مقالة منهجية

تقييم إدراج إكسون الناجمين عن طريق لصق تبديل النوكليوتيد العقاقير في SMA المريض الليفية

DOI:

10.3791/57530

⸱

مايو 11, 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت مختلف العقاقير النوكليوتيد (AONs) للحث على إدراج إكسون (تعديل الوصلة) وإنقاذ التعبير الجالي لضمور العضلات الشوكي (SMA). هنا، يمكننا وصف بروتوكول لايون ليبوترانسفيكشن للحث على إدراج إكسون في الجينات SMN2 وأساليب التقييم تحديد الكفاءة في SMA الليفية المريض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ضمور العضلات الشوكي (SMA)، أمراض عصبية قاتلة الناجمة عن فقدان SMN1، يمثل حالة فريدة من نوعها في المجال العقاقير اليغنوكليوتيد (أيون)-بوساطة العلاج. بينما الطفرات SMN1 المسؤولة عن المرض، AONs استهداف مواقع كاتم الصوت (ISS) الوصلة إينترونيك في SMN2، بما في ذلك نوسينيرسين التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، تبين أن استعادة التعبير الجالي والتخفيف من الأعراض. حاليا، العديد من الدراسات التي تشمل العلاج بايون ل SMA التركيز على التحقيق في رواية أيون كيمياء استهداف SMN2 التي قد تكون أكثر فعالية وأقل سمية من نوسينيرسين. هنا، نحن وصف بروتوكول للتقييم في المختبر لإدراج إكسون باستخدام ليبوترانسفيكشن AONs متبوعاً بالنسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) والكمية البلمرة المتسلسل (qPCR) النشاف الغربية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لأنواع مختلفة من أيون كيمياء. باستخدام هذا الأسلوب، نظهر أن AONs تتألف من الأحماض النووية مؤمنة التناوب (لناس) والنيوكليوتيدات الحمض الخلوي الصبغي (LNA/DNA ميكسميرس) يؤدي إلى كفاءة SMN2 إكسون إدراج واستعادة للبروتين الجالي في تركيزات منخفضة للغاية، وبالتالي، LNA/ الحمض النووي على أساس ميكسمير النوكليوتيد العقاقير قد تكون استراتيجية علاجية جذابة لعلاج الربط العيوب الناجمة عن الأمراض الوراثية. في المختبر تقييم الأسلوب الموصوفة هنا سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار AONs رواية مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ضمور العضلات الشوكي (SMA) اضطراب عصبي عضلي فادح الموروثة في نمط مقهورة جسمية. ويتميز بتدهور الخلايا العصبية الحركية والجذع تدريجيا واطرافهم العضلات شلل1،2. غالبية الحوادث SMA سبب طفرة متماثل في الجينات البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية الحركية 1 (SMN1)3. الجين البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية الحركية 2 (SMN2) تكرار معكوس من SMN1، وتسلسل متطابقة تقريبا تختلف حسب القواعد الخمس فقط4،5. تحول ج-إلى تي في SMN2 الواقعة في إكسون 7 يجعل الجين لا يعمل تقريبا نظراً للطفرة تؤدي إلى إكسون الأساسية 7 استبعادهم في ما يقرب من 90 في المائة من SMN2 المحاضر الحرفية (الشكل 1). لا يمكن أن تعوض مرناس SMN2 إكسون 7 في عداد المفقودين للدالة SMN1 لأن ناتجها البروتين غير مستقرة وتتحلل سريعاً.

العلاج بالعقاقير برزت مؤخرا كاستراتيجية واعدة جداً لعلاج SMA6. الموافقة الأخيرة على نوسينيرسين من "الولايات المتحدة للأغذية" والدواء (FDA) إتاحته أول دواء لعلاج SMA7. نوسينيرسين هو 18-مير العقاقير اليغنوكليوتيد (أيون) مع تعديل 2 '-O-ميثوكسييثيل (وزارة التربية والتعليم) والعمود الفقري فوسفوروثيواتي. المخدرات يستهدف كاتم الصوت الربط إينترونيك N1 (المحطة الفضائية الدولية-N1) يقع في إنترون 7 الجين SMN2 . ملزمة نوسينيرسين إلى محطة الفضاء الدولية-N1 يعزز الانتعاش وظيفية كاملة الطول الجالي البروتين التعبير من الجينات SMN2 الذاتية بحمل إكسون 7 إدراج (الشكل 1)8،9،10 . حاليا، العديد من الدراسات التي تشمل العلاج بايون ل SMA التركيز على التحقيق في كيمياء أيون الرواية التي قد تكون أكثر فعالية وأقل سمية من نوسينيرسين. وقد ثبت أن AONs مع كيمياء أخرى أيضا كفاءة الحث على إدراج إكسون في SMN2 إكسون 7 في المختبر و في فيفو11،،من1213.

مؤمن من الأحماض النووية (لناس) هي النظير الحمض النووي الريبي معدلة كيميائيا تحتوي على جسر الميثيلين الاتصال 4-الكربون مع 2 '-الأكسجين داخل ال14،فرانس الهيكل (الشكل 1ب)15. بالمقارنة مع السلطات الوطنية المعينة أو الكشف، لناس زيادة تقارب للربط لتسلسل الحمض النووي الريبي مكملة ولها فائدة مضافة ليجري شديدة المقاومة ل nucleases الذاتية. تم تطبيق الكيمياء LNA لاستخدامها كمجسات للأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) وفي قبكر16،17. كما أنها تستخدم لتنظيم التعبير الجيني في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. AONs جابمير مزيج من جزيئات الحامض النووي الذين تقطعت بهم السبل-واحد يحف به عدة لناس في نهايات 3 'و 5'. نهدم التعبير الجيني بالربط مكملة مرناس المستهدفة، مما أدى إلى أن يتحلل من "ح رناسي" المنشط18. ميكسميرس LNA/الحمض النووي هي AONs التي تتكون من الحمض النووي النيوكليوتيدات تدمج ما بين لناس. قدم في هذا الاتجاه أنهم ربط ميرنا تمنع عن وظيفة (LNA-أنتيمير)19. وصلت بعض LNA-أنتيميرس التطوير السريري. للحصول على أمثلة، ميرافيرسين (أنتيمير-122) أنتيمير LNA الذي يمنع مير-122 لعلاج الإصابة بالتهاب الكبد الوبائي وهي عدة "المرحلة الثانية من" التجارب السريرية الجارية حاليا19،20. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن ميكسميرس LNA/الحمض النووي يمكن أن تعدل أيضا الجيش الملكي النيبالي الربط21. ويمكن ربط تسلسل محدد من مرناً وحمل إكسون تخطي في إدراج ديستروفين مرناً واكسون في SMN2 مرناً في المختبر13،22.

في هذه المقالة، نحن مخطط منهجية لاستحثاث إكسون إدراج استخدام AONs وتقييم كفاءة المستويات الرنا والبروتين. لتجسيد هذا الأسلوب، استخدمنا ميكسميرس LNA/الحمض النووي استهداف المحطة الفضائية الدولية-N1 في إنترون 7 من SMN2. AONs transfected في خلايا المريض SMA قبل ليبوترانسفيكتيون الناجمة عن إدراج إكسون 7 في النهائي SMN2 نسخة و upregulation من إنتاج البروتين الجالي. واحدة من مزايا استخدام ميكسميرس LNA/الحمض النووي للحث على إدراج إكسون أن تركيز فعال تعداء أقل بكثير من غيرها كيمياء13. يمكن استخدام هذا الأسلوب للعديد من AONs الأخرى باستثناء ليغومرات morpholino فوسفورودياميداتي (بالرصدات)، التي، بسبب تهمة محايدة، بحاجة إلى إدخال الخلايا عن طريق الالتقام الناجمة عن الكاشف تعداء المشارك إندو-بورتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-خلية ثقافة

  1. SMA ثقافة الليفية المريض في المتوسطة النمو (دولبيكو لتعديل النسر متوسطة 1:1-12 (لحم الخنزير) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين 0.5%/ستربتوميسين) في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.
  2. تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد الآلي خلية وتمييع الخلايا إلى 1 × 105 خلايا/مل في المتوسطة النمو، ثم البذور على اللوحة المناسبة. استخدام لوحات 12-جيدا (1 مل كل بئر) RT-PCR أو qPCR.
  3. احتضان لوحات ل 24 ساعة في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية.

2-LNA/الحمض النووي ميكسمير تعداء

  1. ضمان كونفلوينسي خلية حوالي 65-80% لكفاءة تعداء الأمثل.
  2. ذوبان الجليد 10 ميكرومترات LNA/الحمض النووي ميكسميرس ببطء على الجليد.
  3. في أنبوب 1.5 مل، تحضير حلاً x mixmer 20 بإضافة ميكسميرس للمحرومين من المصل وسائل الإعلام لكي يصل الحجم النهائي إلى 50 ميكروليتر.
  4. مزيج ميكسمير الحل مع 50 ميكروليتر من المحرومين من المصل الوسائط التي تحتوي على 3% تعداء كاشف (نسبة 1:1).
  5. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. إضافة 900 المتوسطة ميكروليتر المحرومين من المصل مع 5% FBS لكل أنبوبة.
  7. نضح الوسائط القديمة من اللوحة واستبدال مع 1 مل من محلول ميكسمير LNA/الحمض النووي يحتوي على الكاشف تعداء.
  8. احتضان الخلايا ح 24-48 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.

3. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل كاشف ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم جوانيدينيوم للخلايا. أغسل الجزء السفلي شكل جيد عدة مرات مع جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم وأنه جمع في أنابيب 1.5 مل.
  2. دوامة في عالية السرعة 30 ثانية ومخزن في-80 درجة مئوية ح 1 أو بين عشية وضحاها.
  3. ذوبان الجليد العينات في درجة حرارة الغرفة ودوامه جيدا.
  4. إضافة 200 ميليلتر كلوروفورم، اهتز بشدة لمدة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. جمع مسح الأعلى المرحلة مائي في أنبوب جديد. تأكد من تجنب جمع أي من الطور البيني الأبيض الذي يشكل بين المراحل العليا والسفلي.
  7. إضافة 500 ميليلتر الايزوبروبانول وميليلتر 1 8 ميكروغرام/ميليلتر الجليكوجين (الحمض النووي الريبي الصف). دوامة لمدة 10 ق واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق أو في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  8. الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة كل من المادة طافية. وسوف تشكل بيليه أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
  9. إضافة 1 مل الباردة 75% إيثانول وأجهزة الطرد المركزي في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  10. إزالة كافة الإيثانول وجاف بيليه في درجة حرارة الغرفة حتى يتم ترك لا الإيثانول في الأنبوب.
  11. حل بيليه في 30 ميليلتر الدناز/رناسي المياه مجاناً، واحتضان لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية.
  12. قياس تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي (في 260 nm)، وضبط تركيز الحمض النووي الريبي إلى 50 نانوغرام/ميليلتر.

4-الخطوة واحد RT-PCR لقياس معدل SMN2 إدراج إكسون

  1. ميليلتر 12.5 مزيج من 2 × RT-PCR رد فعل المخزن المؤقت، مزيج ميليلتر 1.0 لأنزيم RT-PCR خطوة واحدة، 0.5 ميليلتر من كل التمهيدي (SMN2 إلى الأمام:-كتجككتككاتتككتكتج 5 '-3'، عكس SMN2 : 5 '-تجتجتكاتتاجتجكتجكتك-3'، جابده إلى الأمام: تكككتجاجكتجاكججاج 5 '-3'، عكس جابده : 5 '-جاجاجتتجتكجكتجت-3'، 2 ميليلتر من مجموع الحمض النووي الريبي (50 نانوغرام/ميليلتر)، والماء المقطر 8.5 ميليلتر رناسي/الدناز الحرة.
  2. بعد أن يتم تصنيعه كدنا عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تبدأ تفاعل PCR. تضخيم إكسون SMN2 6-8 مع 30 بكر دورات (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية ل 25 s). تضخيم جابده مع 20 PCR دورات (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، 68 درجة مئوية 20 s).
  3. إضافة 5 ميكروليتر 6 × تحميل صبغ للمنتج PCR، وتحميل 5 ميليلتر من الخليط 2% [اغروس] هلام وتشغيلها لمدة 40 دقيقة في 100 V.
  4. صورة للهلام وتحليلها باستخدام برنامج إيماجيج.
  5. قياس كثافة طول العصابات وعصابات Δ7. حساب معدل الشمول إكسون 7 بقيمة كثافة (طول)/(طول + Δ7 SMN2).

5-الكمية بكر (قبكر) لقياس معدل SMN2 إدراج إكسون

  1. لتوليف كدنا، مزيج 1 ميليلتر dT اليغو، 1 دنتبس ملم 10 ميليلتر، وميليلتر 11 مجموع الحمض النووي الريبي (50 نانوغرام/ميليلتر). احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. وضع العينات في الثلج وإضافة 4 ميليلتر 5 × المخزن المؤقت و 1 ميليلتر 0.1 M DTT 1 ميليلتر رناسي مثبط المنتسخة العكسية ميليلتر 1 لكل عينة.
  3. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، والحرارة تصل إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لوقف رد الفعل. ويمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
  4. تمييع كدناس مع المياه خالية من رناسي (1:5 إضعاف). ميكس 10 ميليلتر 2 x ميكس الإنزيم qPCR "الأخضر سيبر"، 0.8 التمهيدي 10 ميكرون كل ميليلتر (كامل طول SMN2 إلى الأمام: عكس SMN2 5-جكتاتكاتاكتجكتاتاتاتججتتت-3، كامل طول: 5-كتكتاتجككاجكاتتكتككتات-3, Δ7 SMN2 إلى الأمام: 5- TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′، Δ7 SMN2 عكس: 5 '-أتجككاجكاتتككاتاتاتاجكك-3, جابده إلى الأمام: 5-جكااتككاتجكاككجت-3'، عكس جابده : 5 '-أججاتكتكجكتككتجا-3)، 3 ميليلتر المخفف كدنا، والمياه خالية من رناسي ميليلتر 5.4.
  5. بدء رد فعل قبكر. استخدام الشروط: 95 درجة مئوية لمدة 30 s، ثم دورة 40 مكررة إلى 95 درجة مئوية ل 5 s و 60 درجة مئوية 20 s.
  6. حساب التعبير النسبي ل كامل طول SMN2 إلى جابده أو Δ7 SMN2، وتطبيع للخلايا غير المعالجة مع خوارزمية ΔΔCt.

6-الغربية النشاف

  1. إزالة تعداء المتوسطة من الخلايا، وتغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرة واحدة.
  2. إضافة 100 ميليلتر تحلل العازلة مع مثبط البروتياز.
  3. فصل الخلايا من الجزء السفلي من كل بئر استخدام مكشطة خلية عقيم، وجمع في أنابيب 1.5 مل. احتضان العينات في الثلج لمدة 30 دقيقة.
  4. تمر الخلية ليستي إبرة 21-ز 10 مرات لسحق الخلايا.
  5. الطرد المركزي في 20,800 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية في أنابيب 1.5 مل جديدة. ويمكن تخزين العينة في ثلاجة عميق-80 درجة مئوية.
  6. تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة "أدوات مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي"، وضبط التركيز إلى 1.0 ميكروغرام/ميليلتر.
  7. مزيج 5 ميليلتر عينات و 5 ميليلتر 2 × الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة العازلة (الحزب الديمقراطي الصربي 10%؛ ونسبة 14% 0.5M HCl تريس الحل، pH 6.7؛ 1% 0.5 م يدتا-2Na الأسهم الحل، pH 8.0؛ 20% والغليسيرول؛ وصبغ بروموفينول الأزرق 0.004%، 5% β-ميركابتوثانول) والحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  8. تحميل العينات إلى نسبة % 4-12 مكررا-تريس "البروتين" والهلام وتشغيل لح 1 في 150 الخامس.
  9. نقع ورقة تصفية سميكة في المخزن المؤقت لكل: (اﻷنود تتركز المخزن المؤقت: 0.3 M تريس-HCl، 20% ميثانول؛ اﻷنود المخزن المؤقت: 0.03 م تريس-HCl، 20% ميثانول؛ الكاثود المخزن المؤقت: 25 مم تريس، 20% ميثانول، 40 مم 6-n الأمينية-hexanoic حامض، والحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪).
  10. نقع غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن في الميثانول ل 20 ثانية، ثم نقلها إلى المخزن المؤقت اﻷنود.
  11. حجته الجل بعد الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع المخزن المؤقت السالب لمدة 5-10 دقيقة تحت التحريض.
  12. ضع أوراق التصفية والأغشية PVDF والهلام على آلة blotting شبه جاف، على النحو التالي: تتركز المخزن المؤقت اﻷنود اﻷنود الورق/الورق/PVDF/بروتين غشائي المخزن المؤقت هلام/الكاثود ورقة المخزن المؤقت (الشكل 2).
  13. تغطية المكدس وبدء النقل في 20 الخامس لمدة 30 دقيقة.
  14. بعد النقل، شطف غشاء PVDF مع ببست (برنامج تلفزيوني مع 0.05% 20 توين) مرة واحدة.
  15. كتلة الغشاء في درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة في 5% مسحوق اللبن المقشود حله في ببست أو عند 4 درجة مئوية لبين عشية وضحاها.
  16. تضعف جسم المضادة-الجالي ماوس المنقي وجسم أرنب كوفيلين المضادة للمضيفين في مسحوق الحليب المقشود 5% في ببست. احتضان الغشاء في ذلك ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  17. أغسل 3 مرات مع ببست لمدة 10 دقائق.
  18. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الماوس المضادة مترافق HRP الماعز والأرانب المضادة IgG (H + L)) للمضيفين في مسحوق الحليب المقشود 5% في ببست. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  19. يغسل الغشاء 3 مرات مع ببست لمدة 10 دقائق.
  20. الكشف عن إشارة الفرقة استخدام تشيميلومينيسسينسي الغربية كيت الكشف عن النشاف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام SMA المريض الخلايا الليفية، ونحن استهدفت منطقة المحطة الفضائية الدولية-N1 كاتم الصوت في إنترون 7 الجين SMN2 مع ثمانية ميكسميرس LNA/الحمض النووي العقاقير المختلفة التي تم transfected بتركيز 5 في شمال البحر الأبيض المتوسط (الشكل 3). كل من ميكسميرس الواردة فوسفوروثيواتيد تعديل العمود الفقري مما مكنها من مقاومة تدهور نوكلاس. لتقييم فعالية ميكسميرس، بمعدل إكسون SMN2 كان كمياً إدراج 7 RT-PCR واستخدام كبسولة تفجير محددة إلى SMN2qPC...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المختبر تقييم الأسلوب الموصوفة هنا سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار AONs مختلف. هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق على نطاق واسع لتخطي إكسون وإدراج جينات أخرى ومختلف أنواع الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ترانسفيكتيد معظم أيون كيمياء (باستثناء موظفي) باستخدام هذا الأسلوب. AONs يمكن تنظيم الربط من قبل-مرناً من الجينات الذاتية وأدخلت اصطناعياً على حد سواء، ويمكن أن يشترك transfected مع بلازميد ناقلات تحمل الجينات المستهدفة.

خطوة حاسمة لهذا الأسلوب أن كونفلوينسي خلية ينبغي أن يكون حو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون نيكول مكروري للحصول على مساعدة التجارب. هذا العمل كان تدعمها جامعة ألبرتا كلية الطب وطب الأسنان، منحة بحثية مؤسسة البحوث SMA سليبتشوك، المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، أصدقاء أموال البحث غاريت كومينغ، العصبي توبين جلالة أموال البحث العلمي، أن كندا ضمور العضلات، ومؤسسة كندا للابتكار، والمؤسسة ألبرتا والتعليم المتقدم، والنساء والأطفال معهد البحوث الصحية (وتشري).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
SMA FibroblastsCoriell NIGMS مستودع الخلايا الوراثية البشريةGM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11320033
مصل الأبقار الجنينيSigma-AldrichF1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL)Thermo Fisher15140122
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، أحمرالفينولThermo Fisher25300062
الوسائط المحرومة من المصلكاشف الإرسال الحراري فيشر31985070
Thermo Fisher15338100
غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول كلوروفورم (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
RT-PCR PrimersSequence 5 'to 3'SMN2
إلى الأمام: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 عكس: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH إلى الأمام: عكس TCCCTCGAGGCTGAACGGGAAG
GAPDH: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR بادئات
SMN2 كاملة الطول إلى الأمام:GCTATCATACTGGCTATTATGGGTTTT
SMN2 كامل الطول عكس: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH إلى الأمام: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH العكس:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
الكلوروفورمسيجما-ألدريتشP3803
الجليكوجين ، الحمض النووي الريبي الصفThermo FisherR0551
ImageJ Software
مثبط كوكتيل البروتياز   ؛Roche11836153001
Cathode Buffer0.025 M Tris base + 40   mM 6-aminocaproic acid + 20٪ ميثانول
أنود عازلة0.03 M Tris Base + 20٪ ميثانول
أنود مركز عازل0.3 M Tris base + 20٪ ميثانول
بيتا Mercaptoethanol   ؛MilliporeES-007-E
غشاء PVDF GE10600021
تحميل / عينة عازلة للنشاف الغربيNuPage InvitrogenNP007
خطوة واحدة RT-PCR kit  Qiagen 210210
dNTPsClontech3040

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4(2015).
  2. Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
  3. Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
  4. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
  5. Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
  6. Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
  7. Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
  8. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
  9. Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73(2007).
  10. Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
  11. Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
  12. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
  13. Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672(2017).
  14. Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
  15. Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
  16. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
  17. Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
  18. Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
  19. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
  20. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  21. Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
  22. Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
  23. Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13(2017).
  24. Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
  25. Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239(2010).
  26. Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
  27. Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
  28. Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
  29. Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
  30. Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

7 SMN2 RT PCR Mismers DNA LNA

مقالات ذات صلة