مقالة منهجية

خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

DOI:

10.3791/57627

⸱

يونيو 20, 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة والاحتياطات المطلوبة لأداء متعدد النسخ العكسي خلية مفردة البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك. هذا الأسلوب أسلوب بسيط وفعال لتحليل الشخصية التعبير لمجموعة محددة سلفا من المورثات من خلية واحدة تتميز بتسجيلات المشبك التصحيح.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قشرة الدماغ يتكون من العديد من أنواع الخلايا نستعرض مختلف السمات المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية. ويعوق هذا التنوع من السهل تحديد وتوصيف هذه الأنواع الخلية، شرطان أساسيان لدراسة مهامهم المحددة. توضح هذه المقالة خلية مفردة متعدد النسخ العكسي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR) البروتوكول، الذي يسمح، بعد التصحيح-المشبك تسجيل شرائح، كشف في نفس الوقت التعبير عن عشرات الجينات في خلية واحدة. هذه طريقة بسيطة يمكن تنفيذها مع توصيف الخصائص المورفولوجية وقابلاً للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الصفات المظهرية لمختلف أنواع الخلايا وبيئتها الخلوية خاصة، مثل القرب من الأوعية الدموية. مبدأ هذا البروتوكول هو لتسجيل نسخ خلية مع تقنية المشبك التصحيح، الحصاد وعكس محتواه هيولى، والكشف عن نوعي متعدد التعبير عن مجموعة معرفة مسبقاً من الجينات ببكر. أنه يتطلب تصميم دقيق [بكر] كبسولة تفجير وحل المشبك التصحيح داخل الخلايا متوافق مع RT-PCR. للتأكد من نسخة انتقائية وموثوق بها يتطلب الكشف، هذا الأسلوب أيضا ضوابط ملائمة من حصاد السيتوبلازم إلى خطوات التضخيم. على الرغم من الاحتياطات التي نوقشت هنا يجب أن يتبع تماما، يمكن استخدام تقريبا أي المختبر الكهربية الخلية واحد متعدد تقنية RT-PCR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قشرة الدماغ وتضم العديد من أنواع الخلايا في مختلف العمليات الفسيولوجية. على تحديد وتوصيف، شرطا أساسيا لفهم وظائفها المحددة، يمكن أن تكون صعبة للغاية نظراً لتنوع المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية الكبيرة التي تتسم بها أنواع الخلايا القشرية1 ،2،،من34.

خلية واحدة متعدد RT-PCR يستند إلى المزيج من التصحيح-المشبك وتقنيات RT-PCR. ويمكن التحقيق في وقت واحد أكثر من 30 من الجينات المعرفة مسبقاً في الخلايا التي تم تحديدها اليكتروفيسيولوجيكالي5. إدراج الراسم العصبية في ماصة تسجيل زيادة يسمح توصيف الخصائص المورفولوجية للخلايا مسجل بعد الوحي histochemical6،،من78،9، 10. وأسلوب مفيدة جداً لتصنيف أنواع الخلايا العصبية على أساس تحليل متعدد المتغيرات لتلك الصفات المظهرية5،،من910،11،12 ،،من1314. خلية مفردة متعدد RT-PCR هو أيضا مناسبة لتوصيف الخلايا غير العصبية مثل أستروسيتيس15،،من1617، ويمكن تطبيقها عمليا على كل الدماغ بنية18، 19،20،21،22،23 وخلية نوع، على افتراض أنها يمكن أن تسجل في تكوين كل خلية.

هذا الأسلوب مريحة للغاية لتحديد مصادر الخلوية و/أو أهداف لانتقال أنظمة7،8،15،16،،من2021، 24،25،26،،من2728، لا سيما عندما لا توجد أجسام مضادة محددة. فإنه يعتمد على تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا المحددة بصريا29، ومما يسمح أيضا لاستهداف الخلايا في15،،من8بيئة خلوية خاصة16. وعلاوة على ذلك منذ سيتوارتشيتيكتوري أنسجة الدماغ محفوظاً في شرائح المخ، كما يتيح هذا النهج دراسة العلاقات التشريحية للخلايا تتميز بعناصر الخلايا العصبية وغير العصبية7،8 , 18.

نظراً لهذه التقنية محدودة بمبلغ المقطوع السيتوبلازم وكفاءة الرايت، الكشف عن مرناً المعرب عنها في عدد نسخ منخفضة يمكن أن يكون صعباً. على الرغم من أن النهج الأخرى القائمة على التكنولوجيا رناسيق تسمح لتحليل الترنسكربيتوم كله من خلايا مفردة3،4،،من3031، يحتاجون التعاقب مكلفة الفائق ليس بالضرورة متاح لكل مختبر. حيث يستخدم تقنية RT-PCR متعدد خلية مفردة بكر نقطة النهاية، فإنه يتطلب فقط ثيرموسيكليرس متاحة على نطاق واسع. يمكن أن توضع بسهولة في مختبرات مجهزة بالهياكل الكهربية ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. يمكن ذلك، خلال يوم واحد، توفير تحليل نوعي للتعبير عن مجموعة معرفة مسبقاً من الجينات. وهكذا، هذا النهج يوفر سهولة وصول إلى توصيف الجزيئية للخلايا المفردة بطريقة سريعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع إجراءات تجريبية باستخدام الحيوانات تم تنفيذها طبقاً للوائح الفرنسية (رمز الريف R214/87 إلى R214/130) وتتفق مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجماعة الاقتصادية الأوروبية (86/609/EEC) والميثاق الوطني الفرنسي على أخلاقيات التجارب الحيوانية. كافة البروتوكولات أقرته لجنة الأخلاقيات تشارلز داروين وقدم للوزارة الفرنسية للتعليم والبحوث (الموافقة عام 2015 061011367540). مرفق الحيوان إيببس معترف بها من قبل السلطات الفرنسية (A75-05-24).

1-اعتبارات أولية

ملاحظة: لتجنب التلوث، مطابقة للتوصيات التالية قبل إجراء وحيد الخلية RT-PCR بعد التصحيح-المشبك.

  1. لا تستخدم البلازميدات المحتوية على الجينات للفائدة في المختبر كما مصدر محتمل للتلوث.
  2. حجز مقعد معمل بعيداً عن غرفة التفريد جل لإعداد تقارير إتمام المشروعات.
  3. أهدى مجموعة من الممصات ونصائح تصفية مقاومة الهباء الجوي للتلاعب بالحمض النووي والجيش الملكي النيبالي بتركيزات أقل من 1 نانوغرام/ميليلتر. ابدأ استخدام هذه لتحليل منتجات PCR.
  4. دائماً استخدم منتجات خالية من الدناز ورناسي وارتداء القفازات.
  5. استخدام مواد كيميائية مخصصة لإعداد الحلول الداخلية التصحيح-المشبك. ابدأ استخدام ملعقة ولكن وزنها بدلاً من الورق وزن مساحيق.
  6. استخدام قطب الهيدروجيني مخصصة والأس الهيدروجيني الحلول القياسية، كما أنها يمكن أن تكون مصدرا للتلوث (مثلاً، رناسي).
  7. متجر زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية؛ 20 ميليلتر طويلة ودقيقة ومرنة نصائح؛ ميكروبيبيتي 20 ميليلتر؛ اكسبيلير الصنع (التصحيح-المشبك ماصة حامل يعلق على حقنه 10 مل)؛ 500 أنابيب PCR ميليلتر؛ 10 ميليلتر مقاومة الهباء الجوي لتصفية نصائح؛ ورقيقة علامات دائمة في مربع مخصص (الشكل 1).

2. تصميم التمهيدي

ملاحظة: متعدد RT-PCR يعتمد على خطوتين التضخيم. خلال PCR الأول، تتضخم جميع الجينات ذات الاهتمام المشترك بخلط معا جميع [بكر] كبسولة تفجير. للكشف عن موثوقية النصوص من الخلايا المفردة، من الضروري تصميم كفاءة وانتقائية [بكر] كبسولة تفجير. ويحسن استخدام كبسولة تفجير (الداخلية) المتداخلة للجولتين الثانية من بكر الخصوصية وكفاءة التضخيم.

  1. استرداد تسلسل مرناً المنسق جينات الفائدة في "نكبي مرجع تسلسل قاعدة بيانات"32 ، فضلا عن تلك الأسرة ذات الصلة (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. قم بإدخال الاسم في gene(s) والأنواع ذات الأهمية كاستعلام وانقر فوق تسلسل المسترجعة ذات الصلة.
    2. لتقييد التحليل إلى الترميز تسلسل gene(s)، انقر فوق إرسال إلى (الزاوية العلوية اليمنى)، وحدد الترميز تسلسل و النوكليوتيدات FASTA كتنسيق. ثم انقر فوق إنشاء ملف وحفظ تسلسل FASTA استخدام ملحق ملف ".nt".
  2. استخدام الببغاء البرمجيات33 (منضدة التحليل ومتعددة محاذاة البناء) أو أي برامج أخرى متعددة محاذاة لتحديد مناطق التماثل.
    1. انقر فوق الملف | مشروع جديد... وحدد الحمض النووي كنوع تسلسل. لاستيراد تسلسل الجين، حدد تسلسل | استيراد تسلسل... وتحميل ملف ".nt". كرر الإجراء لكافة تسلسل ذات الصلة.
    2. انقر واسحب كافة تسلسل في الإطار التخطيطي لتحديد تسلسل كامل.
    3. البحث في مناطق التماثل بتحديد محاذاة | البحث عن القطع... (CTRL + S). حدد زوج الجزء تتداخل في طريقة البحث. ضبط بيرويس نقاط قطع قيمة عالية نسبيا (مثلاً، 1,000) و الحد الأدنى seqs. كل كتلة على العدد الإجمالي لتسلسل إلى محاذاة، ثم انقر فوق بدء.
    4. في الإطار نتائج البحث يظهر، حدد عدد النتائج () مع النائب-درجة أعلى وانقر فوق الارتباط. إذا تم العثور على أي نتيجة، إنقاص بيرويس نقاط قطع و/أو seqs. كحد أدنى كل كتلة.
    5. لتسهيل تصور المناطق المتجانسة، حدد محاذاة | تظليل | يعني درجة.
    6. حدد أجزاء غير مرتبط تسلسل وكرر 2.2.3–2.2.4 خطوات لتحديد مناطق أخرى للتماثل مع درجة أقل النائب يحتمل أن تكون.
    7. للحصول على أجهزة الإشعال الأكثر تحديداً، تحديد المناطق ذات التماثل تسلسل أقل.
  3. إحضار في التسلسل لكافة المتغيرات لصق وكرر الخطوات 2.2.1–2.2.6. تحديد مناطقها المشتركة لكشف العام. النظر في أشرطة الكاسيت بديلة للوصلة مخصصة المتغيرات تحليلات20،34،35،36.
  4. قم بمحاذاة تسلسلات مرناً في جينوم الحيوان نموذج استخدام الانفجار37 الجينوم (الأساسية المحلية محاذاة أداة البحث) لتحديد هيكل إنترون-إكسون الجينات (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. حدد جينوم الفأر الانفجار بالنقر فوق الماوس وتحميل التسلسل FASTA المستردة في المقطع أدخل سلسلة الاستعلام . في اختيار البرنامج، حدد الأمثل تسلسل مشابهة جداً (ميجابلاست)، ثم انقر فوق الزر الانفجار .
    2. في المقطع الوصف ، حدد المحاذاة مع هوية أعلى (تصل إلى 100 في المائة). تأكد من أن يناظر الجينات للفائدة كما هو مبين في ميزات قسم التحالفات .
    3. نوع المحاذاة بدء الاستعلام الموقف في نفس القسم للحصول على خلافة exons تسلسل الترميز. ملاحظة مواقف البدء والانتهاء من جميع الزيارات التي تتطابق تقريبا لموقف introns في سلسلة الاستعلام (الشكل 2A).
  5. حدد اثنين exons مختلفة للإشعال الإحساس و antisense للتفريق بين سهولة كدنا الجينوم تضخيم الحمض النووي (جدنا) استناداً إلى معيار حجم (الشكل 2).
    ملاحظة: يمكن أن يحدث تضخيم جدنا بتردد منخفض عندما يتم حصادها النواة مع السيتوبلازم. وبالتالي، من الضروري تصميم إنترون أوفيرسبانينج أزواج التمهيدي (الشكل 2A). في حالة أقل إنترون الجينات، مشكلة جمع النواة فإنه يمكن أن يؤدي إلى التباس يحتمل أن تكون النتائج. لمعالجة هذه المسألة، تشمل مجموعة من الإشعال بهدف تضخيم تسلسل إينترونيك للتحقيق لوجود جدنا25. إذا كان عنصر التحكم الجينوم إيجابيا، يجب تجاهل النتائج لجميع الجينات إنترون-أقل.
  6. للتوصل إلى مضاعفة كفاءة، حدد الإشعال توليد أمبليكونس بطول تتألف من الناحية المثالية بين 200 و 400 زوج قاعدي (الشكل 2).
  7. لتضخيم كدناس مختلفة في وقت واحد خلال الخطوة PCR متعدد، تصميم كبسولة تفجير بطول بين 18 و 24 النيوكليوتيدات ودرجة حرارة ذوبان (Tm) بين 55 و 60 درجة مئوية.
  8. للتقليل من تشكيل الهياكل الثانوية، التي تقلل من العائد التضخيم، حدد الإحساس والشعور المضادة الإشعال دبوس الحد الأدنى وأطوال المزدوجة (الشكل 2).
  9. تصميم كبسولة تفجير الداخلية باستخدام نفس المعايير (خطوات 2.5-2.8).
  10. التحقق من الطابع الخاص للإشعال PCR بمحاذاة الإشعال على "قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي مرجع" الكائن الحي من فائدة استخدام النوكليوتيدات انفجار.
    1. في الانفجار (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)، انقر فوق النوكليوتيدات الانفجار. قم بلصق تسلسل التمهيدي إدخال سلسلة الاستعلام.
    2. في المقطع اختيار مجموعة البحث ، انقر على الآخرين (nr إلخ)وتحديد تسلسل "الحمض النووي الريبي المرجع" (refseq_rna) في خيار قاعدة البيانات وحدد الكائن الحي (مثلاً، موس موسكولوس (taxid:10090) ) قصر التحليل على الأنواع المطلوبة.
    3. في اختيار البرنامج تحديد أمثلية تسلسل مشابهة إلى حد ما (بلاستن). في المقطع معلمات خوارزمية تقليص حجم كلمة وصولاً إلى 7 زيادة فرصة الحصول على عدد الزيارات.
  11. تصميم كبسولة تفجير انتقائية، تبقى فقط أولئك الذين تسلسل له على الأقل 3 حالات عدم التطابق مع كدناس غير مرغوب فيه عندما يكون ذلك ممكناً.
  12. ترتيب الإشعال ديسالتيد في تركيزات عالية نسبيا (مثلاً، 200 ميكرومتر) التأكد من أن جميع أجهزة الإشعال خارجي يمكن أن تكون مختلطة معا في تركيز نهائي من 1 ميكرومتر.

3-إعداد الكواشف RT

  1. 5 x ميكس RT: إعداد في المياه خالية من رناسي 400 ميليلتر من العامل RT مزيج محلول (5 س) يحتوي على كبسولة تفجير عشوائي في 25 ميكرومتر ودنتبس في كل 2.5 ملم. تخزين هذا المزيج العامل ك 20 ميليلتر مختبرين في 500 ميليلتر الأنابيب.
  2. 20 x ديثيوثريتول (DTT): إعداد 1 مل من 0.2 م DTT في رناسي مجانية المياه وتخزينها ك 50 ميليلتر مختبرين.
  3. تخزين 2500 يو من رناسي المانع (40 ش/ميليلتر) و 10,000 يو من المنتسخة العكسية (رتاسي، 200 يو/ميليلتر) ك 5 ميليلتر مختبرين.
  4. ضمان جودة مثلى من الكواشف RT، تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية. استخدامها لمدة تصل إلى 10 خلايا وفقط لمدة يوم واحد.

4-بكر التحقق من الصحة

  1. إعداد كدناس بالقيام نسخ عكسي على كمية كبيرة نسبيا من مجموع استخراج الحمض النووي الريبي (عادة 1 ميكروغرام)38 من الهيكل للفائدة.
    1. لا تستخدم الماصات مكرسة لواحد خلية RT-PCR للخطوات الأولية ولكن استخدام الماصات رناسي خالية. تمييع مجموع الجيش الملكي النيبالي وصولاً إلى 1 ميكروغرام/ميليلتر.
    2. في أنبوب PCR 500 ميليلتر، إضافة 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي إجمالي المخفف و 8 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. تؤذي في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتبرد الأنبوبة على الجليد.
    3. إضافة 4 ميليلتر من المخزن المؤقت 5 x RT تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة وميليلتر 4 RT ميكس الحل، 1 ميليلتر من رتاسي، 1 ميليلتر من مثبط رناسي و 1 ميليلتر من 200 ملم DTT (انظر القسم 3).
    4. نفض الغبار على أنبوب وأنها تدور، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. تخزين كدناس في-80 درجة مئوية لتصل إلى عدة سنوات. إعداد قاسمة كدناس المخفف إلى 1 نانوغرام/ميليلتر من مجموع الكشف المكافئة.
  2. خلط وتمييع كل زوج التمهيدي في 1 ميكرومتر مع الممصات مكرسة لخلية مفردة RT-PCR. استخدام 20 ميليلتر من كل التمهيدي مزيج 100 ميليلتر من تقارير إتمام المشروعات.
  3. على الجليد، والتحضير لكل زوج التمهيدي مواده التي تتضمن: المياه (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من 10 X المخزن المؤقت، 1 ميليلتر 100 x dNTPs (50 ميكرومتر في كل)، 500 – 1000 pg كدنا المخفف في 1 نانوغرام/ميليلتر، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو، يو 5/ميليلتر) من [تق] [بولمرس].
  4. استخدام أنابيب PCR التي تناسب محكم آبار الجهاز PCR لعنصر تحكم درجة حرارة مثلى. إضافة 2 قطرات (~ 100 ميليلتر) من الزيوت المعدنية إلى مواده دون لمس الجدار أو الحد الأقصى من الأنبوب PCR.
  5. للتقليل من التشكيل مبلمر، نفذ بداية ساخنة بوضع أنابيب PCR في ثيرموسيكلير قبل تسخينه عند 95 درجة مئوية. بعد 30 ثانية، بسرعة طرد 20 ميليلتر من ميكس التمهيدي على أعلى من النفط.
  6. بعد 3 دقائق عند 95 درجة مئوية، تشغيل دورات 40 (95 درجة مئوية، 30 s; 60 درجة مئوية، 30 s; 72 درجة مئوية، 35 s) تليها خطوة نهائية استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. تحليل 10 ميليلتر لكل منتجات PCR قبل [اغروس] هلام التفريد (2%، ووزن/حجم)39. إذا لم يكن لديك بعض منتجات PCR الحجم المتوقع، إعادة تصميم كبسولة تفجير أخرى (انظر القسم 2).
    تنبيه: اثيديوم بروميد هو مادة كيميائية إينتيركالاتينج التي يمكن أن تسبب طفرات الحمض النووي. استشارة مكتب السلامة المحلية قبل استخدامه. دائماً ارتداء قفازات عند التعامل مع ذلك. استخدام حل متاح تجارياً اثيديوم بروميد (10 مغ/مل) الحل بدلاً من مسحوق للتقليل من خطر استنشاق. وبالمثل، يمكن أن تكون ضارة الأشعة فوق البنفسجية، لذا تأكد من ارتداء نظارات السلامة حماية الأشعة فوق البنفسجية أو قناع. سحب المواد الهلامية المتسخة ونصائح وقفازات والمخزن المؤقت في الحاويات المخصصة للنفايات اثيديوم.
  8. بمجرد قد تم التحقق من جميع التمهيدي أزواج منفردة، اختبار بروتوكول متعدد (الشكل 3).
    1. خلط وتمييع جميع أجهزة الإشعال الخارجي معا في 1 ميكرومتر. متجر الإشعال متعدد مزيج في-20 درجة مئوية لتصل إلى عدة أسابيع.
    2. على الجليد، وتعد القيمة التي تحتوي على: الماء (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 100 x dNTPs (50 ميكرون لكل منهما)، pg 500 – 1,000 من كدناس المخفف في 1 نانوغرام/ميليلتر، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو، يو 5/ميليلتر) من [تق] [بولمرس].
    3. نفض الغبار على أنبوب بكر وأنها تدور، وإضافة نقطتين (~ 100 ميليلتر) من الزيوت المعدنية.
    4. القيام ببداية ساخنة كما هو موضح في الخطوة 4، 5 مع 20 ميليلتر من ميكس التمهيدي متعدد. وبعد 3 دقائق عند 95 درجة مئوية، تشغيل 20 PCR دورات مماثلة لتلك الخطوة 4.6.
    5. إعداد عدد من أنابيب PCR متطابقة لعدد الجينات لتحليل. إعداد مواده كما هو الحال في الخطوة 4.8.2، ولكن باستخدام 1 ميليلتر من أول منتج PCR كل الجينات كقالب. ضبط كافة وحدات التخزين وفقا لعدد الجينات تحليلها والنظر في استخدام 10% حجم إضافي للتعويض عن أخطاء بيبيتينج.
    6. تهز بلطف وتدور الأنبوب وإرسال 80 ميليلتر من مواده في كل أنبوبة بكر وإضافة نقطتين (~ 100 ميليلتر) من الزيوت المعدنية كل أنبوبة دون لمس الجدار أو الحد الأقصى من الأنابيب.
    7. أداء ساخنة ابدأ (راجع الخطوة رقم 4، 5) بطرد ميليلتر 20 من ميكس التمهيدي الداخلية إعدادها في الخطوة 4، 2. تشغيل 35 بكر دورات مماثلة للخطوة 4.6.
    8. تحليل منتجات PCR الثانية بالتفريد [اغروس] هلام. تأكد من أن كل بكر الثاني يولد amplicon من الحجم المتوقع. في حالة غير فعالة أو غير محدد إيضاحات مسهبة، إعادة تصميم كبسولة تفجير جديد (الخطوات 2.5 – 2.12) والتحقق من صحة عليها (الخطوات 4.2 – 4.8).

5-إعداد والتحقق من صحة الحل المشبك التصحيح داخل الخلايا

ملاحظة: بروتوكول التالية توضح الإعداد والتحقق/gluconate ك+أساس حل داخلي، ولكن يمكن استخدام تقريبا أي نوع من التصحيح-المشبك الحل طالما أنه لا يعوق كفاءة RT-PCR. ارتداء قفازات إلزامي للحصول على حل داخلي رناسي مجاناً.

  1. 60 مل من محلول تسجيل التصحيح-المشبك الداخلية، تعد اكستيمبورانيوسلي 10 مل من 0.1 م كوه.
  2. حل مغ 11.4 لعطا (النهائي 0.5 مم) في مل 0.9 م 0.1 كوه.
  3. إضافة 40 مل رناسي خالية من الماء وتذوب 2.02 ز من كغلوكونات (144 مم النهائي)، 143 مغ حبيس (النهائي 10 ملم)، وميليلتر 180 1 م MgCl2 (النهائي 3 مم).
  4. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2 بإضافة ~ 6 مل من 0.1 م كوه.
  5. ضبط الاسموليه لموسم 295 مع ~ 13 مل مياه خالية من رناسي.
  6. منذ حل داخلي يستخدم أيضا كمخزن مؤقت للنسخ العكسي، بعناية مراقبة تركيز Mg2 + . تعويض بملغ2 + تركيز أقل في حل داخلي بإضافة مجكل2 بعد ذلك للوصول إلى تركيز نهائي من 2 مم في رد فعل RT.
  7. لتسمية الخلية المقطوع بعد تسجيل التصحيح المشبك، إضافة 2 – 5 ملغ/مل بيوسيتين خالية من رناسي إلى الحل الداخلية المذكورة أعلاه (خطوات 5.1 – 5.5).
  8. تصفية (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) حل داخلي وتخزينها في-80 درجة مئوية، 100 – 250 ميليلتر مختبرين.
  9. للتحقق من صحة استخدام حل داخلي لخلية واحدة RT-PCR، إضافة 0.5 ميليلتر من مجموع الكشف المخفف في 1 نانوغرام/ميليلتر إلى ميليلتر 6 حل المشبك التصحيح وتركه على مقاعد البدلاء لمدة حوالي 30 دقيقة.
  10. مع ميكروبيبيتي 2 ميليلتر، إضافة 2 ميليلتر من 5 x RT-ميكس، 0.5 ميليلتر 20 x مادة الدي دي تي، 0.5 ميليلتر رناسي المانع، و 0.5 ميليلتر رتاسي، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  11. تدور الأنبوب. على الجليد إضافة المياه (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو، يو 5/ميليلتر) من [تق] [بولمرس].
  12. إجراء دورات 40 من PCR باستخدام مجموعة من الإشعال المصادق عليها (الخطوات 4، 4، 4-6).
  13. تحليل منتجات PCR بالتفريد [اغروس] هلام (راجع الخطوة 4، 7)، والتحقق من أن لديهم الحجم المتوقع.
    ملاحظة: حذف 0.5 ميليلتر من مجموع الجيش الملكي النيبالي واستبدالها بالمياه خالية من رناسي 0.5 ميليلتر سيضمن أن الحل الداخلي خال من التلوث الحمض النووي الريبي و/أو الحمض النووي.

6-إعداد شريحة الحاد

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إجراء تشريح للأحداث (أيأقل من 28 يوما بعد الولادة) الفئران الذكور والإناث. حلول شاملة لقطاعات أخرى، مثل السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القائم على السكروز (قام) هي أيضا قابلة للاستخدام40.

  1. إعداد 2 لتر قام المحتوية على كلوريد الصوديوم 125، 2.5 (في مم) بوكل، 2 كاكل2، 1 MgCl2، 1.25 نة2بو4، 26 ناكو3، الجلوكوز 10 و 15 السكروز. للحد من نشاط جلوتاماتيرجيك أثناء إعداد شريحة، تعد حلاً قطع بإضافة 1 ملم حمض كينورينيك.
  2. قبل التقطيع، إعداد مجموعة مواد تشريح التي تحتوي على المقص الجراحي، مقص آيريس غرامة، ملاعق اثنين، الملقط، وقرص لتصفية الورق والغراء cyanoacrylate.
  3. استخدم الحل قطع الجليد مشبعة/CO س22 (95/5 ٪) وتهدئة قطع الدائرة في-20 درجة مئوية.
  4. تخدير الماوس مع منشفة ورقية صغيرة غارقة مع إيسوفلوراني. وبعد دقيقة ~ 2، تأكد من أن الماوس تحت التخدير العميق بالتحقق من عدم وجود استجابة مخلب قرصه.
  5. بسرعة قطع رأس الماوس. إزالة فروة الرأس وفتح الجمجمة. استخراج الدماغ بعناية ووضعها في كوب صغيرة مملوءة بالجليد الباردة (~ 4 درجة مئوية) الحل قطع اﻷوكسيجين مع/CO2س2.
  6. قم بإزالة قطع الدائرة من الشروط-20 درجة مئوية والرطوبة مع منشفة ورقية.
  7. تشريح الدماغ لعزل منطقة اهتمام والصقه في قاعة قطع وإضافة حل قطع الجليد اﻷوكسيجين مع س2/CO2بعناية.
  8. قطع 300 ميكرون شرائح سميكة استخدام فيبرتوم. نقلها في درجة حرارة الغرفة في غرفة استراحة مليئة بحل قطع اﻷوكسيجين والسماح لهم باستعادة لمالا يقل عن 0.5 ح.

7-وحيد الخلية RT-PCR بعد تسجيل التصحيح-المشبك

  1. تنظيف نظام التروية بانتظام مع ~ 100 مل من 30 ٪ ح2س2 الحل وشطف على نطاق واسع مع ~ 500 مل ماء المقطر لتجنب نمو البكتيريا، كما أنها مصدر التلوث رناسي التغاضي.
  2. تشلوريناتي خيوط مع ماصة تصحيح مليئة بالتبييض تتركز كل يوم الحصاد. لا تستخدم ميكروبيبيتي لملء الماصة التصحيح ولكن بدلاً من ذلك 20 ميليلتر طويلة، غرامة، ومرونة تلميح تعلق بحقنه 1 مل. ثم شطفة على نطاق واسع مع رناسي المياه مجاناً والجافة بخرقه غاز.
  3. إعداد مربع صغير من الثلج الذي يحتوي على 5 x ميكس RT و 20 x DTT مختبرين. تخزين مختبرين مثبط رتاسي ورناسي في-20 درجة مئوية في benchtop برودة.
  4. نقل شريحة في قاعة تسجيل perfused في 1-2 مل/دقيقة مع قام اﻷوكسيجين.
  5. سحب الماصات التصحيح (1 – 2 ميكرومتر فتح نصيحة القطر، MΩ 3-5) من زجاج البورسليكات أثناء ارتداء القفازات وملء أحد منهم مع 8 ميكروليتر من حل داخلي. ضع في اعتبارك أن المقابض ساحبة الماصة مصدر تلوث رناسي.
  6. مكان الماصة في حامل ماصة حين ارتداء القفازات الجديدة وعدم لمس الشعيرة بالاصابع.
  7. نهج ماصة التصحيح مع ضغط إيجابي، والقيام بتسجيل كامل الخلية لتحديد خصائص الخلية المستهدفة (الشكل 4).
  8. وحفاظا مرناس، الحد من الوقت في تكوين كل خلية إلى 20 دقيقة41.
  9. في نهاية التسجيل، إعداد أنبوب PCR 500 ميليلتر مليئة 2 ميليلتر 5 x ميكس RT و 0.5 ميليلتر من 20 x DTT، أنها تدور، وتخزينها على الجليد.
  10. حصاد السيتوبلازم الخلية عن طريق تطبيق ضغط سلبي لطيف (الشكل 4). تحكم بمحتوى الخلية يأتي من داخل ماصة مع المحافظة على ختم ضيق بصريا.
    1. تجنب بقدر الإمكان جمع النواة إذا اعتبر بعض الجينات أقل إنترون. وفي هذه حالة دائماً تتضمن مجموعة من الإشعال بهدف تضخيم جدنا للتحقيق للتلوث بالجينوم.
    2. إذا النواة قادمة قريبة من طرف الماصة، الإفراج عن الضغط السلبي ونقل ماصة بعيداً عن النواة. ضمان أن يتم الاحتفاظ بختم ضيق وإعادة جمع السيتوبلازم في الموقع الجديد ماصة.
  11. إيقاف حصاد عندما يقترب من أية مادة أخرى و/أو قبل أن يفقد ختم ضيق.
  12. سحب ماصة برفق لتشكيل على تصحيح من الخارج للحد من التلوث بالانقاض خارج الخلية (الشكل 4) ويؤيدون إغلاق غشاء الخلية لتحليل histochemical اللاحقة.
  13. نضع في اعتبارنا أن المقابض، ميكرومانيبولاتورس، ولوحة المفاتيح بالكمبيوتر، أو ماوس الكمبيوتر هي المصادر المحتملة للتلوث رناسي. إذا كانوا قد لمست أثناء التسجيل، قم بتغيير القفازات.
  14. إرفاقه الماصة اكسبيلير، وطرد محتواه في أنبوب PCR بتطبيق ضغط إيجابي (الشكل 1).
  15. اقتحام غيض ماصة أنبوب PCR للمساعدة في جمع محتواه.
  16. الطرد المركزي في الأنبوب بإيجاز، وإضافة 0.5 ميليلتر من مثبط رناسي و 0.5 ميليلتر من رتاسي، المزيج بلطف، الطرد المركزي مرة أخرى، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  17. تدور الأنبوب وتخزينها في-80 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر حتى تحليل PCR.
  18. نفذ الخطوة التضخيم الأولى مباشرة في أنبوب يحتوي على ميليلتر ~ 10 RT المنتجات عن طريق إضافة المياه (q.s.، ميليلتر 80)، 10 ميليلتر من المخزن المؤقت x 10، و 0.5 ميليلتر (2.5 يو) من [تق] [بولمرس]. ثم اتبع الإرشادات المذكورة في الخطوات 4.8.2–4.8.8.

8-histochemical تلوين الخلية مسجل (اختياري)

  1. وعقب التسجيلات الكهربية، الحفاظ على شريحة لمدة 20 دقيقة في قام اﻷوكسيجين للسماح بنشر بيوسيتين في شجرة محواري والجذعيه.
  2. ضع الشريحة في بئر لوحة 24-جيدا ويكس أنه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% 0.1 متر العازلة الفوسفات.
  3. تغسل الشرائح 4 مرات، مدة كل منهما 5 دقائق مع 1 مل الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS).
  4. في نفس بيرميبيليزي جيدا، وتشبع الشريحة أثناء ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.25% تريتون الجيلاتين X-100 و 0.2 في المائة من أسماك المياه الباردة الجلد (برنامج تلفزيوني-GT).
  5. تبني بين عشية وضحاها مع عبدين مسمى فلوريسسينتلي المخفف في 1/400 في 250 – 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-gt.
  6. أغسل مرات 5، 5 دقائق، مع كل 1 مل من برنامج تلفزيوني وجبل الشرائح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 3عملية تحقق من صحة ممثل متعدد RT-PCR. تم تصميم البروتوكول للتحقيق في نفس الوقت التعبير عن 12 جينات مختلفة. VGluT1 الناقل غلوتامات حويصلية اتخذ كعنصر إيجابي ل الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك42. واستخدمت كعلامات جابايرجيك إينتيرنيورونس3،،من511غابا توليف الإنزيمات (GAD65 وجاد 67) Neuropeptide Y (نبي) وسوماتوستاتين (سوم). إنزيم السيكلو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحيد الخلية متعدد RT-PCR بعد التصحيح-المشبك يمكن موثوق بها وفي الوقت نفسه التحقيق أكثر من 30 من الجينات في الخلايا التي تم تحديدها اليكتروفيسيولوجيكالي5. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتطلب كفاءة عالية [بكر] كبسولة تفجير. واحدة من الخطوات التي تحد آخر جمع لمحتوى الخلية. فعاليتها تعتمد على قطر طرف ماصة التصحيح، التي يجب أن تكون كبيرة بقدر الإمكان مع مطابقة حجم الخلية. ثبت الممصات التي يبلغ قطرها 1-2 ميكرومتر تلميح مفتوحة تكون ملائمة لأنواع الخلايا العصبية أكثر. من الضروري أيضا التأك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر الدكتور ألكسندر مروة على تعليقاته على المخطوطة. بتأييد هذا العمل من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحث (ANR الملز 2011 003 01؛ ANR-15-CE16-0010 والوكالة الوطنية للمعلومات-17-CE37-0010-03)، رقم معتمد من قبل الزمالة من صب مؤسسة بحوث sur la الزهايمر. ونحن نشكر مرفق الحيوان من إيببس (باريس، فرنسا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MACAW v.2.0.5NCBIمحاذاة متعددة لتصميم التمهيدي
DithiothreitolVWR443852ART
بادئات عشوائيةسيجما ألدريتش (ميرك)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT و PCR
RNasin RibonucleasePromegaN2511RT
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014RT
Taq DNA PolymeraseQiagen201205PCR
الزيوت المعدنيةSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
PCR بادئاتSigma-Aldrich (Merck)PCR / محلية ومخففة عند 200 & ميكرو;
أنابيب M ، 0.5 مل ، غطاء مسطحThermoFisher ScientificAB0350RT و PCR
BT10 Series - 10 & micro ؛ L طرف مرشحسلسلة Neptune ScientificBT10RT و PCR
BT20 - 20 & L طرف مرشحسلسلة نبتون ScientificBT20RT و PCR
BT200 - 200 & L طرف مرشحNeptune ScientificBT200RT و PCR
BT1000 Series - 1000 & micro ؛ L طرف مرشحنبتون ScientificBT1000.96RT و PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer CetusPCR
Ethidium BromideSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLالرحلان الكهربائي لجل الاغاروز
Tris-Borate-EDTA عازلةSigma-Aldrich (Merck)T4415-1Lالرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز
UltraPureAgarose Life Technologies16500-500الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز
&Phi ؛ X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026Sالرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز
EDA 290الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز
الكهربائي مزود الطاقة EPS 3500Pharmacia BiotechAgarose هلام الرحلان الكهربائي
ميدي وحدة الرحلان الكهربائي الأفقي نموذج SHU13سيجما ألدريتش (ميرك)الرحلان
الكهربائي لهلام الاغاروزورق أملس بمظهر ساتانFisherbrand1748Bمحلول داخلي لمشبك
التصحيح هيدروكسيد البوتاسيومسيجما-ألدريتش (ميرك)60377محلول داخلي لمشبك التصحيح
الإيثيلين جلايكول بيس (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N & Prime ؛ N & - حمض رباعي الأسيتيكسيجما-ألدريتش (ميرك)E3889التصحيح المشبك الحل الداخلي
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034التصحيح المشبك الحل الداخلي
البوتاسيوم D-gluconateSigma-Aldrich (Merck)G4500التصحيح المشبك الحل الداخلي
محلول كلوريد المغنيسيومSigma-Aldrich (Merck)M1028التصحيح المشبك الحل الداخلي
5500 مقياس التناضح بضغطالبخار WescorPatch المشبك الحل الداخلي
BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261محلول داخلي لمشبك
التصحيح السكروزسيجما ألدريتش (ميرك)S5016تحضير الشريحة
D- (+) - الجلوكوز أحادي الهيدراتسيجما ألدريتش (ميرك)49159تحضير الشريحة
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش (ميرك)S6191تحضير الشريحة
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتش (ميرك)60128تحضير الشريحة
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتش (ميرك)31437-Mتحضير شريحة
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتش (ميرك)S5011تحضير الشريحة
محلول كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش (ميرك)63069تحضير الشريحة
محلول كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش (ميرك)21115تحضير
حمض الكينورينيكسيجما ألدريتش (ميرك)K3375تحضير الشريحة
IsofluranePiramal Healthcare UKتحضير الشريحة
VT 1000SLeica Biosystems14047235613تحضير الشريحة
محلول بيروكسيد الهيدروجينSigma-Aldrich (Merck)H1009إعداد المشبك التصحيح تنظيف
الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدار مع خيوطأدوات الدقة العالميةTW150F-4التصحيح المشبك
PP-83Narishigeالتصحيح المشبك
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003Patch Clamp
BX51WI مجهر مستقيمأوليمبوسالتصحيح المشبك
XC-ST70 / CE CCD B / W كاميرا فيديوسونيالتصحيح المشبك
Axopatch 200B مكبر للصوتالأجهزة الجزيئيةالتصحيح المشبك
Sigma-Aldrich (Merck)S7907الوحي الكيميائي
النسيجي فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigma-Aldrich (Merck)S8282الوحي الكيميائي النسيجي
ParaformaldehydeSigma-Aldrich (Merck)P6148الوحي الكيميائي النسيجي
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100الوحي الكيميائي النسيجي
الجيلاتين من جلدأسماك الماء الباردSigma-Aldrich (Merck)G7041الوحي الكيميائي
النسيجي Streptavidin ، Alexa Fluor 488 مترافقThermoFisher ScientificS11223الوحي الكيميائي النسيجي
24 بئرGreiner Bio-One662160الوحي الكيميائي النسيجي
مثبطات كوداك الرحلان الشريحةDigidata 1440 الأجهزة الجزيئية التصحيح المشبك pCLAMP 10 مجموعة البرمجيات الأجهزة الجزيئية التصحيح المشبك 10 مل حقنة Terumo SS-10ES طرد سلسلة E مع جسم مستقيم (حامل)Phymep 64-0997 طرد فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13(2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة