هنا نستخدم الأبعاد شبه يشوه [اغروس] هلام التفريد لتأكيد وجود ألياف اميلويد مثل الحجم غير المتجانسة، واستبعاد إمكانية أن يعود إلى التباين في حجم الانفصال الألياف اميلويد خلال الجل العملية قيد التشغيل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ألياف اميلويد أو اميلويد تشبه ارتبطت بالعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، والآن يجري اكتشافها مهما للعديد من مسارات الإشارات. القدرة على اكتشاف سهولة تكوين هذه الألياف تحت الظروف التجريبية المختلفة أمر ضروري لفهم وظيفتها المحتملة. وقد استخدمت العديد من الأساليب للكشف عن الألياف، ولكن لا يخلو من بعض العيوب. على سبيل المثال، الميكروسكوب الإلكتروني (م)، أو تلطيخ مع أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين غالباً ما يتطلب تنقية الألياف. من ناحية أخرى، يتيح شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد (SDD-العمر) الكشف عن الألياف اميلويد تشبه المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي في مقتطفات الخلية دون تنقية. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يسمح مقارنة الفرق حجم الألياف. الأهم من ذلك، يمكن استخدامه للتعرف على بروتينات محددة داخل الألياف من النشاف الغربية. وأقل استهلاكاً للوقت وأكثر سهولة لعدد أوسع من مختبرات. غالباً ما تظهر النتائج SDD-العمر متغير درجة من عدم التجانس. فإنه يثير المسألة ما إذا كان جزء من التباين النتائج من التفكك للبروتين معقدة أثناء التفريد حضور الحزب الديمقراطي الصربي. لهذا السبب، نحن قد استخدمت بعد ثاني من SDD-سن لتحديد ما إذا كان تباين حجم ينظر في SDD-العمر حقاً نتيجة للألياف عدم التجانس في فيفو وليس نتيجة لتدهور أو تفكك بعض البروتينات خلال التفريد. يسمح هذا الأسلوب تأكيد سريعة ونوعية الألياف اميلويد أو مثل اميلويد هي لا الناي جزئيا خلال عملية SDD-العمر.
المقدمة
منذ فترة طويلة كان معروفا تشكيل ألياف اميلويد بسبب البروتين misfolding لتلعب دوراً في ظروف مرضية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون1. في الآونة الأخيرة، قد تبين تشكيل ألياف اميلويد أو اميلويد مثل أن تكون جزء من مسارات الإشارات في البشر، بما في ذلك من خلال الاستجابة المناعية الفطرية المضادة للفيروسات2 ونيكروبتوسيس3،4، وفي انخفاض الكائنات الحية مثل الخميرة5،6. ولذلك، من المهم القدرة على الكشف عن هذه الألياف في المعمل. حاليا، هناك ثلاثة طرق رئيسية للكشف عن اميلويد وألياف اميلويد مثل: استخدام الأصباغ، وطب الطوارئ و SDD-العمر.
ويتيح استخدام الأصباغ، مثل أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين، تتميز بأنها سريعة ويمكن كشفها بسهولة باستخدام الفحص المجهري أو التحليل الطيفي7. ومع ذلك، يوفر الكشف عن طريق الفحص المجهري، وفي حالة الكونغو الحمراء، خصوصية لا التي تشمل بروتينات الألياف، أو حجم الألياف. وبالمثل، يوفر استخدام التحليل الطيفي للكشف عن ربط أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين إلى مجمعات البروتين فقط نتيجة إيجابية أو سلبية.
م توفر أدلة قاطعة على وجود الألياف وكمية من المعلومات حول الألياف طولها وقطرها8أيضا. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تنقية صارمة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، أم هو أسلوب متخصصة الذي يستخدم معدات باهظة الثمن.
وقد استخدمت SDD-العمر للكشف عن مجمعات البروتين المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي دالتون الضخمة بما في ذلك ألياف اميلويد أو مثل اميلويد. ويوفر العديد من المزايا. أولاً، أنها لا تتطلب تنقية الألياف ومن السهل peform9. ثانيا، فإنه يوفر معلومات نوعية عن الحجم الألياف، بما في ذلك الحجم النسبي وكمية من الألياف هيتيروجينيسيتي. وأخيراً، لأنه يمكن أن يؤديها النشاف الغربية بعد التفريد، فمن السهل الكشف عن وجود أي البروتين الذي يوجد جسم، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أنه نظراً لأن يشوه شبه SDD-العمر، بعض [ابيتوبس] قد تظل أخفى الذي يعقد الكشف بالضد.
في الآونة الأخيرة، أبلغ مستقبلات التفاعل البروتين كيناز 1 (RIPK1) و 3 (RIPK3) على شكل ألياف اميلويد لتكون بمثابة إشارات المنصات خلال نيكروبتوسيس، نموذج مبرمجة من نخر3. أثناء دراسة هذه الألياف، لدينا مختبر أظهرت أن آخر البروتين المرتبطة نيكروبتوسيس، خلط النسب كيناز مثل المجال (ملكل)، وشكلت أيضا ألياف اميلويد مثل4. ومع ذلك، عند الفحص مع SDD-العمر، ظهرت حجم الألياف ملكل متميزة من ألياف RIPK1 و RIPK3، التي بدت متطابقة مع بعضها البعض (الشكل 1). وكان هذا غير متوقع لأنه من المعروف جيدا أن يربط ملكل RIPK1/RIPK3 لتشكيل نيكروبتوسيس إشارة معقدة تسمى نيكروسومي10.
وهناك مالا يقل عن اثنين من التفسيرات. أولاً، قد تشكل ألياف اميلويد تشبه تماما متميزة اثنين أثناء نيكروبتوسيس، واحدة تحتوي على RIPK1/RIPK3 وملكل الأخرى التي تحتوي على. ثانيا، هو نوع واحد فقط من ألياف اميلويد تشبه قد شكلت المحتوية على RIPK1/RIPK3/ملكل أثناء نيكروبتوسيس، ولكن رابطة ملكل مع البروتينات الأخرى ضعف ما يكفي أنه ينأى خلال SDD-العمر.
لمعالجة هذه المشكلة، نقترح إجراء ثنائي الأبعاد (2D) SDD-عمر. وسيكون اميلويد SDD-العمر-مستقرة أو ألياف اميلويد تشبه نفس نمط الهجرة أثناء التفريد البعد الأول والثاني. سيكون هذا الاكتشاف بعد نقل البروتينات إلى غشاء والاضطلاع بوصمة عار غربية. ألياف مستقرة سوف يحمل نقش قطري حادة. أي انحراف عن هذا يوحي بأن الألياف تغيرات بسبب مخزونات النشر الاستراتيجي-التفريد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد العينات
- ثقافة 2 × 106 اميلويد إنتاج خلايا سرطان القولون HT-29 في طبق استنبات الأنسجة 10 سم في 10 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين والبنسلين والستربتوميسين. خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- بعد زراعة الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، تغسل الخلايا مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). أضف 3 مل من محلول التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- بعد الخلايا معزولة تماما من الطبق، أضف 10 مل من الثقافة المتوسطة ونقل الخلايا ماصة 10 مل أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المتوسطة وريسوسبيند الخلايا في 5 مل من الثقافة المتوسطة عد الخلايا باستخدام عداد خلايا. لوحة 2 × 106 خلايا في كل من اثنين 10 سم الأطباق.
- السماح للخلايا للتقيد واسترداد بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. تطبيق العلاج على صحن واحد للحث على تشكيل أميلويدس مع 20 نانوغرام/مليلتر ألفا عامل نخر الورم (تنف-α)، 100 نانومتر عموم ميكرومتر الألغام ميميتيك، و 20-caspase المانع Z-نقص فيتامين-مارك فنلندي11. يتم اختصار التركيبة كالمنطقة الأمنية المؤقتة. علاج الطبق الأخرى مع مركبة كعنصر تحكم.
- وبعد طول الوقت المناسب، الحصاد عادة ح 6، الخلية ليستي.
- كشط الخلايا خارج اللوحة مع مكشطة بلاستيكية واستخدم ماصة 10 مل لتحويل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تغسل الخلايا 2 مرات ريسوسبيندينج في 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح الحل برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: هذه العملية يمكن أن يكون مؤقتاً هنا بتجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل، وتخزينها في ˗80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. - نقل الخلية بيليه إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحتضان في 0.3 مل من تحلل المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. المادة طافية هي الخلية كله ليستي.
ملاحظة: هذه العملية يمكن أن يكون مؤقتاً هنا عن طريق تخزين العينة في-20 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر. - قياس تركيز البروتين بمقايسة برادفورد وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة 4 × SDD-العمر تحميل المخزن المؤقت إعداد 20 ميليلتر من 3 ميكروغرام/ميليلتر عينة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
2-إعداد وتشغيل المواد الهلامية
- إضافة 2 ز [اغروس] إلى 200 مل س 1 تريس-خلات المخزن المؤقت (تاي) في كوب زجاج والحرارة في فرن ميكروويف تذوب في [اغروس]. أضف 1 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 20% لتركيز نهائي من الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%. دوامة بعناية مزيج. الحرص على عدم توليد فقاعات بعد إضافة صحيفة بيانات السلامة.
- من أجل الحل [اغروس] إلى لوح جل 15 سم × 14 سم. استخدام ماصة 1 مل لإزالة أي فقاعات. مكان واحد مشط 20-جيدا في الجزء العلوي.
- البعد الأول: ماصة 60 ميكروغرام كل خلية في حارة اليمين المتطرف. تشغيل الهلام في 60 الخامس لحوالي 4 ح (حتى الصبغ والجبهة هي حوالي ¾ من خلال الجل) استخدام تاي التي تحتوي على مخزونات النشر الاستراتيجي 0.1% كالمخزن المؤقت قيد التشغيل.
- البعد الثاني: تدوير بعناية للهلام 90° عقارب الساعة (الشكل 2أ). تشغيل الهلام في 60 الخامس لحوالي 4 ح.
ملاحظة: حالة تشغيل عامة 4 طول جل الخامس/سم. من المهم أن شروط التشغيل هي بالضبط نفس الأبعاد الأولى والثانية.
3-نقل
- استخدام أسلوب النقل الشعرية لنقل البروتينات إلى غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن (الشكل 2ب).
- إضافة 500 مل من المخزن المؤقت نقل إلى حاوية 20 سم × 20 سم تقريبا. جعل كومة عالية 5 سم من المناشف الورقية بجانب الحاوية. يجب أن تكون المساحة السطحية للجزء العلوي من المكدس أكبر من أبعاد هلام.
- نقع ورقة تصفية 14 سم × 15 سم في نقل المخزن المؤقت ثم ضعه أعلى المكدس منشفة ورقة. الحرص على وضع على الورق مع لا التجاعيد أو فقاعات. كرر مع آخر قطعة من ورق الترشيح.
- تنشيط غشاء PVDF 14 سم × 15 سم في الميثانول لمدة 30 ثانية ثم طبقة على ورق الترشيح مع الحرص على استخدام اسطوانة إزالة جميع فقاعات. شطف الجل مع نقل المخزن المؤقت وطبقة من أعلى الغشاء، مرة أخرى وطرح أي فقاعات.
- تغطي حافة مناشف ورقية الأقرب إلى حاوية لنقل المخزن المؤقت مع غلاف بلاستيكي. من المهم أن الجسر الورقة التي شيدت في الخطوة التالية لا تتلامس مباشرة مع مكدس منشفة ورقة.
- نقع قطعة من ورق الترشيح 15 سم × 35 سم في نقل المخزن المؤقت ووضعه حتى نهاية واحد يغطي الجزء العلوي من الجل والطرف الآخر في حاوية نقل المخزن المؤقت. كرر مع جسر آخر.
- تغطية الحاوية مع غلاف بلاستيكي وتترك ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة.
4-الغربية النشاف الكشف
- شطف الغشاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% 20 توين (ببست) في حاوية 20 سم × 20 سم. إضافة 20 مل حليب 5% في ببست. صخرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة كتلة.
- "الماصة؛" 10 ميليلتر من جسم الأرنب ملكل المضادة إلى 20 مل حليب 5% في ببست، وإضافة إلى الحاوية. تبني على الروك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل الغشاء في 20 مل ببست 5 دقيقة كرر 5 مرات.
- "الماصة؛" 4 ميليلتر لمكافحة rabbit HRP إلى 20 مل حليب 5% في ببست، وإضافة إلى الحاوية. تبني على الروك في درجة حرارة الغرفة ح 2.
- يغسل الغشاء في 20 مل ببست 5 دقيقة كرر 5 مرات.
- إضافة تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة (القامة) وعرض لأفلام الأشعة السينية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد التعريفي نيكروبتوسيس، و RIPK1 و RIPK3 وأظهرت أنماط مثل اميلويد مماثلة تقريبا (الممرات 2 و 4، الشكل 1). ومع ذلك، ألياف ملكل متغايرة أكثر ويبدو أصغر من ألياف RIPK1/RIPK3 (لين 6، الشكل 1). الذي حدا بنا إلى وضع أسلوب SDD-العمر 2D لمعالجة احتمال ملكل يشكل ألياف RIPK1/RIPK3-مستقلة كانت أم ملكل تنأى ببساطة من ألياف RIPK1/RIPK3/ملكل كبيرة خلال SDD-العمر.
ويرد في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجانب الأكثر أهمية في 2D SDD-السن أن شروط التفريد هي نفسها بالنسبة للبعد الأول والثاني. اليكتروفوريسيس القدرة على الكشف عن خط قطري حادة في 45° (التي تشير إلى أن حدوث لا تفكك أو تدهور) يعتمد على الألياف يهاجرون بطريقة مماثلة أثناء على حد سواء. استخدام شروط مختلفة، على سبيل المثال تغيير الجهد أو طول وقت التشغيل، سوف يحجب هذه النتائج. أيضا، كما الحال بالنسبة التقليدية 1 د SDD-العمر، غليان العينة ينبغي تجنب، كهذا سوف يعطل اميلويد وألياف اميلويد الشبيهة. وكما الحال لجميع التحويلات، ينبغي الحرص على تجنب فقاعات بين الطبقات من ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
هذا العمل تدعمه زمالة لأدمغة-ألف. من المعاهد الوطنية للصحة/نكتس (TL1TR001104)، منح "مؤسسة ولش" (I-1827)، ومنحة R01 من نيجمس (RGM120502A) إلى Z.W. Z.W. أنور فيرجينيا لينثيكوم الباحث في البحوث الطبية والوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من تكساس الباحث (R1222).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وحدة الرحلان الكهربائي للهلام | فيشر | HE99XPRO | appratus لتشغيل الجل. |
| أجروز | VWR | 97062-250 | لجل الاغاروز. |
| برج الورق | فيشر | 19-120-2484 | لنقل |
| ورق الترشيح | VWR | 21427-386 | لنقل |
| غشاء PVDF | Bio-Rad | 162-0177 | لنقل |
| مسحوق الحليب المانع | Bio-Rad | 1706404XTU | للحجب في |
| المضاد للبقعة الغربية | MLKL Genetex | GTX107538 | الأرانب المضاد للجسم المضاد MLKL |
| المضاد RIPK1 | BD Biosciences | 610459 | الفأر المضاد للجسم المضاد RIPK1 |
| هدية الأجسام المضادة RIPK3 | من الدكتور شياودونغ وانغ | أرنب مضاد ل RIPK3. انظر reference 11. | |
| المضادة للأرانب - HRP | سيجما | A6154 | الجسم المضاد الثانوي |
| ECL | فيشر | WBKLS0500 | الغربية الكيميائية HRP الركيزة |
| فيلم الأشعة السينية | فيشر | F-BX810 | لنتيجة اللطخة الغربية |
| DMEM | Sigma | D6429 | لزراعة الخلايا |
| مصل الأبقار الجنين | Sigma | F4135 | لزراعة الخلايا |
| البنيسيلين ستربتومايسين | Sigma | P4333 | لزراعة الخلايا |
| محلول التربسين | Sigma | T4049 | لزراعة الخلايا |
| PBS لزراعة الأنسجة | Sigma | D8662 | لزراعة |
| الخلايا مؤتلف TNF | المصنوع في مختبرنا | للحث على تشريح. انظر المرجع 11. | |
| محاكاة | smac من الدكتور Xiaodong Wang | للحث على تشريح. انظر المرجع 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | للحث على تشريح. انظر المرجع 11. |
| عداد الخلية | Bio-Rad | 1450102 | نموذج TC20 ؛ لعد الخلايا |
| بيرس & التجارة ؛ مجموعة فحص البروتين BCA | Thermo Scientific | 23225 | لقياس تركيز البروتين في محللات الخلية |
| رافع الخلية | فيشر | 07-200-364 | لإزالة الخلايا من الطبق |
| Lysis Buffer (1 لتر) | 20 مل 1 م Tris درجة الحموضة 7.4 10 مل جلسرين 30 مل 5 M NaCl 840 مل DDH 2< / sub>O 10 مل Triton-X100 (مثبطات البروتياز والفوسفات حسب الرغبة) | ||
| 10X TAE (1 لتر) | 48.4 جم قاعدة تريس 11.42 مل حمض الخليك الجليدي 20 مل 0.5 مل EDTA درجة الحموضة 8 ddH 2< / sub>0 إلى 1 L | ||
| 4X SDD-AGE المخزن المؤقت للتحميل (50 مل) 5 | مل 10X TAE 10 مل جلسرين 4 مل 20٪ SDS 0.5 مل 10٪ بروموفينول أزرق 31 مل DDH2O | ||
| TBS Transfer Buffer (1 لتر)20 | مل 1 م ثلاثية الرقم الهيدروجيني 7.4 30 مل 5 M NaCl 950 مل DDH2O | ||
| PBST Wash Buffer (1 لتر) | 100 مل 10xPBS 800 مل DDH2O 1 مل Tween20 | ||
| 10X PBS (10 لتر) | 800 غ كلوريد الصوديوم 20 جم KCl 144 جم Na 2< / sub >HPO 4 < / sub > middot ؛ 2H2O 24 g KH2PO4 إضافة ddH2O إلى 10 لتر |
المراجع
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
![استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F57498.jpg&w=3840&q=75)