نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لتنمو الأجهزة الدجاج الجنينية في المختبر. باستخدام هذا الأسلوب، تنمية الأنسجة الجنينية الدجاج يمكن دراستها، مع الحفاظ على درجة عالية من السيطرة على البيئة الثقافة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الدجاج الجنينية يستخدم عادة ككائن نموذج موثوق بها للتنمية الفقاريات. إمكانية الوصول وحضانة قصيرة الفترة يجعلها مثالية للتجريب. حاليا، تجري دراسة هذه المسارات الإنمائية في الجنين الدجاج بتطبيق مثبطات والمخدرات في مواقع محلية وتركيزات منخفضة باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب. استزراع الأنسجة في المختبر هو أسلوب الذي يتيح دراسة الأنسجة فصلها عن الكائن الحي المضيف، بينما في الوقت نفسه تجاوز العديد من القيود المادية الحالية عند العمل مع الأجنة كله، مثل قابلية الأجنة إلى جرعات عالية من المواد الكيميائية يمكن أن تكون مميتة. نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لاستزراع الدجاج الجنينية نصف الرأس في المختبر، مما يتيح فرصاً جديدة للنظر في العمليات الإنمائية وراء الأساليب المتبعة حاليا.
المقدمة
الدجاج الجنينية (Gallus gallus) كائن حي نموذجية ممتازة استخداماً في مجال البيولوجيا. فترة حضانة المرض ما يقرب من 21 يوما، ويمكن المحتضنة الكثير من البيض في وقت واحد، مما يجعل تجربة سريعة وفعالة. ولعل الأهم من ذلك، الجنين هو أيضا بسهولة التلاعب بها، تمكن الدراسة المستفيضة للعمليات الإنمائية الرئيسية والجينات والبروتينات التي تدفع هذه العمليات.
العين الدجاج الجنينية هو جهاز معقدة التي تنشأ عن طريق التفاعل بين عدد من أنسجة مختلفة مشابهة للعديد من أجهزة الجسم الأخرى. هذا الأسلوب يتيح لدراسة وضع هذه الأنسجة، ولا سيما في مراحل متقدمة من التنمية. على سبيل المثال، قد تكون الشبكية متعددة الطبقات ذات أهمية خاصة لأولئك الذين يدرسون تطوير النظام العصبي. الأساليب البديلة التي تمكن من دراسة أنسجة العين الأخرى كالقرنية والجسم فيتريل، العدسة، والصلبة العينية والجفون ذات فائدة للباحثين. العين الدجاج الجنينية يحتوي أيضا على سلسلة من العظام المسطحة، والعظيمات scleral، التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة تعريفية العظام إينتراميمبرانوس والتحجر في الفقاريات1.
حاليا، هناك عدد من الأساليب المستخدمة لدراسة التطور الجنيني. ميكروينجيكشنز الأجسام المضادة المثبطة أو غيرها الجزيئات المثبطة2،3، مزروع جراحيا ميكروبيدس غارقة في المانع4، وهي انهانسر5 كافة الأساليب التي يمكن استخدامها للجينات دوونريجولاتي أو البروتينات للاهتمام بجنين. وتستخدم أساليب مماثلة للبروتينات أوبريجولاتي. هذه الطرق لا تخلو من أوجه القصور. على سبيل المثال، عند استخدام المواد الكيميائية لتغيير وضع الجنين، يجب تقييم آثار قاتلة على الجنين، وهذا يحد من استخدام الأساليب المذكورة أعلاه للمواقع المترجمة للتطبيق عند التعرض لجرعات منخفضة بما يكفي لضمان استمرارية الجنين.
في المختبر استزراع الأنسجة قد استخدمت في طائفة واسعة من الكائنات الحية لدراسة التنمية ويمكن استخدامها لتجاوز بعض القيود المذكورة أعلاه. على سبيل المثال، فيمورى6وريشة براعم7،8، و أطرافه9 من الدجاج كل درست باستخدام أساليب، استزراع الأنسجة الخصيتين الماوس10 والجذور وينبع من النباتات11. تمنح هذه الأساليب العلماء بدرجة عالية من التحكم في تنمية الأنسجة، مثل القدرة على التقلب في درجة الحرارة وتغير توافر المغذيات. عزل الأنسجة من الجنين كله أيضا يجعلها أقل عرضه للآثار المميتة للمواد الكيميائية، مما يمكن التلاعب بدراسات على نطاق عالمي في تركيزات أعلى. هناك ميزة أخرى بارزة في المختبر استزراع هو الحفاظ على البيئة في الأنسجة الخلوية؛ ترتيب الأنسجة يظل دون تغيير نسبيا، مما يجعل من الممكن دراسة التفاعلات بين أنواع مختلفة من الأنسجة9. وهكذا، في المختبر استزراع يفتح الأبواب أمام إضافية تجريبية النهج غير متوفرة في النماذج في فيفو أو في ovo .
دراسة تطوير العين الدجاج الجنينية باستخدام المواد الكيميائية حاليا تحديا كبيرا. تغطية عدد من الأغشية اكسترامبريونيك الجنين، مما يجعل من الصعب على تطبيق ميكروبيدس أو المواد الكيميائية؛ الجنين أيضا جداً نشطة داخل البيضة كما يحصل كبار السن، مما زاد من تعقيد أسلوب صعبة بالفعل. هذا البروتوكول يتيح سهولة الوصول إلى العين والأنسجة المحيطة بها، إزالة هذه الحواجز، بينما توفر أيضا فرصاً جديدة دراسة العمليات الإنمائية داخل العين. تم إنشاء هذا البروتوكول لدراسة تنظيم دورات تعريفية العظيمات scleral داخل العين الجنينية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: لمراحل الجنين، والاستفادة من همبرغر وهاملتون12 (ح ح) تنظيم الجدول.
1-الجنين الحضانة
- احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة العقيمة، ودرجة الحرارة التي تسيطر على 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية و ~ 40% رطوبة.
- تشغيل البيض 1 x يوميا والسماح لهم باحتضانها ل HH34 (التسميد بعد 8 أيام).
2-الإعداد والتعقيم المواد
- للأجنة 12، اﻷوتوكﻻف 2 لتر ماء المقطر، L 1 الملحية الفرخ 0.85 في المائة، 12 الزجاج الماصات، مربع 1 ورقة والأنسجة والساحات 24 سم 2.5 x 2.5 سم من ورق الترشيح شبه مسامية والساحات 24 سم 2.5 x 2.5 سم من أسلاك الفولاذ مش مع حواف منحنية إلى أسفل. لتعقيم المواد، اﻷوتوكﻻف لهم في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: يمكن أن يتم التعقيم المواد في وقت مبكر. - تعقيم الحاضنة مع الإيثانول 70% بالمسح الجانبين ورفوف وباب. 2 مكان حاويات بلاستيكية تحتوي على يعقم المقطر المياه داخل الحاضنة للحفاظ على رطوبة. بريوارم حاضنة الثقافة إلى 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية و ~ 40% رطوبة. ضمان الحاضنة مظلمة تماما؛ إذا كان الباب شفاف، تغطي بورق ألمونيوم.
- بريوارم 100 مل من المغذيات المتوسطة و 1 مل من البنسلين بوضعها في حاضنة الثقافة.
- وتغطي مساحة العمل مع منشفة ورقية وتعقيم على مقاعد البدلاء برش عليه مع الإيثانول 70%. تعقيم 2 زوجاً من ملقط ومقص التشريح وشفرة حلاقة وملعقة بلاستيكية مع الإيثانول 70% بطريقة مماثلة.
- أطباق بتري معقمة 100 مم 12 مكان وأطباق بيتري معقمة 35 ملم 24 على مقاعد البدلاء للاستخدام. ضمان الأطباق تظل في كيس معقم حتى الاستخدام.
3-الجنين إعداد
ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، ارتداء قناع لوجه غبار واقية لتجنب تلويث الثقافات. سوف تدمر عدوى البكتيرية أو الفطرية الثقافة، وهناك خطر لأنه ينتشر بسرعة إلى جميع الثقافات في الحاضنة.
- الكراك فتح البيضة ونقل الجنين إلى طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على المحلول الملحي الفرخ 0.85 في المائة. مرحلة الجنين وفقا للميزات التشريحية الموصوف في همبرغر وهاملتون التدريج المبادئ التوجيهية12 والتأكد من الجنين في HH34.
- قطع الرقبة وثم تقسم رأس الجنين في خط الوسط باستخدام شفرة حلاقة معقم. استخدام الملقط العقيمة، إزالة الدماغ. ترك المنقار سليمة.
4-الثقافة الإعداد
- 2 مكان من أطباق بتري 35 مم داخل طبق بيتري 100 مليمتر واحد.
- وضع شبكة أسلاك الفولاذ داخل كل طبق بتري 35 ملم.
- استخدام الملقط، نقل 1 الرؤساء منطقتي بقطعة من ورق الترشيح شبه مسامية 2.5 × 2.5 سم بالعين مواجهة. ضمان الأنسجة آمنة ولا تنزلق قبالة عن إمالة فإنه قليلاً.
- استخدام الملقط، بعناية وضع نسيج العين وورق الترشيح على رأس شبكة أسلاك الفولاذ في 1 أطباق بتري 35 مم، خلق مرحلة أثيرت مع نسيج العين على أعلى.
- كرر الخطوات من 4، 3 و 4-4 مع نصف الرأس الأخرى.
- استخدام ماصة زجاجية معقمة، بعناية إضافة المتوسطة المغذيات مباشرة في كل طبق بتري 35 مم حتى يصل إلى مستوى الورقة عامل التصفية. لا تغرق نصف رأس في الأجلين المتوسط والمغذيات.
- إضافة 50 ميليلتر من 10,000 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين المتوسطة المغذيات في كل طبق بيتري.
- اطوِ قطعة من المناديل الورقية في مربع صغير ووضعه داخل مم 100 طبق بيتري. ترطيب أنه مع الماء المقطر يعقم.
- ضع الطبق الثقافة إلى حاضنة العقيمة، والظلام في 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية و ~ 40% رطوبة لمدة تصل إلى 4 أيام.
- كرر الخطوتين 3 و 4 لكل جنين.
ملاحظة: عدد الأجنة اللازمة سوف تعتمد على التجربة محددة؛ هنا، يمكننا وصف البروتوكول للأجنة 12.
5-ثقافة الصيانة
- مرة واحدة يوميا، أعلى في حاويات بلاستيكية في الحاضنة مع الماء المقطر الطازجة، ويعقم.
- يوميا تحقق جميع الثقافات للعدوى البكتيرية أو الفطرية. الثقافات التي قد تفككت أو التي تغيرت المتوسط لون مصابون. تجاهل جميع الثقافات التي هي المصابة.
6-التثبيت
- بعد استزراع، إزالة جميع الأطباق من الحاضنة.
- برفق باستخدام زوج من الملقط، إزالة العين من ورق الترشيح، مع الحرص على عدم تمزيق النسيج.
- إصلاح نسيج العين في بارافورمالدهيد 4% 1 × مخزنة الفوسفات المالحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو الفورمالين 10% مخزنة محايدة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- تخزين الأنسجة في 4 درجات مئوية في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا الأسلوب، يمكن مثقف عين دجاج جنينية من يوم 8 من تطورها (HH34) في المختبر لمدة 4 أيام. أربعة أيام في ovo التنمية يناظر HH38.
ويدعم هذا الأسلوب تثقيف وضع براعم ريشة المحيطة بالعين والجفون (الشكل 1B). لا تكون هذه البراعم ريشة الحالية في ovo في HH34 قبل استزراع (الشكل 1A)، مما يشير إلى أن تبدأ التنمية برعم ريشة أثناء فترة تثقيف، كما هو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يجعل استخدام أنسجة المنشأة استزراع تقنيات لتحقيق نمو العين الدجاج من الجنينية يوم 8 (HH34) في المختبر لمدة 4 أيام. ووصف هذا الأسلوب استزراع الشبكة أصلاً تروويل15. نحن الأمثل بروتوكولا من بينتو وقاعة لعام 1991 دراسة16 استخدام غشاء شبه مسامية مع الشبكة لدراسة الإشارات الاستقرائي بين طبقات الأنسجة المنفصلة من العين الدجاج الجنينية15. باستخدام هذا الأسلوب، صرصور مثقف عظم الدجاج 14-القديمة يوم6. كما أثبت هذا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب يود أن يشكر غريغوري هالر (جبل سانت فنسنت جامعة) لعمله الأولى في تطوير البروتوكول. أيضا يود المؤلفون أن يشكر نيكولاس جونز (جبل جامعة سانت فنسنت) للخبرة الفنية والمساعدة بتصوير وإنتاج الجزء السمعية والبصرية من المخطوطة. دانيال أندروز كانت مدعومة بتمويل من مسفو والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) عبر "تحكيم البحوث الطلابية الجامعية". تمارا ألف فرانز-أوديندال معتمد من قبل "منحة اكتشاف الأموال".
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق بتري لثقافة الخلايا مقاس 35 مم | كورنينج | 353001 | طبق ثقافة الأنسجة سهل الإمساك ، البوليسترين ، |
| أطباق بتري لثقافة الخلايا غير الحرقية 100 مم | ، | الأنسجة 353003 | كورنينج ، البوليسترين ، |
| المناديل الورقية | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Ministries ، 280 لكل كرتون |
| شبكة سلكية | n / a | n / a | شبكة سلكية من الفولاذ المقاوم للصدأ (حجم الشبكة 0.7 مم) |
| ماصات زجاجية يمكن التخلص منها | VWR | 14673-010 | زجاج البورسليكات القابل للتصرف 5 3/4 " |
| المغذيات المتوسطة | Gibco | 12591-038 | تعديل فيتون جاكسون ، [+] L-glutamine مع الفينول الأحمر (BGJB) |
| البنسلين - الستربتومايسين | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 وحدة / مل مرشح مستقر بمحلول الستربتومايسين البنسلين |
| ورقة | Whatman | 1454 090 | ورق ترشيح شبه مسامي 90 مم |
| بيض دجاج مخبب | الكلية الزراعية بجامعة دالهوزي | ، لا | يمكن الحصول عليها من المزارع المحلية ، |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) | EMD | SX0420-3 | بلورات كلوريد الصوديوم ، كاشف زجاجة زجاجية من الدرجة |
| 1 لتر | VWR | 89000-240 | 1 لتر زجاجة زجاجية قابلة للتعقيم |
| بالإيثانول | Fisher Scientific | BP82011 | من درجة البيولوجيا الجزيئية |
| غير | من المتجر ويتم شراؤها وتعقيمها باستخدام | ||
| شفرات الحلاقة التي تستخدم لمرة واحدة | VWR | 55411-050 | شفرات حلاقة صناعية أحادية الحافة (فولاذ كربوني جراحي) |
| ملاعق بلاستيكية | غير | متوفرة من المتجر ويتم تعقيمها باستخدام | |
| قناع الغبار | 3M | n / a | 3M 8500 قناع الراحة |
| بارافورمالديهايد | سيجما ألدريتش | P6148 | بارافورمالدهيد ، درجة الكاشف ، |
| الفورمالين المحايد | فيشر سيانتيفك | 72210 | 10٪ محلول |
| محايد من فوسفات الفورمالين (PBS) | n / a | n / a | 10X الفوسفات المحلول الملحي المخزن درجة الحموضة 7.4 (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 مللي كلوريد الصوديوم ، 4.3 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 1.4 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub>) 15 |
| مل أنابيب الصقر | VWR | 21008-216 | الطرد المركزي المعقمة |
| ملقط FST | n / A | ||
| ملقط ناعم ملحية كتكوت ؛ | N / A | n / a | 0.85٪ كلوريد الصوديوم |
| ورق القصدير | N / A | N / منشفة | ورقية تم شراؤها من المتجر |
| N / A | N / A | تم شراؤها من المتجر |
المراجع
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
