقيقة جداً لمدة أشهر في 4 درجات مئوية. لا ينصح بتجفيف كاملة من كبسولات رقيقة جداً أثناء التخزين.

2-إعداد الإعداد الضوئية ومعايرة المغلف سنارف-1

ملاحظة: قياسات pH الخام مع المغلف سنارف-1 يمكن إجراء باستخدام الصور في قناتين ل مجهر فلوري7، ولكن في هذا البروتوكول مجهر فلوري قناة واحدة متصلة مطياف ألياف طبق.

  1. ضع المجموعة المطلوبة من مرشحات الأسفار إلى مجهر فلوري وفقا لخصائص صبغة الفلورسنت التطبيقية وتشغيل المصابيح الفلورية.
    1. سحب الرافعة للعدسات.
      تنبيه: الخفيفة الزائدة يمكن أن تلحق الضرر مصفوفة مطياف. وهكذا، تأكد من أن الذراع في وضع "عينية" عندما لا يستخدم في المطياف.
    2. الاتصال واحدة من نهاية الألياف الضوئية والمطياف والطرف الآخر لصيد تلسكوب. استخدام محولات، مكان صيد تلسكوب في تركيز أنبوب الكاميرا أو منفذ آخر متاح من مجهر فلوري.
    3. قم بتشغيل والمطياف. قم بتشغيل برنامج مراقبة مطياف وإعداد والمطياف للقياسات.
  2. لمعايرة دفعة ميكروكابسولي، ضع ~ 5 ميليلتر من تعليق ميكروكابسولي (000 ~ 10 كبسولات رقيقة جداً كل ميليلتر في المياه) على شريحة مجهر، والجاف للهبوط في مكان مظلم (على سبيل المثال، في الحرارة على 35 درجة مئوية).
    1. لمعايرة خصائصها الطيفية المغلف سنارف-1، استخدم سلسلة من المخازن المؤقتة مع قيم الأس الهيدروجيني مختلفة في النطاق ~ 6-9. إسقاط ~ 10 ميليلتر من المخزن المؤقت إلى المجفف كبسولات رقيقة جداً مع سنارف-1-ديكستران وتغطية ذلك مع ساترة.
    2. ضع الشريحة الزجاجية في مرحلة المجهر. قم بتحديد موقع كبسولات رقيقة جداً استخدام هدفا 40 ×.
    3. تشغيل ذراع المجهر إلى منفذ الكاميرا. تسجيل هذه الأسفار مع والمطياف. قم بتشغيل الرافعة مرة أخرى إلى العدسات.
      ملاحظة: تأكد من إشارة الطيفي أبعد من مستوى الخلفية، والتأكد من أن كبسولات رقيقة جداً في مجال الرؤية ليست في فقاعة (عن طريق التحول إلى تكبير السفلي إذا لزم الأمر). تجنب الإضاءة فترات طويلة من كبسولات رقيقة جداً نفس. سنارف-1 حساس فوتوبليتشينج.
    4. كرر الخطوة 2.2.3 كبسولات رقيقة جداً مختلفة من 10-15 مرة.
  3. حساب نسب ذروة الأسفار (على سبيل المثال، استخدام R أو Scilab) لجميع أطياف المسجلة وتحديد خط الانحدار بين المعدل الوسيط (لكل المخزن المؤقت) ومتوسط الرقم الهيدروجيني باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: قد سنارف-1 طائفة مع قمم اثنين المقابلة لانبعاث صبغ البروتونية وديبروتوناتيد، والنسبة بين القمم تستجيب للرقم الهيدروجيني للوسط. في هذه الدراسة، يتم استخدام النسبة بين كثافة الأسفار ل 605 و 660 شمال البحر الأبيض المتوسط. ويتم اختيار هذه الأطوال الموجية اعتماداً على مجموعة عوامل التصفية المستخدمة. و ب معاملات يحددها الانحدار غير الخطي (على سبيل المثال، باستخدام البحث والتطوير). القيم 0.15 و 1.1 هي، على التوالي، قيم الحد الأدنى والحد الأقصى أنا605/I660 ولاحظ أثناء المعايرة.
  4. جمع حوالي 10 ميليلتر من الدم الأسماك من الحيوانات الكبار حوالي 5. مكان السمك في طبق بتري مع 1 ميليلتر/مل المياه تعليق زيت القرنفل للتخدير والانتظار حتى يتحول على جانبها الحيوان وتوقف عن الاستجابة القرصات زعنفة (عادة ~ 2-3 دقيقة). نقل الأسماك على شريحة زجاج. قطع ذيل سمكة مع مجلة لانسيت، وجمع حوالي 2 ميليلتر من الدم الأسماك من هذا السياق الذيل.
    ملاحظة: لمنع تخثر الدم، علاج الشق مع الهيبارين (5000 U/mL) واستخدام الزجاج هيبارينيزيد الشعيرات الدموية وأنابيب ميكروسينتريفوجي لجمع الدم.
    1. التنقيط حوالي 10 ميليلتر من الدم مع ماصة على غيض من ميكروليكترودي وتحديد الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
    2. قطره دم إلى شريحة مع المجفف كبسولات رقيقة جداً، وسجل نسبة كثافة الأسفار كما هو موضح للمخازن المؤقتة المعايرة (الخطوات 2، 2، 2-3).
  5. ضبط المعامل الخطي على منحنى المعايرة لجعل المنحنى يتطابق مع القياسات في دم الأسماك (لمزيد من التفاصيل انظر بورفينسكايا وآخرون عام 20175).

3-التحضير للحقن

  1. الإفراج عن إبرة الصلب من طرف القلم الأنسولين (أو حقنه) عن طريق إزالة البلاستيك مع انسيت حادة.
    ملاحظة: أي إبرة رقيقة (Ø0.33 ملم أو أقل) أو الزجاج الشعرية (عادة Ø1 مم) يمكن أن تكون مستعدة ل microinjection10،11.
  2. أدخل الإبرة في منتصف الطريق في ميكروكابيلاري الزجاج؛ بسرعة ولطف جندي باستخدام شعلة غاز.
  3. الاتصال ميكروكابيلاري الزجاج ميكروينجيكتور ومسح بالماء المعقم ثلاث مرات. ضمان تدفق السائل من خلال الإبرة.
  4. ملء هذا النظام مع الماء المقطر.
    ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات في النظام.

4-حقن

  1. ريسوسبيند تعليق استعداد كبسولات رقيقة جداً (من العقيمة 0.9% استخدام كلوريد الصوديوم، أو أية وسائط أخرى للحقن، مع تركيز من 0.5 إلى 6 مليون كبسولات رقيقة جداً الواحد ميكروليتير) استخدام الحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: منذ كبسولات رقيقة جداً تميل إلى أن يعجل، من خلال حقن التالية، تهز القنينة مع كبسولات رقيقة جداً ميكانيكيا (باستخدام دوار) أو يدوياً كل بضع دقائق ريسوسبيند لهم ومنع على التجميع.
  2. ضع السمك في طبق بتري مع مخدر (0.1 مل/لتر زيت القرنفل معلقة في الماء) ~ 2-3 دقيقة انتظر حتى الأسماك يتحول على جانبها وتوقف عن الاستجابة إلى رشة خفيفة fin.
  3. باستخدام ملعقة، نقل الأسماك من المخدر ووضعه برفق على اسفنجة رطبة في موقف أفقي مع الرأس نحو اليسار (للشخص اليد اليمنى) أو نحو اليمين (بالنسبة لشخص أعسر).
  4. قبل الحقن، تمتص 1-2 مم هواء إلى الزجاج الشعرية المرتبطة ميكروينجيكتور. ثم تحميله مع حوالي 2 ميليلتر من كبسولات رقيقة جداً فرقت.
    ملاحظة: قبل الحقن، يجب تعديل الحل ميكروكابسولي إلى درجة الحرارة التي يتم الاحتفاظ الأسماك.
  5. بلطف استقرار جسم الأسماك في الأسفنج مع جهة غير المهيمنة.
    1. البحث عن الخط الجانبي للأسماك. حدد جزء الذي يمتد من operculum إلى نهاية تجويف البطن عقلياً. العثور على الوسط من هذا الجزء. وضع الإبرة 1 ملم أقل في اتجاه البطني.
    2. مع حركة القشط، تحرك بلطف السمك جداول جانبا، وجعل ثقب. أدخل الإبرة في الجسم بزاوية 45 ° إلى السطح الجدول.
    3. دفع الإبرة نحو العمود الفقري ثم ضعه بعناية ضدها.
    4. الإفراج عن حوالي 1 ميليلتر من تعليق كبسولات رقيقة جداً في الكلي، وسحب الإبرة ببطء.
      ملاحظة: للعثور على الموقع الصحيح ثقب بسهولة أكبر، أنها مفيدة للممارسة إيجاد الكلي الجذع ترانسيلوميناتينج الأسماك باستخدام ضوء السفلي، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2 باء.
  6. يشطف السمك من الرأس إلى الذيل مع تيار الماء لإزالة أي كبسولات رقيقة جداً المنسكب في موقع الحقن.

5. التصور في فيفو

  1. استخدام مقص تشريح لإزالة غطاء الخياشيم من رأس السمك وأنصارها الخياشيم السمكية. شطف الخياشيم مع الماء.
  2. باستخدام ملعقة، نقل الأسماك إلى شريحة مجهر، ووضعه في مرحلة مجهر فلوري.
    ملاحظة: تأكد من أن خياشيم الأسماك لم تجف خلال الإجراءات المتعاقبة. لتجنب هذا الأمر، بشكل دوري ترطيب لهم مع المياه باستخدام ماصة باستور (تقريبا كل دقيقة 1-2).
  3. تلقي بظلالها الغرفة واستخدام التكبير المنخفض (× الهدف 10) تفقد الخياشيم للعثور كبسولات رقيقة جداً الفلورسنت.
    ملاحظة: عند استخدام هذا الإجراء لإدخال بعض الجسيمات الفلورية في الأسماك الدموية، من المستحسن لتفقد الخياشيم للعديد من الأفراد للجسيمات الفلورية غير متوقعة قبل الحقن. لا تملك خياشيم الزرد البرية من نوع أوتوفلوريسسينسي، ولكن في بعض الحالات المتفرقة الجسيمات الفلورية (مثل قطع الطعام أو أحادي الخلية سيمبيونتس) قد تكون موجودة على الخياشيم. إذا الضرورية، مثل هذه الجسيمات يمكن التعرف عليها استناداً على شكل معين (على سبيل المثال، قد قطع الغذاء شكل منتظم، على عكس كروية كبسولات رقيقة جداً) أو الطيف الأسفار (أي لون).
    1. تبديل العدسة إلى قوته أعلى (الهدف × 40)، وموقف ميكروكابسولي أو مجموعة من كبسولات رقيقة جداً في مركز مجال الرؤية.
    2. تشغيل الذراع إلى الميناء مع مطياف متصلة. تسجيل إشارة الطيفية.
    3. قم بتشغيل الرافعة مرة أخرى إلى العدسة.
    4. كرر القياسات مختلفة كبسولات رقيقة جداً عدة مرات.
  4. نقل الأسماك إلى حوض السمك مع التهوية المناسبة للانتعاش.
    ملاحظة: مع الحد الأدنى من الممارسة، من الممكن القيام بالحقن وإشارة تسجيل معدل تقريبي من 2-3 دقيقة لكل الأسماك. يمكن تكرار القياس واحد فردية عدة مرات باستخدام جرعات منخفضة، غير مؤذية المتكررة للتخدير أو أسلوب آخر للتثبيت. للمراقبة طويلة الأجل، واستخدام نظام مع التخدير المستمر12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأتي النتائج التي تم الحصول عليها من واحدة من الفئات الرئيسية الثلاث للبروتوكول المقدم: تشكيل المجهرية الدقيقة الفلورسنت بتغليف صبغة الفلورسنت (الشكل 1)، حقن كبسولات رقيقة جداً مع مزيد من المرئيات في الكلي جيل الشعيرات الدموية (الشكل 2 و 3) و، أخيرا، في فيفو الطيفية تسجيل الأسفار سنارف-1 لمراقبة الدم مستويات الأس الهيدروجيني (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وللتدليل على الحقن المجهرية الدقيقة في الكلي الزرد، استخدمنا شبه نفاذية كبسولات رقيقة جداً محملة صبغ مؤشر. وهكذا، يتضمن البروتوكول إرشادات لتصنيع كبسولات رقيقة جداً استخدام الجمعية طبقة بطبقة polyelectrolytes المشحونة معاكس7،8،،من1516،17 ،18 (الشكل 1A). استفادة من هذه التكنولوجيا أنه من السهل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف الاعتراف إلى حد كبير مساعدة بوغدان أوسادتشيي وقد بروتاسوف (جامعة ولاية إيركوتسك، روسيا) في إعداد البروتوكول الفيديو. وأيد هذا البحث "المؤسسة الروسية" للعلوم (#15-14-10008) و "مؤسسة روسية" عن "البحوث الأساسية" (#15-29-01003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SNARF-1-dextrain ، 70000 ميجاواتمسبار الفلورسنت Thermo Fisher ScientificD3304. يمكن استخدام أي صبغة فلورية أخرى مناسبة مرتبطة بالبوليمر كحشو كبسولة دقيقة
مترافق الألبومين والفلورسين إيزوثيوسيانات (FITC-BSA)SIGMAA9771مسبار الفلورسنت
Rhodamine B isothiocyanate-Dextern (RITC-dextran)SIGMAR9379مسبار الفلورسنت
كلوريد الكالسيومSIGMAC1016CaCO3< / sub> تشكيل
القوالبكربونات الصوديومSIGMAS7795CaCO3< / sub> تشكيل قوالب
بولي (هيدروكلوريد أليلامين) ، MW 50000 (PAH)SIGMA283215بوليمر كاتيوني
بولي (صوديوم 4-ستايرينسولفونات) ، MW 70000 (PSS)SIGMA243051بوليمر أنيوني
بولي إل ليسين [20 كيلو دالتون] مطعمة بالبولي إيثيلين جلايكول [5 كيلو دالتون] ، ز = 3.0 إلى 4.5 (PLL-g-PEG)SuSoSPLL (20) - ز [3.5] -PEG (5)البوليمر النهائي لزيادة التوافق الحيوي للكبسولات الدقيقة
كلوريد الصوديومSIGMAS8776لإذابة البوليمرات المطبقة
نظام تنقية المياهMilliporeSIMSV0000لتحضير الماء منزوع الأيونات
المحرك المغناطيسيSteglerلتشكيل
قوالب CaCO3< / sub>Eppendorf  البحوث  ماصة زائدة، 1000 وميكرو؛ حلولالجرعاتل Eppendorf
Eppendorf  البحوث  بالإضافة إلى ماصة ، 10 & ميكرو ؛ حلولالجرعاتL Eppendorf
أطراف الماصة ، نطاق الحجم 200 إلى 1000 & LF.L. حلولالجرعاتالطبية 28093
أطراف الماصة ، نطاق الحجم 0.1-10   ؛ مو حلولالجرعاتZ640069 Eppendorf
أجهزة الطرد المركزي الصغيرة Microspin 12 ،BioSanلإجراء الغسيل بالطرد المركزي للكبسولة
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 2 ملEppendorfZ666513تخليق وتخزين
خلاط Intelli-خلاط RM-1LELMY Ltd.للحد من تجميع الكبسولة
الدقيقة منظفللحد من تجميع الكبسولات الدقيقة
هواتف الرأس  لحماية الأذنين من الموجات فوق الصوتية
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكSIGMAEDSلإذابة قوالب CaCO3< / sub>
فوسفات أحادي الصوديومSIGMAS9638تحضير مخازن الأس الهيدروجيني
فوسفات ثنائي الصوديومSIGMAS9390تحضير مخازن الأس الهيدروجيني
هيدروكسيد الصوديومSIGMAS8045لضبط درجة الحموضة لمحلول EDTA والمخازن المؤقتة
غرفة ترموستاتلتجفيف الكبسولات الدقيقة على شريحة زجاجية
تعداد خلايامقياس الدم للتحقيق في حجم وتوزيع وتركيز الكبسولات الدقيقة المحضرة
مجهر الفلورسنت Mikmed 2LOMOفي الجسم الحي تصور الكبسولات الدقيقة في دم الأسماك
مجموعة من مرشحات الفلورسنت ل SNARF-1 (يجب اختيارها اعتمادا على طراز المجهر ؛ يتم تقديم مثال)Chroma79010تصور الكبسولات الدقيقة مع مجسات الفلورسنت
مطياف الألياف QE Proبصرياتمعايرة الكبسولات الدقيقة تحت المجهر
الألياف الضوئية QP400-2-VIS NIR ، 400 & mu ؛ م ، 2 مبصرياتلتوصيل مقياس الطيف بمنفذ المجهر
الموازاة F280SMA-AThorlabsلتوصيل مقياس الطيف بمنفذ المجهر
المجهر الزجاجيFisherbrand12-550-A3معايرة الكبسولات الدقيقة تحت المجهر
أغطية ، 22 × 22 مملؤلؤةMS-SLIDCVمعايرة الكبسولات الدقيقة تحت المجهر
الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية Intra MARK ، 10 & micro ؛ LBlaubrandBR708709لجمع دم السمك
زيت القرنفلSIGMAC8392تخدير الأسماك
لانسيت رقم 11Apexmed international BVP00588لقطع ذيل السمكة وتحرير الإبرة الفولاذية من طرف حاقن الأنسولين الذاتي
الهيبارين ، 5000 U / mLCalbiochemL6510-BCلعلاج جميع الأسطح التي تتلامس مع دم الأسماك أثناء جمع دم الأسماك
Seven 2 Go Pro pH-meter مع قطب كهربائي دقيقMettler Toledoلتحديد درجة الحموضة في دم الأسماك
إبر قلم الأنسولين Micro-Fine Plus ، 0.25 × 5 ممبيكتون وديكنسون وشركاهلإجراء الحقن. أي إبرة رقيقة (Ø 0.33 مم أو أقل) مناسبة
الشعيرات الدموية الزجاجية, 1 × 75 ممHirschmann Laborgerä te GmbH & Co9201075لإجراء الحقن
شعلةلحام إبرة فولاذية إلى حاقن زجاجي شعري
دقيق IM-9BNARISHIGEللحصول على جرعات دقيقة من كبسولات دقيقة معلقة
أطباق بتري ، 60 مم × 15 مم ، البوليسترينSIGMAP5481للتلاعب بالأسماك تحت التخدير
ملعقةبلاستيكيةللتلاعب بالأسماك تحت التخدير
إسفنجةللتلاعب بالأسماك تحت التخدير
مقص تشريحThermo Scientific31212لإزالة غطاء الخياشيم من رأس السمكة
ماصة باستور ، 3.5 ملZ331767لترطيب خياشيم السمك
عالي السرعة الدقيقة بالموجات فوق الصوتية غرفة الدم المحيطات المحيط شريحة غاز رطبة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
  2. Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
  3. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
  4. Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427(2016).
  5. Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
  6. Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).
  7. Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
  8. Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
  9. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
  10. Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).
  11. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960(2008).
  12. Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).
  13. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).
  14. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
  15. Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
  16. Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
  17. Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
  18. Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
  19. Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microparticle InjectionFish KidneyIntravital ImagingMicrocapsule PreparationFluorescent ProbeBlood pH MonitoringZebrafish Circulatory SystemLayer by Layer EncapsulationGill VisualizationSpectral Analysis

مقالات ذات صلة