يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العلاج البطيني داخل المنظار مع Resiniferatoxin واختبارات الألم في الفئران

8.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57570

⸱

سبتمبر 2, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Clinical Pharmacy and Pharmacology, Musashino University, 2Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Musashino University

في هذه المقالة

ملخص

وقد اقترح مستقبلات عابرة نوع الفانيليايد المحتملة 1 (TRPV1) في المنطقة فوق مستوى السكان للعب بعض الأدوار في وظيفة الدماغ. هو موضح هنا بروتوكول للحقن intracerebrobrotricular من resiniferatoxin لتجاوز مستوى الحساسية TRPV1 في الفئران. كما يتم عرض إجراءات لبعض اختبارات الألم.

الملخص

ومن المعروف أن مستقبلات عابرة من النوع الفانيليا 1 (TRPV1)، قناة الموجبة الحرارية، لتحريك الألم في الأعصاب الطرفية. بالإضافة إلى وظيفتها الطرفية، وقد اقترح أيضا مشاركتها في وظائف الدماغ. وقد عرف Resiniferatoxin (RTX) ، وهو ناهض TRPV1 فائقة القدرة ، للحث على إزالة الحساسية على المدى الطويل من TRPV1 ، وكان هذا إزالة الحساسية نهجا بديلا للتحقيق في الأهمية الفسيولوجية للخلايا التعبير عن TRPV1. هنا نحن وصف بروتوكول لعلاج intracerebrobrotricular (i.c.v.) مع RTX في الفئران. يتم وصف الإجراءات لاختبار nociception لحفز TRPV1 الطرفية (اختبار RTX) والتحفيز الميكانيكي (اختبار ضغط الذيل) ثم اتبع. على الرغم من أن الاستجابات nociceptive من الفئران التي كانت تدار RTX i.c.v. كانت مماثلة لتلك التي من مجموعات التحكم، كانت الفئران RTX-i.c.v.تدار غير حساسة للتأثير مسكن من اسيتامينوفين، مما يشير إلى أن i.c.v. العلاج RTX يمكن أن تحفز إزالة الحساسية TRPV1 فوق مستوى الجنين انتقائية. ويمكن استخدام هذا النموذج الماوس كنظام تجريبي مناسب لدراسة دور TRPV1 في وظيفة الدماغ / فوق مستوى العمود الفقري. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنيات على دراسات الإجراءات المركزية للأدوية الأخرى.

المقدمة

تتلقى الحيوانات العديد من المحفزات الفيزيائية والكيميائية من بيئتها من خلال أجهزة الاستشعار على الأعصاب الطرفية. مستقبلات عابرة المحتملة نوع الفانيليا 1 (TRPV1) هي واحدة من الترسيمترية، قنوات الموجبة غير انتقائية التي تعمل كمستشعرات الحرارة1،2، ومن المعروف تفعيل و / أو تعديل TRPV1 لتكون خطوة رئيسية لالنابية في كل من السياقات العادية والتهابات3. على الرغم من أن نمط التعبير العام مثير للجدل ، فإن التعبير عن TRPV1 قد اقترح أيضًا في المناطق فوق مستوى العمود الفقري ، حيث يشارك في أنشطة مختلفة في الدماغ (بما في ذلك nociception4، thermoregulation5، القلق6، اضطراب فرط النشاط في عجز الانتباه7، والصرع8). وعلاوة على ذلك، فقد اقترح مؤخرا أن اسيتامينوفين، وهو مسكن للألم المستخدمة على نطاق واسع، يتوسط تفعيل TRPV1 المركزية لانتزاع عملها مسكن9،10.

إدارة ناهض TRPV1 الزائدة بما في ذلك الكابسايسين وراتنجيفراتوشين (RTX) إلى الحيوانات يؤدي إلى موت الخلايا العصبية TRPV1 إيجابية وطويلة الأمد إزالة الحساسية لناهضات TRPV111,12. جنبا إلى جنب مع التطبيق المحلي (داخلthecal13،14، intracisternal15،16،17، و intraganglional18) ، وقد وفرت هذه الطريقة الاستئصال الكيميائية وسيلة بديلة للتحقيق في الوظائف الفسيولوجية من TRPV1. لقد أبلغنا مؤخرا أن حقن intracerebrobrotricular (i.c.v.) من RTX يمنع تأثير مسكن من الأسيتامينوفين في الفئران، مما يشير إلى أن الحساسية TRPV1 فوق مستوىانتقائية 19. في هذه المخطوطة، نقدم البروتوكول الدقيق لحقن i.c.v. واختبارات الألم اللاحقة.

الحقن المباشر للأدوية في البطينين في الدماغ يجعل من الممكن لدراسة آثارها المركزية في حين الحد من أي آثار هامشية. إجراء الحقن i.c.v. المقدمة هنا هو تعديل للطريقة التي ذكرتها هالي وماكورميك20. هذه الطريقة بسيطة تنطوي على إدخال إبرة الحقن في البطينين الجانبي من خلال خياطة الإكلين ولا تتطلب أي معدات خاصة أو إجراءات جراحية للتكبيل.

التطبيق المحلي المحيطي لـ TRPV1 يثير إحساسًا بألم حارق والتهاب عصبي. الفئران التي يتم التعامل معها بشكل نظامي مع RTX، و الفأر TRPV1-KO، غير حساسة لهذا التحفيز13. لقد قمنا بالحقن داخل محطة الإذاعة والتلفزيون (RTX) لتأكيد الحفاظ على TRPV1 الطرفية في RTX-i.c.v. الفئران. هذا الأسلوب هو تعديل للتقليدية formalin اختبار21.

وقد أفيد أن الفئران تعامل بشكل نظامي مع RTX و TRPV1- KO الفئران تظهر عتبة طبيعية للمحفزات الميكانيكية11,13,22. هنا نقدم إجراء لاختبار ضغط الذيل لاختبار التغييرات في تأثير مسكن أسيتامينوفين.

كل هذه الإجراءات هي الأرثوذكسية وتنوعا، ويمكن تطبيقها على دراسات الأدوية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة لجامعة موساشينو على جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة هنا. تم الاحتفاظ بالفئران DdY الذكور (SLC, Shizuoka, Japan) لمدة 7 أيام على الأقل تحت دورة ضوء/داكنة 12-h قبل إجراء تجارب مع الماء والغذاء الإعلان libitum. 5- فئران عمرها 6 أسابيع استخدمت للتجارب.

1- تحضير المخدرات

  1. Rtx
    ملاحظة: يمكن أن يسبب حل RTX الكحولي حروقًا شديدة في الجلد وتلفًا للعين. تأكد من استخدام قفازات مطاطية ونظارات للحماية عند التعامل معها. يمكن استخدام هذا الحل للمخزون لمدة 6 أشهر.
    1. إضافة 500 μL من الإيثانول إلى 1 ملغ من RTX.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من البولي أوكسي إثيلين (20) monooleate السوربيتان إلى الحل أعلاه ودوامة جيدا.
    3. إضافة 4 مل من المالحة الفسيولوجية إلى الخليط ودوامة جيدا.
    4. Aliquot 40 ميكرولتر من الحل إلى أنابيب قبعة مسامير 1.5 مل، وتخزينها عند -40 درجة مئوية.
  2. اسيتامينوفين
    1. إضافة 20٪ ث / v propyleneglycol حل لاسيتامينوفين بتركيز 30 ملغ / مل, وتذوب مع sonicator. منذ الأسيتامينوفين قد تترسب في درجة حرارة الغرفة عدة ساعات بعد حل, الاستعداد فقط قبل استخدام أو الحفاظ على الحل دافئة حتى الاستخدام.

2. حقن تحت الجلد أو داخل الجمجمة البطينية من RTX

  1. اذيب المحلّل المخزن المعدّ في 1.1. أعلاه وتمييعه إلى 20 ميكروغرام / مل في السائل النخاعي الملحي أو الاصطناعي (ACSF) التي تتكون من (في mM): 119 NaCl، 2.5 KCl، 1 NaH2PO4،26 NaHCO3،11 جلوكوز، 1.3 MgSO4،2.5 CaCl2 توازن مع 95٪ O2 و 5٪ CO2 (pH 7.2).
  2. تخدير الفئران مع ملح الصوديوم pentobarbital (60 ملغ / كغ، intraperitoneally)، والتحقق من فقدان منعكس الحق.
  3. لعلاج s.c. ، حقن RTX (20 ميكروغرام / مل) في الجزء الخلفي من الرقبة في حجم 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم. بالنسبة لمجموعة التحكم، قم بحقن السيارة (10٪ إيثانول، 10٪ بوليوكسي إثيلين (20) مونووليات السوربيتان و 80٪ ملحي) بنفس الطريقة.
  4. بالنسبة للعلاج i.c.v. ، قم بحقن 5 ميكرولتر من RTX (20 ميكروغرام / مل) في البطين الجانبي الأيمن. بالنسبة لمجموعة التحكم، قم بحقن السيارة (10٪ إيثانول، 10٪ من البولي أوكسي إثيلين (20) مونووليات السوربيتان و 80٪ ACSF) بنفس الطريقة.
    1. تمرير إبرة 27-G المتاح من خلال أنبوب معدني (0.8 مم م. د.) لفضح 3.0-3.5 ملم طرف الإبرة (الشكل 1A).
    2. تطهير رأس الفأرة مع الكحول 70٪ ، وعقد عظام squamosal من الفأر بحزم مع الأصابع (الشكل 1B).
      ملاحظة: انتبه إلى مواقف نتوءات squamosal، لأن هذه النتوءات ستكون بمثابة معالم للحقن.
    3. حرك الإبرة بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّيّ على فروة الرأس، وَجدَ خياطة القوس حيث أنّ طرف الإبرة مُرَكَّب على الغرزة.
    4. حرك التلميح حوالي 1 مم إلى اليمين، ثم حرك التلميح بشكل مُجَرّد، ثم ابحث عن خياطة الإكلال كما هو الحال مع 2.4.3. (الشكل 1B).
    5. أدخل الإبرة ببطء وعموديا، وحقن محلول RTX في حوالي 10 ثوان، واحملها لمدة 10 ثوانٍ.
    6. سحب الإبرة ببطء، والعودة إلى قفص الماوس المنزل. عادة ما يكون النزيف ضئيلًا أو غائبًا. إذا حدث نزيف كبير، ينبغي النظر في استخدام ماوس آخر.
  5. تعيين الفئران المعالجة المسبقة كمواضيع لاختبار RTX أو اختبار ضغط الذيل (الخطوة 3 و 4، على التوالي).

3. اختبار RTX

ملاحظة: يتم إجراء الاختبار بين الساعة 10:00 صباحًا والساعة 5:00 مساءً. يتم الحفاظ على غرفة الاختبار في 200 لوكس و 24-26 درجة مئوية.

  1. بعد أسبوع من المعالجة المسبقة مع RTX (الخطوة 2. ) ، قم بنقل الفئران إلى غرفة الاختبار قبل 60 دقيقة على الأقل من بدء الاختبار.
  2. وزن ووضع كل فأرة على حدة في قفص زجاج شبكي (29.5 × 17.5 × 13.5 سم3 ارتفاع) على الأقل 30 دقيقة قبل بدء الاختبار من أجل السماح لها بالتأقلم مع البيئة.
    ملاحظة: يجب أن يكون ترتيب الاختبارات موازن عبر مجموعات المعالجة المسبقة.
  3. يُعطى الأسيتامينوفين (300 ملغ/كغ) إلى الماوس داخل الصفاق 20 دقيقة قبل الاختبار.
  4. أمسك الماوس بشكل فضفاض في كيس من القماش الصغير، وأدخل إبرة من عيار 30 في كعب مخلب الظهر الأيمن. تقدم الإبرة تحت الجلد إلى قرب منصات المشي، وحقن 20 ميكرولتر من محلول RTX (0.05 ميكروغرام/مل).
  5. قياس فترة لعق / العض السلوك في المنطقة theglabrous من مخلب المتضررة في كل كتلة 5 دقائق.

4. اختبار ضغط الذيل

ملاحظة: يتم استخدام مقياس الضغط من نوع راندال-Selitto لتقييم عتبة الناوستستين الميكانيكي الحاد. يتم إجراء الاختبار بين الساعة 10:00 صباحًا والساعة 5:00 مساءً. يتم الحفاظ على غرفة الاختبار في 200 لوكس و 24-26 درجة مئوية.

  1. بعد أسبوع واحد من المعالجة المسبقة مع RTX (الخطوة 2.) ، نقل الفئران إلى غرفة الاختبار ، ووزن ووضع كل فأرة على حدة في قفص زجاج شبكي.
  2. ضع علامة على البقع على 1.5 و 2.5 سم من قاعدة الذيل.
  3. عقد الماوس فضفاضة في كيس من القماش الصغيرة، وتطبيق الضغط على البقع مع مسبار حادة.
    ملاحظة: يتم فرض ضغط قطع 250 غرام لتجنب تلف الأنسجة.
  4. تحديد الضغط المطلوب لانتزاع سلوك الهروب (ذيل الخفقان، التواء، والصرير)، وحساب عتبة nociceptive عن طريق متوسط الضغط المحدد في البقعتين.
  5. كرر الخطوات 4.3. إلى 4.4. كل 15 دقيقة.
  6. بعد الحصول على خط الأساس، قم بإعطاء الأسيتامينوفين (300 ملغ/كغ) إلى الفأر داخل الصفاق. بعد الإدارة، كرر الخطوات 4.3. و4.4 كل 15 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لا تظهر الفئران المعالجة بالـ i.c.v.- أي تشوهات ظاهرة في مظهرها، وأنشطتها العفوية، ووزن الجسم19 ودرجة حرارة الجسم الأساسية (المجموعة المعالجة بالمركبات، 38.4 ± 0.3 درجة مئوية، ن = 6؛ مجموعة معالجة RTX، 38.7 ± 0.2 درجة مئوية، ن = 6).

ويبين الشكل 2A-B مدى استجابة الفئران المعالجة من قبل s.c.v.- إلى حقن RTX داخل البلانتار. كان سلوك اللعق / العض للفئران المعالجة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوة الأكثر أهمية في هذه التجارب هو نجاح حقن i.c.v. تقنية الحقن i.c.v. المستخدمة هنا بسيطة جدا ولكنها تتطلب بعض الممارسة. قبل التجارب، ينصح ممارسة مع الأصباغ (على سبيل المثال 0.5٪ trypan الأزرق في المالحة). إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح ، يجب أن تكون علامة الإبرة واضحة على خياطة الإكليل وينبغي أن تكون الصبغة المحقونة موجودة في البطين المقابل والبطين الثالث. وعلاوة على ذلك, يجب تجنب الإدراج القسري أثناء الحقن. إذا تم وضع طرف الإبرة بشكل صحيح على خياطة الإكلال، يجب أن تخترق الإبرة الجمجمة بسلاسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنوا

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ResiniferatoxinLKTR1774المستخدمة في المعالجات المسبقة s.c. / i.c.v. واختبار RTX
أسيتامينوفينIWAKI SEIYAKUموهوب من IWAKI SEIYAKU
ملح الصوديوم بنتوباربيتالطوكيو للصناعة الكيميائيةP0776المستخدم في التخدير
الإيثانول (99.5)Wako Pure Chemical Industries057-00456المستخدمة لإذابة RTX
بولي أوكسي إيثيلين (20) سوربيتان مونولياتواكو للصناعات الكيماوية النقية161-21621تستخدم لإذابة RTX
25 &# 956 ؛ L حقنة دقيقةهاميلتون1702LTالمستخدمة في حقن i.c.v.
100 &# 956; L حقنة صغيرةهاميلتون1710LTتستخدم للحقن داخل أخمص
26 قياس إبرة يمكن التخلص منهاTERUMONN-2613Sالمستخدمة في حقن IV
30 قياس إبرة يمكن التخلص منهاNIPRO01134تستخدم للحقن داخل أخمص
مقياس الضغطUgo BasileAnalgesy-Meter Type 7200المستخدمة لاختبار ضغط الذيل
مختبرات البحر البحر

المراجع

  1. Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
  2. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  3. Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
  4. Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
  5. Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
  6. Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
  7. Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
  8. Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
  9. Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
  10. Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690(2013).
  11. Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
  12. Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
  13. Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
  14. Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021(2009).
  15. Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
  16. Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
  17. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43(2008).
  18. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  19. Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452(2017).
  20. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  21. Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
  22. Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
  23. Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
  24. Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
  25. Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

حقن داخل البطينات الدماغيةالعلاج بالريزينيفراتوكسينإزالة حساسية TRPV1اختبارات الألم في الفئراناختبار ضغط الذيلاختبار RTX لاستقبال الألمتسكين الآلام باستخدام الأسيتامينوفينانتقائية فوق النخاعيةعلم الأدوية العصبي للفئرانمنشط TRPV1
العلاج البطيني داخل المنظار مع Resiniferatoxin واختبارات الألم في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.