يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ديسثيوبيوتين-ستريبتافيدين-تقارب وساطة تنقية الحمض النووي الريبي تتفاعل البروتينات في خلايا ورم الظهارة المتوسطة

7.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57516

⸱

أبريل 25, 2018

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

في هذه المقالة

ملخص

وسم ديسثيوبيوتين من الاصطناعية في اليغو رنا 25-النوكليوتيدات، الذي يحتوي فكرة الغنية الأدنين عنصر (ARE)، يسمح ملزمة محددة من سيتوسوليك هي ملزمة البروتين.

الملخص

في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي لا تزال إلى حد كبير يستخدم في الخطوات الأولى للبروتوكولات الرامية إلى تحديد البروتينات الحمض النووي الريبي الملزمة التي تعترف بهياكل الحمض النووي الريبي وزخارف محددة. في هذا البروتوكول المنسدلة الجيش الملكي النيبالي، تتم تسمية المركب تجارياً الحمض النووي الريبي تحقيقات مع صيغة معدلة من البيوتين، ديسثيوبيوتين، في المحطة 3 ' من حبلا الجيش الملكي النيبالي، الذي عكسية بربط streptavidin، ويسمح بالتالي شطف بروتينات تحت أكثر فسيولوجية شروط. الجيش الملكي النيبالي--ديسثيوبيوتين هو المعطل تداولها من خلال التفاعل مع ستريبتافيدين على حبات المغناطيسية، التي تستخدم لهدم البروتينات على وجه التحديد تتفاعل مع الحمض النووي الريبي للفائدة. وتستخدم كمصدر للبروتينات البروتينات عدم-التشويه والتحريف والنشطة من الكسر سيتوسوليك من خلايا ورم الظهارة المتوسطة. يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا للكشف عن التفاعل بين الجيش الملكي النيبالي المعروف ملزم البروتينات ومجس الحمض النووي الريبي طويل 25-النوكليوتيدات (nt) التي تحتوي على تسلسل فائدة. وهذا مفيد لاستكمال توصيف وظيفي استقرار أو زعزعة استقرار العناصر الموجودة في جزيئات الحمض النووي الريبي تحقيقه باستخدام مقايسة متجه مراسل.

المقدمة

التعبير الجيني والمستوى النهائي للمنتج الجيني يمكن أحكام ينظمها التي تؤثر على استقرار مرناً ومرناً الترجمة معدل1. هذه الآليات التنظيمية بوستترانسكريبشونال تمارس عن طريق التفاعلات غير الترميز الحمض النووي الريبي و/أو الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) مع مرناً المستهدفة. أنها عادة ما تكون المنطقة 3 'غير مترجمة من مرناً (3' UTR-الذين ينتمون إلى الجزء غير ترميز الجينوم2) الذي يحتوي على محدد رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية (CRE)، التي تعترف بها ترانس-تعمل بعوامل مثل ميرنا أو الممارسات التجارية التقييدية 3-درس أفضل رابطة الدول المستقلة-هو عنصر داخل 3 ' UTR، عزر الأدنين-الغنية بعنصر (ARE)، الذي يعترف بالبروتينات الاتحاد الأفريقي ملزمة محددة (أوبب)، وفي المقابل، يدفع أما مرناً تدهور/ديدينيليشن (هي بوساطة تسوس) أو مرناً الاستقرار4.

الحجم 3 ' UTR من كالريتينين مرناً (CALB2) هو 573 bp طويلة ويحتوي بينتامير أويووا المفترضة، كما تنبأ بها AREsite2، أداة بيوينفورماتيك5. تمشيا مع وجود فكرة هي المفترضة، تحليل المتجهات-مراسل بميرجلو أظهر بدور تحقيق استقرار لهذا العنصر داخل مرناً CALB26. وأخيراً، في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي استخدمت لتحديد أوبب أن تستقر كالريتينين مرناً من خلال فكرة هي.

منذ الكشف غير ترميز جميع تتفاعل مع البروتينات7، في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي هو طريقة جيدة والفحص الأولى للاختيار لتحديد الحمض النووي الريبي-التمثيلات للمساعدة في فك رموز الآليات الجزيئية. واستخدمت في هذا الأسلوب، والجيش الملكي النيبالي-المنسدلة المركب تجارياً تحقيقات الجيش الملكي النيبالي، الذي تم تسميته بصيغة معدلة من البيوتين (ديسثيوبيوتين) في المحطة 3 ' من حبلا الحمض النووي الريبي،. الجيش الملكي النيبالي--ديسثيوبيوتين هو المعطل تداولها من خلال التفاعل مع ستريبتافيدين على حبات المغناطيسية، التي تستخدم لهدم البروتينات التي تتفاعل على وجه التحديد مع ربط-الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وتستخدم كمصدر للبروتينات البروتينات عدم-التشويه والتحريف والنشطة من الكسر سيتوسوليك من خلايا ورم الظهارة المتوسطة. يتم التيد مثل البروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي من الخرز المغناطيسي، تشغيل من خلال جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% ونقلت لغشاء وسبر مع الأجسام المضادة المختلفة.

في معيار streptavidin-البيوتين تقارب تنقية الإجراء، تمسخ قاسية هي الشروط اللازمة لعرقلة بوند البيوتين لا رجعة قوية-ستريبتافيدين الوت البروتينات منضم8، مما قد يؤدي إلى الانفصال من مجمعات البروتين. خلافا البيوتين، ديسثيوبيوتين عكسية بربط streptavidin وشرد تنافسية مع حل مخزنة من البيوتين، مما يسمح شطف لطيف من البروتينات، وتجنب عزل بطبيعة الحال بيوتينيلاتيد الجزيئات9، مما يدل على أن هذه التقنية مثالية لعزل مجمعات البروتين الأصلي تحت ظروف السكان الأصليين.

ينبغي أن تكون قريبة من تلك الموجودة في سياق الخلوية في المختبر الشروط الملزمة والتقشف، التي يتم تحديدها بواسطة تركيز الملح وعوامل تخفيض النسبة المئوية المنظفات، بغية تحديد التفاعلات الحقيقية في فيفو . لقد ثبت شروط ملزمة تنفيذ هذه الوثيقة سابقا حسب الاقتضاء لتحديد هور الاتحاد الأفريقي ملزمة بروتين10. هذا النهج يمكن أن تنقذ الوقت، نظراً للاستفادة المثلى شروط الربط السليم يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تستخدم كبروتوكول انطلاق لأي تجربة المنسدلة الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن يكون الأمثل تدريجيا بتغيير تركيز الأملاح والمنظفات وتغيير النسبة المئوية والغليسيرول وإضافة الأملاح الأخرى. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن حتى قصير 25-النوكليوتيدات الجيش الملكي النيبالي-تحقيق إيواء بينتامير هي فكرة يمكن أن تستخدم لإظهار التفاعل مع أوبب محددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد جزء من البروتين سيتوسوليك والنووية

  1. لوحة 4 × 106 لجنة التنسيق الإدارية--ميزو-4 خلايا في قارورة ثقافة خلية T150 نمت في ربمي-المتوسطة 1640 تستكمل مع 10% FBS، 1 x البنسلين/ستربتوميسين (100 x)، ومم 2 لتر-الجلوتامين (200 ملم). عندما تصل الخلايا إلى الجمع بين 80-90% (~5-5.5 x 106 خلايا)، المضي قدما في استخراج البروتين من الكسر النووية وسيتوسوليك.
    ملاحظة: تم الحصول على خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية--ميزو-4 من مركز بيوريسورسي "بتبريد"11.
  2. نضح المتوسطة وغسل الخلايا بإضافة 15 مل من س 1 برنامج تلفزيوني وآماله اللوحة بلطف عدة مرات ونضح برنامج تلفزيوني 1 x. أضف 3 مل من 0.25% يدتا التربسين واحتضان قارورة الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: انظروا إلى الخلايا تحت المجهر لمفرزة؛ إذا كان لا يزال يعلق الصنبور قارورة ضد كف يد 3 مرات.
  3. إضافة 7 مل متوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS والبنسلين 1 x/ستربتوميسين (100 x) مم 2 لتر-الجلوتامين (200 ملم) وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل، وتدور إلى أسفل في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
  4. نضح المتوسطة ريسوسبيند بيليه الخلية مع 1.5 مل من 1 x PBS، ثم نقل الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تدور إلى أسفل في ز 500 x و 4 درجات مئوية عن أدنى 5 تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، القيام بجميع الخطوات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية وتبقى جميع الكواشف على الجليد.
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية مع المثلج مل 1.5 من برنامج تلفزيوني x 1 وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 500 x ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: المبالغ المطلوبة من وحدات خفض الانبعاثات المعتمدة الأول والثاني CER والكاشفات NER هي 10 و 0.55 و 5 مجلدات من الخلية المقدرة بيليه وجبات وحدة التخزين، على التوالي؛ البروتوكول التالي يفترض حجم 20 ميليلتر. نحن نوصي بإعداد فقط المبلغ المطلوب لكاشف CER أنا.
  6. إضافة 200 ميليلتر لاستخراج هيولى المثلج كاشف (CER أنا) تستكمل مع 2 ميليلتر من 1 × مثبط بروتيناز، مثلاً، يؤدي إلى تمييع 1 حبة من "مثبطات البروتياز" (يدتا الحرة) في 500 ميليلتر من الماء للحصول على الأوراق المالية x 100. هذا المبلغ من كاشف التخفيض ما يكفي 20 ميليلتر بيليه الخلية وجبات وحدة التخزين.
    1. ولتقدير حجم الخلية بيليه وجبات، قارن الأنبوب الذي يحتوي على خلية بيليه مع أنبوب 1.5 مل مليئة 10 أو 20 أو 50 أو 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
  7. ريسوسبيند بيليه الخلية بشدة فورتيكسينج الأنبوبة لمدة 15 ثانية واحتضان الأنبوب على الجليد للحد الأدنى 10 11 إضافة ميليلتر لاستخراج هيولى المثلج كاشف (CER الثاني) إلى الأنبوبة، دوامة بقوة 5 s، واحتضان 1 دقيقة على الجليد.
  8. دوامة لقوة 5 s والطرد المركزي الأنبوب في 16,000 س ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 5 نقل المادة طافية إلى أنبوب مبردة مسبقاً نظيفة على الجليد. المادة طافية هو الكسر هيولى أن كذلك استخدمت في التجربة المنسدلة الجيش الملكي النيبالي.
  9. ريسوسبيند بيليه المتبقية في 100 ميليلتر من استخراج النووية المثلج كاشف (NER) تستكمل مع 1 ميليلتر مثبط البروتيناز (100 س) وشدة دوامة لمدة 15 ثانية. نحن نوصي بإعداد فقط المبلغ المطلوب لكاشف NER تستكمل مع مثبطات البروتياز.
  10. احتضان العينة على الجليد لمدة 40 دقيقة مع فورتيكسينج أحياناً لمدة 15 ثانية (كل 10 دقائق).
  11. الطرد المركزي الأنبوب في س 16,000 ز عن 10 دقيقة نقل المادة طافية (هذا هو الكسر البروتين النووي) لأنبوب مبردة مسبقاً نظيفة.
  12. الشروع فورا بقياس تركيز البروتين باستخدام الأسلوب بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) (انظر الجدول للمواد). للتحكم في للبروتين نقاء كل جزء، أداء immunoblotting (الشكل 1) ضد α-tubulin (الكشف إيجابية فقط في جزء سيتوسوليك) وبولي ADP-الريبوز بوليميريز-نشطت (الكشف إيجابية إلا في جزء صغير النووية). للتصور البروتين، والرجوع إلى المادة 4.
  13. من أجل الحفاظ على نشاط البروتين ودولته الأصلية، تعد 25 ميليلتر من مختبرين لمقتطفات سيتوسوليك والنووية. الأداة الإضافية-تجميد هذه مختبرين بوضعها في النتروجين السائل 5 s ومخزن مباشرة في-80 درجة مئوية.

2-وضع العلامات للجيش الملكي النيبالي مع ديسثيوبيوتين

  1. تحقيقات الجيش الملكي النيبالي تصنيعه تجارياً وتنقيته [هبلك]. ريسوسبيند بمياه خالية من نوكلاس في 10 ميكرون.
    ملاحظة: يتم سرد تسلسل التحقيق في الجدول 1.
  2. استخدام pmol 50 من الحمض النووي الريبي لرد فعل الجيش الملكي النيبالي-المنسدلة. ذوبان الجليد، وإبقاء جميع الكواشف على الجليد إلا لربط 30 ٪، تستخدم لتسمية 3 ' تيرمينوس للجيش الملكي النيبالي اليغو.
  3. نقل 5 ميليلتر من 10 تحقيقات الجيش الملكي النيبالي ميكرومتر، وصفت بأنها CALB2 3 'UTR (ARE)، CALB2 3' UTR (متري)، وأونريلاتيد--الحمض النووي الريبي (غضب)، إلى 0.5 مل رقيقة الجدار ميكروسينتريفوجي أنابيب واحتضان في جهاز PCR في 85 درجة مئوية للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب فورا على الجليد.
    ملاحظة: هذه الخطوة هامة، إذ أنها تعزز بالاسترخاء وإمكانية الوصول لمسبار الحمض النووي الريبي لوضع العلامات.
  4. لفعل 30 ميليلتر واحد، إضافة إلى الأنبوبة المحتوية على الحمض النووي الريبي المزيج 10 ميليلتر التالية: 3 ميليلتر من المياه مجاناً نوكلياسي، 3 ميليلتر من 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من "مثبط رناسي" (يو 40/ميليلتر)، 1 ميليلتر من "ديسثيوبيوتينيلاتيد سيتيديني بيسفوسفاتي" (1 ملم) ، و 2 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى (20 ش/ميليلتر).
    ملاحظة: إعداد A مزيج الرئيسي للعينات 3 في الزائدة (3.2)، مزيج 9.6 ميليلتر من نوكلاس المياه مجاناً، ميليلتر 9.6 من 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت، ميليلتر 3.2 من "مثبط رناسي" (يو 40/ميليلتر)، 3.2 ميليلتر من "ديسثيوبيوتينيلاتيد سيتيديني بيسفوسفاتي" (1 ملم)، وميليلتر 6.4 من الحمض النووي الريبي T4 ليجاسى (20 ش/ميليلتر).
  5. إضافة ربط بعناية 15 ميليلتر من 30% إلى رد الفعل. استخدام تلميح آخر إلى خلط رد فعل. تبني رد فعل بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  6. في اليوم التالي، إعداد ما يلي: 5 "م كلوريد الصوديوم" (طازجة/نوكلاس الحرة)، كلوروفورم: إيسواميل الكحول بنسبة 24:1 (مثلاً، كل رد فعل-96 ميليلتر كلوروفورم و 4 ميليلتر من الكحول إيسواميل)، المثلج 100 ٪ الإيثانول، والمثلج 70% إيثانول.
  7. إضافة ميليلتر 70 من المياه خالية من نوكلياسي للأنابيب رد فعل وسم الحمض النووي الريبي. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم: إيسواميل الكحول ودوامه بإيجاز. تدور إلى أسفل في 13,000 س ز لإزالة الحد الأدنى 3 بعناية فقط بالمرحلة العليا ونقلها إلى أنبوب خالية نوكلاس 1.5 مل جديدة؛ تجنب لمس في المرحلة الدنيا.
  8. إضافة 10 ميليلتر كلوريد الصوديوم م 5، 1 ميليلتر من الجليكوجين وميليلتر 300 المثلج 100 ٪ الإيثانول. ضع الأنبوبة في-20 درجة مئوية ح 2.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن أن تستمر التجربة في اليوم التالي.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز و 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة بعناية تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه. إضافة 300 ميليلتر من المثلج 70% إيثانول والطرد المركزي مرة أخرى في 13,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. تجاهل المادة طافية تماما وأيردري بيليه (15 دقيقة). ريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
    ملاحظة: المضي قدما في الجيش الملكي النيبالي-الواقعة في نفس اليوم.
  11. احتضان الجيش الملكي النيبالي في 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم ضع على الجليد. ضع المسمى-الجيش الملكي النيبالي على الجليد خلال الخطوة التالية لما قبل غسيل الخرز المغناطيسية ستريبتافيدين.
    ملاحظة: فترة حضانة أطول قد تضر مسبار الحمض النووي الريبي.

3-الجيش الملكي النيبالي بالبروتين المنسدلة

  1. ما قبل الغسيل ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز والحضانة مع ديسثيوبيوتين-الجيش الملكي النيبالي
    1. استخدام 50 ميليلتر من streptavidin المغناطيسي الخرز الواحدة 50 pmol الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، وهذا ينبغي أن يكون الأمثل اعتماداً على التجربة.
    2. قطع دوامة الأنبوب مع الخرز streptavidin المغناطيسي 15 s، وسرعة إزالة 200 ميليلتر (مزيج الرئيسي؛ ويكفي لردود فعل 3 + 1) في استخدام صندوق الأمانات-قفل الأنبوبة نظيفة 1.5 مل نصائح ماصة. وضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسي بحيث جمع إلى جانب الأنبوب الخرز وانتظر 1 دقيقة إزالة السائل استثارة.
    3. ليغسل الخرز، وإزالة الأنبوب من موقف المغناطيسي، إضافة 400 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم، 0.05 "م كلوريد الصوديوم"، والحل بلطف بيبيت صعودا وهبوطاً عدة مرات. ضع الأنبوب مرة أخرى على موقف المغناطيسية. انتظر 1 دقيقة وجمع المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    4. أغسل حبات مع 200 ميليلتر من 100 ملم كلوريد الصوديوم. إزالة المادة طافية.
    5. إضافة 200 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس (درجة الحموضة 7.5)، ريسوسبيند حبات من بيبيتينج ووضع الأنبوب على الوقوف المغناطيسية والانتظار لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية. كرر الخطوة.
    6. إزالة الأنبوب من موقف المغناطيسية وإضافة 200 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للالتقاط الجيش الملكي النيبالي ريسوسبيند ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز قبل فترة وجيزة من فورتيكسينج. إزالة 50 ميليلتر من ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز، وإضافة إلى الأنبوبة المسماة الجيش الملكي النيبالي كل استخدام تلميح قطع ماصة. الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على اسطوانة احتضانها.
  2. ملزمة للبروتين للجيش الملكي النيبالي
    1. وضع الأنابيب في موقف مغناطيسي، انتظر 1 دقيقة، وإزالة المادة طافية.
    2. إضافة 50 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس (درجة الحموضة 7.5) إلى الخرز وريسوسبيند بيبيتينج. وضع الأنابيب في موقف مغناطيسي، انتظر 1 دقيقة، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة.
    3. إضافة 100 ميليلتر من 1 س رنا البروتين ملزمة المخزن المؤقت إلى الخرز وريسوسبيند بيبيتينج.
    4. وفي الوقت نفسه، يعد هذا المزيج التالي: 10 ميليلتر من 10 x العازلة ملزمة البروتين-الجيش الملكي النيبالي, 30 ميليلتر من الجلسرين 50%, 50 ميكروغرام هيولى البروتينات، وخالية من نوكلاس المياه تصل إلى 100 ميليلتر.
      ملاحظة: إعداد مزيج الرئيسي ب 3 عينات في الزائدة (3.3) كما يلي: 33 ميليلتر من 10 × العازلة ملزمة البروتين-الجيش الملكي النيبالي، ميليلتر 99 من والغليسيرول 50%، ميكروغرام 165 من البروتينات هيولى وخالية من نوكلاس المياه تصل إلى 330 ميليلتر. إبقاء أنبوب مزيج الرئيسي ب على الجليد.
    5. ضع الأنابيب في موقف المغناطيسي، انتظر 1 دقيقة وجمع المادة طافية. إضافة 100 ميليلتر من مزيج الرئيسي ب، ريسوسبيند بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتجنب خلق الفقاعات. أنابيب رد فعل لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية على اسطوانة احتضانها.
  3. الغسيل وشطف
    1. وضع الأنابيب في موقف مغناطيسية، وجمع المادة طافية (وهو التدفق من خلال-متر)، ونقل في أنبوب جديد.
      ملاحظة: يبقى هذا متر على الجليد لتحليلها في وقت لاحق.
    2. "الماصة؛" 100 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في الخرز وريسوسبيند برفق ووضع العودة إلى موقف المغناطيسية، وانتظر 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
    3. إضافة 40 ميليلتر من "شطف المخزن المؤقت" الخرز المغناطيسي، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان في 37 درجة مئوية في أنبوب شاكر (950 لفة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
    4. وضع الأنابيب في موقف مغناطيسي، انتظر 1 دقيقة، وجمع العينة التيد (وهو النذرة-E). على الجليد، وتستخدم لتحليل المتلقين للمعلومات.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يتكون كل اختبار الحمض النووي الريبي المسبار من التدفق عبر (قدم) وعينه النذرة (ﻫ).

4-polyacrylamide التفريد وغربية لطخة تحليل

ملاحظة: انظر الجدول 2 لوصفات للمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا القسم. أداء الغربية وصمة عار ووفقا للأسلوب لايملي12.

  1. هاندكاست 12% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الجل (10-الآبار، ومباعدة 1.5 مم، 66 ميليلتر). إعداد مزيج هلام قيد تشغيل: المخزن المؤقت 4 مل حل الأسهم 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي، 2.4 مل من تريس السفلي، 3.2 مل من dH2س، 9.6 ميليلتر من تيميد، ميليلتر 96 الحل فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية). إعداد التراص هلام ميكس: مل 3.25 درهم2س، 0.5 مل من 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي حل الأسهم، 1.3 مل من المخزن المؤقت تريس العلوي، 10 ميليلتر من تيميد، ميليلتر 20% 10 وكالة الأنباء الجزائرية.
  2. إضافة ميليلتر 16.6 6 x Laemmli المخزن المؤقت (مثلاً، 14 مل من تريس/HCl/الحزب الديمقراطي الصربي الأس الهيدروجيني 6.8 (المخزن المؤقت تريس العلوي)، ز 2 من الحزب الديمقراطي الصربي، ز 1.86 من DTT، 6 مل من الجلسرين، و 0.012% bromophenol الأزرق؛ المخزنة في-20 درجة مئوية) في العينة متر، وميليلتر 6.6 من 6 x Laemmli المخزن المؤقت ه عينة. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
  3. تحميل العينات (الوت ميليلتر 20 متر وكل ميليلتر ~ 40) وتشغيلها لمدة 30 دقيقة 60 الخامس، تواصل مع 20 الخامس بين عشية وضحاها.
  4. باستخدام نظام اليكتروبلوتينج شبه جاف، نقل البروتينات إلى غشاء PVDF لمدة 80 دقيقة في 15 الخامس.
    ملاحظة: يجب تنشيط الغشاء PVDF قبل تنفيذ عملية نقل البروتين. احتضان الغشاء في الميثانول 100% 1 دقيقة، متبوعاً حضانة 2 دقيقة في الماء عالي النقاوة.
  5. بعد نقل البروتين، احتضان جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع أخذ الحل ح 3، تليها ثلاث خطوات للغسيل بالماء عالي النقاوة، وكل 30 دقيقة.
  6. في نهاية نقل البروتين، اسمحوا الغشاء PVDF الجاف لتنشيط حاء 1 الغشاء كما هو مبين في الخطوة 4، 5. كتلة الغشاء ح 1 مع جيش صرب البوسنة 5% في 1 x TTBS.
  7. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولى: هور أو ميسوثيلين، على حد سواء المخفف 1: 1000 في جيش صرب البوسنة 5% في x TTBS 1 ح 4 في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 7 دقائق في 1 x TTBS، واحتضان مع أرنب الماوس المضادة الفجل البيروكسيديز (HRP)-تضعف جسم الثانوي مترافق المضيفين في 5% جيش صرب البوسنة، 1 x TTBS.
  9. تصور البروتينات استخدام تشيميلومينيسسينسي المحسن وجهاز تصوير رقمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه التجربة، استخدمت 25-nt جزء طويل من كالريتينين 3 'UTR إيواء هي الحافز (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) لاختبار ما إذا كان هو ملزم على وجه التحديد للبروتين R الإنسان-مستضد (هور)، عامل استقرار مرناً معروفة. لاختبار خصوصية العنصر هي، الحمض النووي الريبي 25-nt كان مسبار CALB2 3 ' UTR (متري) التي تحتوي على الطفرات هي الحافز، الذي أبدى سابقا إلغاء تأثير الحافز على تحقيق الاستقرار، تستخدم6. الجيش الملكي النيبالي الثالث التحقيق يمثل عنصر التحكم السلبي، الذي هو 28-nt لا علا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

3 ' تحيلها تنتمي إلى الجينوم غير الترميز3، والكشف غير ترميز كافة يمكن أن تتفاعل مع البروتينات لممارسة هذه الوظيفة7. عندما وجد أن تكون نسخها شوهها الجينوم الثدييات وتنتج جزءا كبيرا من وقت طويل فضله الكشف16، الناشئة الأدلة أثبتت أن هذه الكشف الطويل فضله تعمل في تنظيم التعبير الجيني كما أنها تتفاعل مع إعادة عرض الكروماتين مجمعات17. واكتسبت هذه المعرفة باستخدام تحليل الحمض النووي الريبي المنسدلة. وهكذا، لبدء فك رموز التمثيلات الحم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

بتأييد هذا العمل بالمنحة السويسرية سينيرجيا مؤسسة العلوم الوطنية CRSII3 147697 für ستيفتونغ كريبسفورشونج أنجيواندتي وكريبسليجا Zürich.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
NE-PER طقم الاستخراج النووي والسيتوبلازميThermo Fisher Scientific  78833
أقراص مثبطات بيرس البروتينات ، مجموعةThermo Fisher ScientificA32965
Pierce BCAالخالية من EDTA Thermo Fisher Scientific23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit   ؛Thermo Fisher Scientific20164يتضمن حبات مغناطيسية وبالتالي يجب تخزين المجموعة في 4 درجات ؛ سي
بيرس الحمض النووي الريبي 3 ' إنهاء مجموعة إزالة البيوتينيل Thermo Fisher Scientific20163المجموعة هي جزء من "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" ، ويجب تخزينها عند -20 درجة ؛ C على عكس المجموعة المنسدلة (4 درجات ؛ ج).
DynaMag-2,  حامل مغناطيسيThermo Fisher Scientific12321D
المضاد للجسم المضاد أحادي النسيلة (الماوس)Thermo Fisher Scientific-يتمتضمين الجسم المضاد في مجموعة Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit   - 1: 1000 في 5٪ BSA 1x TTBS - أجسام مضادة ثانوية مضادة للفأر للأرانب 1: 10,000 في 5٪ BSA 1x TTBS
Anti - & alpha - التوبولين (الماوس) الجسم المضاد أحادي النسيلةسانتا كروز80351: 1000 في 5٪ BSA 1x TTBS - أجسام مضادة ثانوية مضادة للأرانب 1: 10،000 في 5٪ BSA 1x TTBS
مضاد - PARP (RABBIT) إشارات خلية الأجسام المضادة متعددة95421: 1000 في 5٪ BSA 1x TTBS - الجسم المضاد الثانوي للأرانب 1: 10،000 في 5٪ BSA 1x TTBS
المضاد - الميزوثلين (الماوس) الجسم المضاد أحادي النسيلة   ؛Rockland200-301-A87
الأجسام المضادة للماعز الثانوية المضادة للأرانبإشارات الخلية7074
الأرانب الثانوية الأجسام المضادة للفأرSigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 متوسطSigma-AldrichR8758
FBS - مصل الأبقار المرشحPan Biotech   ؛P40-37500
البنسلين - الستربتومايسين (100x)Sigma-Aldrich P4333
محلول L-Glutamine (200 ملم)Sigma-Aldrich   ؛G7513
0.25٪ Trypsin-EDTA (1x)Gibco by Life technologies 25200-056
Mini-PROTEAN 3 خلاياBio-Rad1653301
ألواح زجاجية صغيرة لنظام البروتين ألواح Bio-Rad1653308
Mini-PROTEAN Spacer مع فاصل مدمج 1.5 ممBio-Rad1653312
Mini-PROTEAN Comb ، 10 بئر ، 1.5 مم ، 66 & micro ؛ LBio-Rad1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting ModulesBio-Rad1658050
RNaseZap RNase محلول إزالة التلوثThermo Fisher ScientificAM9780
Rotiphorese gel 30 - محلول مائي 30٪ من الأكريلاميد والبيساكريلاميد بنسبة 37.5: 1Roth3029
20٪ SDS & nbsp ؛PanReac AppliChemA3942
PVDF غشاء النقل NEF1002 يحتاج Perkin Elmerالتنشيط عن طريق احتضان الميثانول النقي لمدة 1 دقيقة متبوعا بالغسيل في الماء لمدة دقيقتين ؛
خلية نقل شبه جافة Trans-Blot SD  Bio-Rad1703940
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
FusionFX   التصوير الرقميVilber-RNA
oligo synthesisMycrosynth AG ، سويسرا-مقياس التوليف - 0.04 & micro ؛ مول - HPLC منقى
مصل الألبومينالبقري Sigma-AldrichA7030
حمض الهيدروكلوريك (HCl) 6 MPanReac AppliChem182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris ، درجة الحموضة 7.5   ؛ثيرمو فيشر 15567027
الجلسرين  Thermo Fisher Scientific1790450٪ aliquots معقمة ليتم تخزينها عند -20 درجة ؛ C
بيرس ستربتافيدين الخرز المغناطيسي ثيرمو فيشر العلمي88817يرجى ملاحظة أن متوسط قطر هذه الخرزات المغناطيسية يبلغ 1 & ميكرو. م (تتراوح من 0.5 - 1.5 وميكرو ؛ م). علاوة على ذلك ، Dynabeads-M280 Streptavidin ، وهي حبات من حجم متجانس 2.8 وميكرو ؛ م ، تستخدم أيضا في سحب الحمض النووي الريبي ولكن كن على دراية بأن هذا قد يؤثر على عملية التنقية.
TEMEDSigma-AldrichT9281
بيرسلفات الأمونيوم  سيجما ألدريتشA3678
Coomassie G-250ApplichemA3480
كبريتات الألومنيوم-(14-18)-هيدرات سيجما ألدريتش368458
حمض الفوسفوريك  ApplichemA0637
فحص البروتين النسيلة إلى العلمي

المراجع

  1. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  2. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
  3. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
  4. von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
  5. Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
  6. Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
  7. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
  8. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
  9. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  10. Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
  11. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  13. Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
  14. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
  15. Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
  16. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  17. Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
  18. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
  19. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA Pulldown
ديسثيوبيوتين-ستريبتافيدين-تقارب وساطة تنقية الحمض النووي الريبي تتفاعل البروتينات في خلايا ورم الظهارة المتوسطة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.