مقالة منهجية

إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل

11.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57592

⸱

مايو 22, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد ليغومرات Aβ من ببتيد اصطناعية في المختبر وتقييم الكميات النسبية من Aβ oligomer بنقطة النشاف التحليل.

الملخص

اميلويد بيتا (Aβ) ببتيد مسعور مع اتجاه جوهرية لتجميع ذاتي في المجاميع. بين مجاميع مختلفة، Aβ oligomer مقبول على نطاق واسع عصبي الرائدة في التقدم لمرض الزهايمر (AD) ويعتبر أن الحدث الحاسم في الآلية المرضية للإعلان. ولذلك، قد منع نيوروديجينيريشن مثبطات oligomer Aβ ويمكن أن توضع كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. ومع ذلك، تشكيل مختلف بروتوكولات Aβ oligomer قد تؤدي إلى ليغومرات ذات خصائص مختلفة. وعلاوة على ذلك، لا توجد العديد من الطرق لفعالية الشاشة Aβ1-42 مثبطات أوليجومير. يمكن أن يتفاعل جسم A11 مع مجموعة فرعية أوليجومير1-42 Aβ السمية مع هياكل موازية لمكافحة β-ورقة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية إعداد نموذج Aβ A11-إيجابية غنية أوليجومير1-42 من اصطناعية Aβ1-42 ببتيد في المختبر وتقييم كميات نسبية من أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية في عينات من النشاف دوت تحليل استخدام A11 و Aβ1-42-الأجسام المضادة 6E10 محددة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أيضا فحص مثبطات أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية من النتائج التجريبية شبه كمي.

المقدمة

مرض الزهايمر (ميلادي) واحد من أهم الأمراض الأعصاب التي تؤثر على كبار السن في جميع أنحاء العالم1. من المقبول على نطاق واسع أن التجميع غير طبيعي من بيتا-اميلويد (Aβ) قد يكون العامل المرضية الرائدة للإعلان. Aβ المجاميع هي المكونات الرئيسية من لويحات خرف، واحدة من علامات بيولوجية في أدمغة المرضى الإعلانية. وعلاوة على ذلك، تنتج المجاميع Aβ، بما في ذلك ليغومرات على وجه الخصوص، السمية العصبية القوية، التي قد يكون سبب الوفاة العصبية كما تقدم الإعلانية. ولذلك، قد منع تثبيط تشكيل oligomer Aβ نيوروديجينيريشن، ويمكن وضع مثبطات oligomer Aβ كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. واستخدمت العديد من الدراسات ببتيد Aβ اصطناعية لتشكل ليغومرات في المختبر، واستكشاف مورفولوجيس وهياكل اصطناعية Aβ ليغومرات، والتحقيق مثبطات oligomer Aβ تستخدم في المختبر نماذج2،3 , 4-ولكن مختلفة في المختبر تكوين بروتوكولات Aβ oligomer يمكن أن يؤدي إلى أوليجومير مع الخصائص المورفولوجية المختلفة، مما قد يؤدي إلى نتائج لا تضاهي بين المجموعات البحثية المختلفة. ولذلك، ثمة حاجة ملحة بروتوكول تكوين قياسي ل Aβ oligomer.

حتى الآن، أبلغ عن أساليب كثيرة غير مباشرة الكشف عن ليغومرات Aβ. مجهر إلكتروني (TEM) غير يشوه التفريد جل والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ودوت النشاف التحليل يمكن استخدامها لدراسة كمية و/أو مورفولوجية Aβ oligomer في المختبر5، 6. على سبيل المثال، يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا وهيكل Aβ oligomer في TEM. ويمكن قياس الكميات النسبية والحجم الجزيئي لتجميعات Aβ بالتفريد جل غير يشوه. أليسا يمكن استخدامها لتحديد oligomer Aβ في المصل والبلازما، ومقتطفات من أنسجة المخ. وأخيراً، دوت النشاف التحليل، تقنية تستخدم للكشف عن، تحليل وتحديد البروتينات، يمكن استخدامها لتقييم تركيز نسبي oligomer Aβ في عينات مختلفة مع المساعدة من الأجسام المضادة أوليجومير و Aβ محددة. وعلاوة على ذلك، يوفر نقطة النشاف المقايسة قدرا كبيرا من الوقت وفورات، التفريد جل وإجراءات بلوتينج للمواد الهلامية غير مطلوبة. ولذلك، يستخدم هذا الفحص عادة مثبطات oligomer Aβ المحتملة في الشاشة. والهدف العام من هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا وموثوق بها، واستنساخه لإعداد نموذج غنية أوليجومير1-42 Aβ، لتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ دوت النشاف التحليل، وعلى الشاشة Aβ oligomer مثبطات استخدام النتائج التجريبية شبه كمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-حل إعداد

ملاحظة: انظر الجدول للمواد لمصادر كاشف.

  1. تعد حلاً ألبومين مصل بقرى 5% (BSA) عن طريق إضافة 5 غ من جيش صرب البوسنة إلى 100 مل الماء المقطر مزدوجة. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. تعد حلاً A11 oligomer المضادة الأجسام المضادة (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل حل جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. تعد حلاً 6E10 الأجسام المضادة-Aβ (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل من محلول جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  4. تعد حلاً OC الأجسام المضادة أوليجومير المضادة فيبريلار (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل من محلول جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  5. إعداد تريس مخزنة مالحة (تبس) أسهم حلاً عن طريق إضافة ز 24 قاعدة تريس و 88 جرام من كلوريد الصوديوم إلى 1,000 مل من الماء المقطر مزدوجة. قم بضبط ال pH إلى 7.4. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  6. تعد تريس مخزنة المالحة والحل توين-20 (تبسة) عن طريق إضافة 1 مل من توين-20 إلى 100 مل TBS مخزون المياه المقطرة مزدوجة الحل و 900 مل.
  7. تحضير حلاً جسم ثانوية بإضافة ميليلتر 10 من الفجل البيروكسيديز (HRP) الماعز المضادة أرنب مفتش (H + L) إلى 10 مل من محلول تبست. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  8. حل ز 3.68 من الكركمين في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أن يشكل حلاً أسهم الكركمين 10 ملم.
  9. حل 5 ملغ Aβ الاصطناعية1-42 في 2 مل من 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورو-2-بروبانول (هفيب) تشكل حلاً مونومر Aβ 2.5 ملغ/مل. ووضعه في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) عن 20 دقيقة تجعل 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    ملاحظة: يجب تشغيل هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن. وينبغي قطع نصائح ماصة لضمان بيبيتينج دقيقة.
  10. تحضير السائل اليكتروتشيميلومينيسسينسي (القامة) بخلط مسافنة السوائل A و B بنسبة 1:1 حجم. وينبغي إعداد هذا الحل فقط قبل الاستخدام.

2. إعداد نموذج

ملاحظة: إجراء إعداد عينة أيام 2 قبل النقطة النشاف التحليل.

  1. إضافة 900 ميليلتر من الماء المقطر مزدوجة إلى أنبوب Aβ1-42 مونومر الحل؛ وسيكون تركيز Aβ1-42 0.25 مغ/مل. ضع الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. تتبخر الحل مع غاز النيتروجين عالي النقاء حتى يصل حجمه حوالي 850 ميليلتر. وسيكون تركيز الحل1-42 Aβ حول 0.29 mg/mL.
    ملاحظة: الحل يجب أن تهتز من وقت لآخر لضمان كامل يتبخر في هفيب. عادة، هو حجم الحل المتبقي بعد 30 دقيقة من التبخر، حوالي 850 ميليلتر.
  3. تمييع الحل الكركمين الأسهم لإيجاد حل عملي الكركمين (0.2 و 2 ميكرومتر) مع الماء المقطر مزدوجة. مزيج Aβ الحل1-42والكركمين يعمل الحل مع حجم نسبة 1:1. وسيكون النهائي تركيزات الكركمين 0.1 و 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن أن تكون مختلطة مثبطات أوليجومير المحتملة مع الحل1-42 Aβ في أي نسبة إذا لزم الأمر.
  4. اهتز الحل باستمرار في المحرض مغناطيسي (انظر الجدول للمواد).
    1. إصلاح مربع مقسم بلاستيك للمحرض المغناطيسية. 2 مكان المغناطيسي يحرك الحانات في زوايا المربع 2 ووضع الأنابيب العينة في مركز المربع.
    2. اهتز المربع في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ح 48.
      ملاحظة: سرعة المحرض المغناطيسي هو حوالي 60 لفة في الدقيقة.
  5. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية و 18,000 خ زاي جمع المادة طافية.

3-تحليل النشاف دوت

ملاحظة: تجري جميع إينكوبيشنز شاكر أفقي.

  1. قطع غشاء النيتروسليلوز إلى شرائح 1 سم على نطاق واسع.
    ملاحظة: يمكن ضبط عرض الغشاء النيتروسليلوز وفقا للاحتياجات التجريبية.
  2. وضع العينات 2-ميليلتر بالتساوي على شرائط 2 (قطاع 1 و 2) مع الفاصل الزمني لكل نقطة في 0.5 سم.
  3. ضع الشرائط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق حتى الحبرية في الفرقة الجافة.
  4. احتضان الشرائط مع حل جيش صرب البوسنة 5% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. شطف الشرائط مع حل تبست لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. نضح الحل تبسة. 1 ح في درجة حرارة الغرفة، لاحتضان قطاع 1 مع جسم أوليجومير المضادة حل A11 وقطاع 2 مع حل 6E10 الأجسام المضادة-Aβ.
  7. شطف الشرائط مع حل تبسة ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. نضح الحل تبسة. احتضان الشرائط مع حل جسم ثانوية لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. شطف الشرائط مع حل تبسة ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. تطبيق بالتساوي السائل مسافنة مختلطة إلى سطح الشرائط. يعرض الشرائط في تشيميلومينيسسينسي تلقائية نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: عادة، 300 ميليلتر من السوائل يصدرون ما يكفي لغشاء واحد. يجب أن يبقى الغشاء رطبة خلال التعرض. ويحسب وقت التعرض تلقائياً بنظام التصوير.
  11. القيام بتحليل درجات رمادي باستخدام إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) أو برنامج معالجة الصور آخر للحصول على نتائج شبه كمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقيق في ما إذا كان مونومر1-42 Aβ يمكن أن تشكل أوليجومير1-42 Aβ بعد إعداد، تم استخدام تحليل ال. لا تظهر المجاميع لوحظت في العينة مونومر Aβ حل هفيب1-42 (الشكل 1أ). وعلاوة على ذلك، أساسا كروي المجاميع التي يبلغ قطرها حوالي 10-80 نانومتر وقد لوحظت في العينة1-42 Aβ بعد 48 ساعة من الهز، مما يوحي بأن أشكال Aβ1-42 ليغومرات بعد التحضير (الشكل 1ب).<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول، أبلغنا طريقة لإعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير1-42 Aβ، وتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ A11-الإيجابية بنقطة النشاف تحليل. على الرغم من أن لدينا أساليب لإعداد العينات الغنية أوليجومير1-42 Aβ بسيط جداً، ويمكن الاعتماد عليها، واستنساخه، لا تزال هناك بعض النقاط يمكن ملاحظتها. أولاً، يستخدم هفيب لحل الببتيد1-42 Aβ الاصطناعية. يمكن تفكيك ببتيد1-42 Aβ مجمعة في مونومر في حل هفيب. ومع ذلك، هفيب سهل لتطيير، ولزوجة هفيب منخفض جداً. ولذلك، ينبغي أن تحل البب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" (U1503223، 81673407، 21475131)، تطبيق مشروع البحث المتعلق بالتكنولوجيا غير ربحية لمقاطعة تشجيانغ (2016 ج 37110)، نينغبوه الدولي للعلم والتكنولوجيا مشروع التعاون (10019 د 2014)، فريق الابتكار بلدية نينغبو لعلوم الحياة والصحة (2015 ج 110026)، علوم نينغبو & مشروع التكنولوجيا للثروة المشتركة (ج 2017 50042)، مجموع داك لي ييب صندوق التنمية الصيدلانية البيولوجية البحرية كينيث لي تشين ييو والصندوق ك جيم وونغ ماجنا في نينغبو جامعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A11 (ab126892 Rb pAb إلى قلة الأميلويد) AbcamGR91739-58
6E10 (بيتا أميلويد الأرنب Ab)الخلية & nbsp ؛ تقنية الإشارات2454S
OC (الأجسام المضادة للألياف النشوانية OC)MilliporeAB2286
الفجل الحار بيروكسيداز (HRP) علامة الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L)   ؛BeyotimeA0208
A & beta ؛ 1-42< / sub>GL Biochem52487
1،1،1،3،3،3-Hexafiuoro-2-propanolعلاء الدينI1523078
الكركمينسيجماC1386
الألبومين البقري VSolarbioA8020
كلوريد الصوديومسانجون التكنولوجيا الحيويةD920BA0003
كبريتات دوديسيل الصوديومSCR30166428
TRISSolarbioT8060
GlycineSolarbioG8200
  ثنائي ميثيل سلفوكسيدSolarbioD8370
5 & مرات ؛ هلام غير تطبيط PAGE علامة البروتينBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
غشاء نشاف النيتروسليلوز النقيPall CorporationT50189
الميثانولSCR10014118
الإيثانولSCR10009218
نطاق منخفض للغاية   ؛ بروتين ماركرSolarbioPR1300
أغشية نقلImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue حل تلطيخ سريعBeyotimeP0017
نظام تصوير التلألؤ الكيميائي الأوتوماتيكيTanon TanonTanon 5200
Image JNational برامج معالجة الصور في المعاهد الصحية
أدوبيفوتوشوب CS6
المحرض المغناطيسيشنغهاي هكسي

المراجع

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
  8. Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
  9. Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
  10. Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).
  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A11 TBST

مقالات ذات صلة