تقنيات ميكرومانيبوليشن يسمح تحليل الديناميات Morphogenetic ودوران للمنظمين سيتوسكيليتال

Summary

ونحن تصف كيفية تمكين التقنيات المتناهية الصغر و photomanipulation مثل فراب وفوتواكتيفيشن تحديد بارامترات حركية وديناميات الزمانية المكانية للبروتينات داخل ترحيل الخلايا. قراءات تجريبية تشمل ديناميات سوبسيلولار ودوران المنظمين حركية أو cytoskeleton أكتين الكامنة.

Abstract

يمكن أن تكشف دراسة ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات أهميتها الوظيفية في سياقات مختلفة. في هذه المقالة، أنها ناقشت الانتعاش الفلورسنت كيف بعد فوتوبليتشينج (فراب)، وتقنيات فوتواكتيفيشن يمكن استخدامها لدراسة ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات في مواقع سوبسيلولار. نعرض أيضا كيفية تمكين هذه التقنيات مباشرة تحديد معلمات مختلفة مرتبطة بحركية التنظيم وخلية cytoskeletal أكتين. وعلاوة على ذلك، microinjection الخلايا هو بالإضافة إلى ذلك وصف كعلاج بديل (يحتمل أن تكون السابقة أو مكملة لتقنيات photomanipulation السالفة الذكر) الآثار الزناد لحظية لذوبانها البروتينات في الخلية مورفولوجيا والدالة. ميكرومانيبوليشن مثل حقن بروتين أو التطبيق المحلي للمخدرات نفاذية غشاء البلازما أو مثبطات سيتوسكيليتال يمكن أن تخدم كأداة قوية لتسجيل النتائج الفورية لعلاج معين على سلوك الخلايا في خلية واحدة وسوبسيلولار المستوى. وهذا يتمثل هنا الفوري التعريفي لبروز حافة الخلية لاميليبوديال بحقن المؤتلف Rac1 البروتين، كما أنشئت منذ ربع قرن. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم على بروتوكول لتحديد معدل دوران للبروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-بسب، بوليميراز خيوط أكتين تراكم مكاناً بارزا في نصائح لاميليبوديال الخلايا B16-F1، وتوظيف فراب ومنها المرتبطة البيانات تحليل وتركيب المنحنى. ونقدم أيضا مبادئ توجيهية لتقدير معدلات لاميليبوديال أكتين شبكة البلمرة، المتمثلة في الخلايا معربا عن معلم اجفب β-أكتين. وأخيراً، هناك تعليمات لكيفية التحقيق في معدلات أكتين مونومر التنقل داخل السيتوبلازم الخلية، متبوعاً بإدماج أكتين في مواقع الجمعية خيوط السريع، مثل النصائح من جاحظ لاميليبوديا، باستخدام فوتواكتيفيشن النهج. أي من هذه البروتوكولات مقيد إلى مكونات أو المنظمين من cytoskeleton أكتين، ولكن يمكن أن تمتد بسهولة إلى استكشاف في أزياء مماثلة ديناميات الزمانية المكانية ووظيفة البروتينات في مختلف هياكل سوبسيلولار مختلفة أو الوظيفية سياقات.

Introduction

رصد ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات والجزيئات الأخرى في الخلايا الحية قد أصبحت أداة أساسية في مجالات عديدة من الخلية والبيولوجيا الجزيئية. تقنيات الفحص المجهري بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق) وعمر الحنق-الأسفار التصوير (الحنق-فليم) متقدمة الأسفار، أو السماح فراب وفقدان fluorescence في فوتوبليتشينج (الوجه) وفوتواكتيفيشن، فضلا عن العديد من الآخرين الزماني والمكاني تتبع لتفاعلات البروتين البروتين، التغييرات كونفورماشونال، فضلا عن تحديد الحركية نشر وتعريب مختلف البروتينات في الخلية^1،2. تقنيات فراب وفوتواكتيفيشن، على وجه الخصوص، قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة المنظمين للهجرة سيتوسكيليتون وخلية أكتين. هذه التقنيات يمكن تطبيقها منفردة أو مجتمعة مع تقنيات ميكرومانيبوليشن إضافية مثل microinjection³، وتنطوي على التعبير عن البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. أنها تسمح تقدير حركية رابطة البروتين الغنية أكتين الهياكل المعنية بالهجرة الخلية، مثل فيلوبوديا أو لاميليبوديا، دوران البروتينات في الالتصاقات البؤري⁴، أو تشعبت أكتين الشبكات⁵. وهي تمكن أيضا تحديد معدلات بلمرة الأكتين لاميليبوديال، تقييم تشتت أكتين أحادي داخل سيتوسول، معدل أكتين سوبسيلولار مونومر إزفاء إلى مبلمرة خيوط الأكتين في جاحظ لاميليبوديا⁶، وغيرها من المعالم.

فراب طريقة لتصور والتحديد الكمي لتنقل البروتينات داخل خلية حية، وضعت أصلاً في السبعينات اكسلرود⁷. منطقة الاهتمام (ROI) داخل خلية، يسكنها مع البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، يتعرض عابر لليزر عالية الكثافة، كافية لتسبب تبيض من جزيئات فلوروفوري الموجودين في هذه المنطقة خلال فترة زمنية قصيرة معينة. غير مقصور، المسمى فلوريسسينتلي البروتينات الموجودة خارج العائد على الاستثمار خلال التبييض، سوف منتشر واختراق منطقة المبيضة اعتماداً على ديناميتها الزمانية المكانية، مما تسبب في تشريد الجزيئات فوتوبليتشيد على مر الزمن. معدل الاسترداد fluorescence في المناطق المبيضة تعتمد على عوامل مختلفة، بما في ذلك الحجم ومعدل انتشار جزيء معين، وطبعا المرتبطة معدل الدوران داخل المفترضة هيكل المبيض. وهكذا، سوف التوسط من أجل انتعاش الأسفار داخل دوروا المبيضة سريعاً من خلال نشرها، بينما البروتينات محكم المرتبطة بالهياكل مثل الالتصاقات التنسيق البروتينات القابلة للذوبان، سوف يكون وقت أطول للدوران، كما سيتم استردادها الأسفار تعتمد على نشر جزء صغير قابل للذوبان من حركية البروتين وتفكك رابطة الكسر المرتبطة بهيكل. عادة ما يكتسب الانتعاش الأسفار وكمياً حتى يتم التوصل إلى المستوى الأولى لكثافة ما قبل التبييض للأسفار. ومع ذلك، لا يحدث هذا إذا كان جزء من شدة الأسفار الأولى ينتمي إلى ما يسمى الكسر غير متحركة، وغير قادر على أن تتجدد بنشرها أو يتم تغذيته بمعدلات بطيئة جداً بالمقارنة مع معظم الجزيئات تتألف من الهاتف النقال كسر. لتحديد معدل دوران البروتين، يتم إنشاؤها المنحنيات فراب، تمثل مدى الانتعاش الأسفار على مر الزمن. من هذه المنحنيات الانتعاش، يمكن حساب نصف متوسط من البروتين الانتعاش. عن طريق إنشاء منحنى يناسب متوسط فراب البيانات والتحليلات الرياضية ومن ثم، من الممكن أيضا للاستدلال على ما إذا كان معدل دوران متوسط الكسر المحمول يشكل مركب سكان متجانسة واحدة من الجزيئات، أو ما إذا كان وهو يتألف من الفئات السكانية الفرعية اثنين أو أكثر من الجزيئات تقليب أسعار تفاضلية. بالإضافة إلى تقدير معدلات دوران البروتين بالنهج الكمي، تتبع انتعاش المناطق فوتوبليتشيد في لاميليبوديا يمكن أن تسمح أيضا لدقة التحديد الكمي لمعلمات حركية لاميليبوديال مثل تدفق إلى الوراء، وبروز، ومعدلات بلمرة الأكتين. وهكذا، يشكل فراب أداة متعددة الاستخدامات التي ينبغي تطبيقها لتقييم المعلمات المختلفة داخل هياكل الخلايا الحية.

فوتواكتيفيشن أسلوب يستخدم لتعقب نشر والتنقل من البروتينات أو جزيئات مصدرها موقع خلوي معين. التقنية تستخدم، على سبيل المثال، متغير بروتين البرية من نوع فلورسنت الأخضر (التجارة والنقل)، وضعت في البداية باترسون ويبينكوت شوارتز⁸، والذي هو تحور بطريقة تسمح الأسفار الغاية تزداد عند التعرض الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) (حوالي 400 نانومتر؛ وهنا، 405 nm). كما وصفها باترسون et al.، صباغات التجارة والنقل البرية من نوع الوجود كعدد سكان مختلطة الفينولات محايدة وانيوني فينولاتيس، التي تنتج ذروة امتصاص رئيسية في حوالي 397 نانومتر وواحدة ثانوية في 475 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. عند تشعيع البروتين مع الأشعة فوق البنفسجية، يخضع السكان فوتوكونفيرسيون، التحول نحو النموذج أنيونى. عندما ولع 488 نانومتر، يسلك البروتين فوتوكونفيرتيد/فوتواكتيفاتيد بزيادة 3-fold في الأسفار، غير كافية في ممارسة للتمييز بين المنشط وغير-تنشيط التجارة والنقل بسبب الأسفار الخلفية الجوهرية عالية. ومع ذلك، تحقق انخفاض في كثافة الخلفية بإدخال طفرة واحدة من الأحماض الأمينية ضمن تسلسل التجارة والنقل (استبدال الحامض الأميني في موقف 203). متحولة T203H الناجمة عن ذلك، المعروفة أيضا باسم فوتواكتيفاتابل-التجارة والنقل (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) ويتسم بانخفاض كبير في امتصاص ذروة البسيطة، التي تزداد تقريبا معززات عندما متحمس في وقت لاحق من 488 نانومتر الضوء عند التشعيع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ومن ثم، overexpression بروتينات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم هو نهج مستخدمة على نطاق واسع، مما يسمح بتحديد نشر وحركية الجزيئات داخل الخلايا. قد طبقنا سابقا أكتين السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم لتحديد معدل تشتت مونومرات أكتين بعيداً عن مناطق سيتوسوليك، السماح بالتنقيب ليس فقط من حركتها داخل في سيتوسول، ولكن أيضا معدل التأسيس إلى بروز شبكة أكتين لاميليبوديال⁶. كما يصف الأدب أكثر حداثة الرواية، وصور قابلة للتحويل من البروتينات التي يمكن من حيث المبدأ بطريقة مماثلة، ولكن إيواء ميزة يحتمل أن تكون مرئية مسبقاً قبل تحويل الصور. وتشمل أمثلة لهذه المجموعة من البروتينات الفلورية Dendra2 و mEos2^9،10،،من¹¹¹².

في هذه المقالة، نحن شرح منهجية الخلايا ميكروينجيكتينج مع البروتينات. كذلك نشرح كيف يمكن دمج هذه التقنية مع فراب، بالبروتينات فوتوبليتشينج المشاركة في التنظيم cytoskeleton أكتين وحركية، وكيف يمكن اشتقاق منحنيات فراب ونصف الوقت لتعافي كسور المتنقلة. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم مثالاً على كيف يمكن استخدام الأسلوب فراب لتحديد معدلات بلمرة الأكتين لشبكات لاميليبوديال. كما أننا نقدم توجيهات ونصائح بشأن كيفية إجراء التجارب فوتواكتيفيشن، والتي يمكن استخدامها لتحديد معدلات لإدماج أكتين لاميليبوديا والتنقل سيتوسوليك من أكتين أحادي. هذه التقنيات، بالطبع، ليست فقط محدودة لتتبع مكونات cytoskeleton أكتين، ولكن يحتمل أن تكون مطلوبة وتكييف معتدلة أو التحسين، يمكن تطبيقها على نطاق واسع لأنواع الخلايا الأخرى أو للتحقيق في البروتينات المختلفة، والهياكل، و معلمات.

Protocol

1-ساترة الغسيل والتعقيم

1. تزج نظارات تغطي 15 ملم (قطر) (رقم 1) في قارورة 500 مل التي تحتوي على خليط من 40 مل 37% HCl و 60 مل 100% EtOH (كوفيرسليبس لا يزيد عن 100 في 100 مل الغسيل الحل).
   ملاحظة: حتى إذا تم شراؤها حديثا، كوفيرسليبس يجب صرامة تنظيفها قبل البذر الخلايا على تلك السطوح. وهذا لأنها قد تحتوي على طبقات رقيقة من الشحوم، التي الميكروسكوب غير مرئية، ولكن كفاءة يمكن أن تتداخل مع التصاق ونشر مناسبة للخلايا الحية. بينما يمكن إزالة مثل هذه الأفلام كفاءة مع الحلول التي تحتوي على حمض أو قاعدة (انظر فيشر et al. ¹³)، ونحن نستخدم بشكل روتيني المخلوط حمض/الكحول الموصوفة أعلاه.
2. هز قارورة تحتوي على نظارات الغطاء لمدة 30 دقيقة على شاكر تناوب. اختر سرعة تسمح النظارات الغطاء يكون ملتف بحرية، ولكن بطء ما يكفي لتجنب الانهيار المتكرر. فيلتراتي الحل لإزالة قطع الزجاج المكسور إذا إعادة استخدام.
3. نقل النظارات الغطاء قارورة تحتوي على مالا يقل عن 200 مل الماء المعقم واحتضان على شاكر تناوب، مع استبدال الماء مرارا وتكرارا حتى رائحة حمضية قد اختفت. وينصح يغسل متعددة على مدى عدة ساعات للقضاء الكامل على آثار HCL EtOH.
4. الجاف للنظارات تغطية الفردية على ورقة لتصفية.
5. مكان النظارات الغطاء في الجزء السفلي من صحن بيتري 10 سم (قطر) مغطاة بورق الترشيح، والحرارة الجاف-تعقيم. تجنب التعقيم كما سيؤدي هذا غطاء النظارات العصا معا.

2-معاملة الخلايا وتعداء، والبذر على كوفيرسليبس

1. تنمو خلايا سرطان الجلد الماوس B16-F1 وفقا لشروط الثقافة خلية قياسية في دميم (الجلوكوز 4.5 غرام/لتر) التي تحتوي على مصل العجل الجنين 10% والجلوتامين مم 2 1% البنسلين-ستربتوميسين في 37 درجة مئوية، 7% CO₂.
2. تنمو خلايا تنتجها الخلايا الليفية NIH3T3 ميكروينجيكتيونس وفقا لشروط الثقافة الخلية القياسية (حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية، 7% CO₂) في دميم (4.5 غرام/لتر جلوكوز) 10% الجنين تحتوي على مصل البقر، بيروفات صوديوم 1 مم، والأحماض الأمينية غير الأساسية MEM x 1 ، الجلوتامين 2 مم، و 1% البنسلين-ستربتوميسين.
3. ترانسفيكشنز، تنمو خلايا B16-F1 لالتقاء 100% في صحن 10 سم، والمرور بنسبة 1:5 في طبق بلاستيك 3 سم (قطر).
4. في اليوم نفسه، بعد الخلايا B16-F1 سمح للانضمام لمالا يقل عن 6 ح، ترانسفيكت مع 500 نانوغرام/طبق من فوتواكتيفاتابل السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين أو معلم اجفب β-أكتين بلازميد الحمض النووي. للمشارك من ترانسفيكشنز للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين مع ناقلات ترميز مشري، مزيج من إجمالي 1 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي كل صحن سم 3.
5. ترانسفيكت الخلايا B16-F1 مع الكاشف تعداء (جدول المواد). لطبق 3 سم، مزيج 200 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم الذي يحتوي على 500 نانوغرام من الحمض النووي بناء مع 200 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم الذي يحتوي على 1 ميليلتر من تعداء كاشف (أي الحمض النووي (ميكروغرام): تم استخدام كاشف (ميليلتر) نسبة 1:2).
6. احتضان تعداء الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) وبيبيت دروبويسي على الطبق سم 3 التي تحتوي على الخلايا. بلطف دوامة الطبق لخلط واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 7% CO₂.
7. إعداد طلاء laminin المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم تريس، درجة الحموضة 7.4 و 150 مم كلوريد الصوديوم.
8. للخلايا B16-F1، معطف نظارات تغطي 15 ملم بنشر 150 ميليلتر من لامينين (25 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت لطلاء laminin) واحتضانها ح 1 في الرايت للخلايا NIH3T3، ومعطف النظارات الغطاء مع الحل فيبرونيكتين (25 ميكروغرام/مل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)) واحتضانها ح 1 في الرايت
9. أغسل لامينين أو فيبرونيكتين المحتضنة غطاء النظارات مع برنامج تلفزيوني، ثم نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل transfected الخلايا.
10. بذور الخلايا B16-F1 transfected (في 01:30 نسبة من طبق المتلاقية)، بعد تعداء، على كوفيرسليبس المغلفة لامينين اليوم. البذور الليفية NIH3T3 (في 01:20 نسبة من طبق المتلاقية) على كوفيرسليبس فيبرونيكتين المغلفة.
11. السماح للخلايا لتنتشر على لامينين أو فيبرونيكتين-المغلفة بغطاء النظارات بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية قبل الفحص المجهري. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تبدأ تجارب الفحص المجهري في نفس اليوم، نظراً لأن الخلايا مسموح لها بنشر على الأقل 2-3 ح.

3-جمعية التصوير غرفة الفحص المجهري

1. استخدام ألومنيوم اتفاقية روتردام-26 موصلة حرارة التصوير غرفة للفحص المجهري (الشكل 1). تشويه الشحوم سيليكون حول كفاف فتح السدادة البلاستيكية باستخدام المحاقن (الشكل 1ب).
2. ضع تغطية الزجاج بالجانب الخلايا في الدائرة (الشكل 1ج).
3. ضع السدادة البلاستيكية على رأس الزجاج غطاء لجعل ختم آمنة بين ساترة والدائرة. إصلاح السدادة البلاستيكية (قطرياً لتجنب الكسر ساترة) عن طريق الشد المشابك انزلاق إلى الدائرة لتجنب المتوسطة تسرب (الشكل 1د).
4. ماصة المتوسطة مجهرية ساخنة قبل 37 درجة مئوية في المنطقة الوسطى. للمتوسطة وانخفاض في أوتوفلوريسسينسي، وهكذا الأمثل للفحص المجهري، استخدم نفس وصفه كالثقافة المتوسطة المبينة أعلاه، ولكن مع F12-لحم الخنزير بدلاً من دميم، بالإضافة إلى ذلك تتضمن 20 مم حبيس لاستزراع الخلايا في غياب CO₂ (الشكل 1ه).
5. إدراج كاشف الحرارة في الفتحة المخصصة للدائرة وربط أقطاب الدائرة إلى وحدة تحكم درجة حرارة تلقائي TC 324B الحفاظ على درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية (الشكل 1و).
6. ضع قطره صغيرة من النفط الغمر على الهدف ووضع الدائرة في الأعلى.
7. احتضان الدائرة مع الخلايا على 10-30 دقيقة على الأقل للسماح لهم باسترداد من انخفاض درجة الحرارة أثناء التركيب وتتكيف مع الوسط مجهرية.
8. قبل الشروع في الفحص المجهري، استبدال المتوسطة الثقافة في الخزان المركزي للدائرة (حوالي 800 ميليلتر) تجنب تركيز غير مناسب من مكونات متوسطة والمصل بسبب التبخر متوسطة. دورات الفحص المجهري المطولة مع الدوائر المفتوحة سوف يتطلب تغيير الروتينية للمتوسط يتبدد.

4-microinjection الداخلي

1. معطف كوفيرسليبس وإعداد الخلايا والتجمع في دائرة التصوير كما هو موضح أعلاه.
2. ذوبان الجليد قاسمة للبروتين المنقي بالحقن (عادة 10 ميليلتر أو أقل)، وتمييع مع المخزن المؤقت microinjection المناسبة.
   ملاحظة: تكوين المخزن المؤقت قد تختلف وفقا لنوع البروتين والخلية، ولكن الحرص على استخدام الرقم الهيدروجيني بين 6.95 و 8.00 وتجنب استخدام برنامج تلفزيوني، كما لا أحب معظم الخلية بالحقن مع برنامج تلفزيوني.
3. ل microinjection Rac1، إعداد مخزن يحتوي على 100 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 5 مم مجكل₂، 1 مم DTT. Mg^{2 +} الأيونات ضرورية للاستقرار جتباسي الصغيرة.
   ملاحظة: تختلف تركيزات البروتين عادة ما بين 0.1 – 1 ملغ/مل (الحد الأقصى 2 مغ/مل)، اعتماداً على البروتين، نوع من التجربة، والخلية نوع.
4. إذا كان ذلك ممكناً، إضافة صبغة الفلورسنت، مثل ديكستران خاملة (0.5 ميكروغرام/ملليلتر، كاتشين 70) إلى حل البروتين، يمكن تأكيد وجود تدفق الإبرة قبل الحقن وتسمح الوثائق المتعلقة بالحقن ناجحة بعد التجربة.
   ملاحظة: هذه التجربة هنا لا يهدف عقب ديناميات Rac1 المحقون، الذي يتسنى إلا عند تسمية الأسفار مباشرة من البروتين. اقتران بروتينات مع الأصباغ الفلورية أو الانصهار لبروتين فلورسنت ممكن، ولكن تجنب هنا كما أنها تؤوي خطر التداخل مع الدالة إرسال الإشارات، وبخاصة بروتينات الصغيرة مثل GTPase Rac1 رو-الأسرة (كاتشين 20).
5. الطرد المركزي حل البروتين في 10,000 ز س لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة المجاميع البروتين يمكن أن تؤدي إلى إبرة انسداد إذا كانت موجودة في microinjection الشعرية.
6. تحميل إبرة microinjection (microinjection الشعرية) مع 1 ميليلتر من حقن خليط من الجهة الخلفية باستخدام تلميح تلميح/ميكرولوادير ماصة مرنة.
7. إذا فقاعات الهواء موجودة في طرف الإبرة، اضغط برفق قاعدة الإبرة بغية إزالتها. تمضي بسرعة لتفادي التجفيف من طرف الإبرة، التي يمكن أن تسبب انسداد الإبرة.
8. ضبط صاحب إبرة في الجهاز ميكرومانيبوليشن بعناية. في حالة استخدام مجهر مقلوب لتصوير مرحلة التباين، قبل تحميل إبرة، ضمان توجد مساحة كافية لتحريك الإبرة صعودا وهبوطاً دون إعاقة المكثف المجهر.
9. عند الشد ميكروكابيلاري على حامل الإبرة، تطبيق الضغط (الضغط الخلفية hPa 20 – 50) بالإبرة باستخدام جهاز ضغط microinjection قبل ترانسلوكاتينج نصيحة إبرة في مستنبت الخلية.
   ملاحظة: تفعيل الضغط عند الإبرة في الأجلين المتوسط وسوف ينتج في المتوسط الانجرار بالقوة الشعرية، وهكذا حظر حقن الحل للفائدة.
10. ضع الإبرة في مجال الرؤية (سهل باستخدام أهداف تضخم منخفضة). واستخدمت هدفا جاف X 40 لتجارب microinjection هنا.
11. ضع طرف إبرة الميكروسكوب في وضع عمودي بالنسبة إلى المنتصف العدسة الهدف (وهذا سيسرع من إيجاد طرف الإبرة). استخدام المجهر مع البصريات المرحلة عالي التباين لنقل تلميح إبرة في الطائرة الأفقي بالنسبة لمجال الرؤية، على طائرة ضوئية جيدا فوق طبقة الخلية.
    ملاحظة: سوف تظهر الإبرة مبدئياً كظل في مجال الرؤية والطائرة التركيز يمكن تعديلها ثم تصور نصيحة. حالما يتم العثور على غيض الإبرة، تدريجيا خفض الطائرة الضوئية متبوعاً بنصيحة إبرة وصولاً إلى موقف قريب من طبقة الخلايا.
12. تحقق تدفق إبرة عن طريق التحول إلى قناة فلورسنت عند استخدام ديكستران الفلورسنت، وضبط تدفق استخدام جهاز الضغط للحصول على تدفق ثابت "خلفية".
    ملاحظة: في هذه المقالة، يمكننا وصف الحقن اليدوي، الذي هو توسط كسر عبر غشاء البلازما عن طريق لمس الخلية السطحية ولطيف حركة طرف الإبرة أثناء تدفق إبرة ثابتة. ويجب تمييز هذا من أجهزة الحقن التلقائي مصحوبا بزيادة ضغوط تخفيض وابرة إبرة المبرمجة خلال الأحداث الحقن، التي أكثر ملاءمة لحقن أعلى أرقام الخلية متبوعاً بعدد سكان خلية لاحقاً تحليل. الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لتحليل خلية مفردة بالفحص المجهري الوقت الفاصل بين قبل وأثناء وبعد microinjection.
13. العثور على خلية للفائدة وانخفاض تدريجيا الإبرة أعلى الخلية.
14. عندما تكون جاهزاً ميكروينجيكت، انخفاض الإبرة تدريجيا نحو منطقة بيرينوكلير الخلية باستخدام ترس غرامة من الجويستيك ميكرومانيبولاتور، مع إبقاء الخلايا في التركيز.
15. ل microinjection، اللمس بلطف غشاء بلازما الخلية، والذي قد يكون كافياً لاختراق الخلية، أو المعونة تمزق الأغشية عابرة من صنبور لطيف جداً على إعداد المجهر.
    ملاحظة: سوف تشير إلى نقطة بيضاء على طرف إبرة وقت الاتصال مع غشاء البلازما؛ عقب تمزق الأغشية، سيتم إعادة ختم طرف الإبرة، مصحوبة بتدفق لطيف للحل الحقن داخل الخلية.
16. إيقاف عملية الحقن بمجرد تدفق إلى الخلية مرئياً (من الناحية المثالية داخل 0.3 s) التي تتحرك صعودا نصيحة إبرة في المتوسط. عند استخدام ديكستران نيون، يمكن توثيقها الحقن الناجح فورا بالأسفار.
17. إذا رغبت في ذلك، الشروع في الحصول على الوقت الفاصل بين الصور قبل أو بعد microinjection.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ التطبيق المحلي للمخدرات أو مثبطات في جميع الخطوات هنا، باستثناء microinjection الحدث في حد ذاته. للتطبيقات المحلية، يمكن أن يسيطر عليها ضغط تدفق نشر جزيء النشطة، وموثقة بالأسفار، ويمكن وضع طرف الإبرة في الارتفاع المطلوب. للحصول على أمثلة لتجارب التطبيق المحلي، انظر مثلاً الصغيرة وروتنير¹⁴ أو كافيرينا et al. ¹⁵
18. وبعد microinjection، انتظر حتى يحدث تأثير البروتين. للبروتينات المختلفة وتبعاً للنتائج المتوقعة، قد تختلف أوقات الاحتضان. ل GTPase Rac1 الصغيرة، الاستجابة لتشكيل لاميليبوديوم يمكن أن تكون بدأت داخل 1 دقيقة أو أقل، ولكن يأخذ حوالي 10-15 دقيقة في المتوسط لتطوير كامل(الشكل 1)ز، ح).
19. القاضي صلاحية الخلايا بعد microinjection.
    ملاحظة: الحقن غير مناسبة أو ضارة يمكن أن يسبب تلف الخلايا، التي كثيرا ما يقترن بسحب حافة خلية غير محددة أو تمزق الأغشية البلازمية.
    1. تجنب دس عبر غشاء البلازما كل من أعلى وأسفل، التي يمكن أن تحدث للحقن في المناطق الخلوية شقة.
       ملاحظة: ينبغي أن تظل حقن وحدات التخزين إلى الحد أدنى (من الناحية المثالية < 5% حجم الهاتف الخلوي)، وعادة ما تكون في النطاق فيمتوليتير. يتطلب حقن كميات يمكن أيضا التحكم بالتغيرات في التركيز، ولكن لاحظ أنه للبروتينات، وتركيزات > 2 مغ/مل قد أصبح غير عملي بسبب انسداد إبرة متكررة. ولكن هذا يعتمد أيضا على نوعية والسلوك من البروتين النقي؛ مثلحقن أكتين فلوريسسينتلي إلى جانب معقد البلمرة تعتمد على التركيز ولا مفر منها في طرف الإبرة، وحتى أنه نادراً ما ينفذ اليوم (انظر الصغيرة et al. ¹⁶).
20. من قبل، أثناء أو بعد تأثير microinjection، فراب أو فوتواكتيفيشن يمكن أن يؤديها على نفس الخلية (انظر القسم 5 و 6).

5-اربط الداخلي

1. ترانسفيكت نوع الخلية للفائدة (الخلايا B16-F1 هنا) مع بلازميد الحمض النووي ترميز بروتين فلوريسسينتلي معلم للفائدة (هنا، استخدم إصدار معلم اجفب β-أكتين). بذور الخلايا على كوفيرسليبس لامينين المغلفة (الخطوة 2، 10).
2. قم بتجميع الدائرة التصوير (الفرع 3).
3. استخدم الإعدادات التالية للمنطقة لاميليبوديال فوتوبليتشينج: 65 ميغاواط الليزر الطاقة (متغير وفقا لمصدر الإعداد وليزر تجريبي)؛ شعاع الليزر 10 بكسل طول القطر؛ 1 ms التبييض يسكن الوقت/بكسل؛ 500 مللي وقت التعرض للتجارة والنقل؛ الفاصل الزمني 1,500 مرض التصلب العصبي المتعدد. وأجريت بهدف اللازيغيه 100 × 1.4NA النتائج التجريبية في هذه الورقة.
4. إجراء المعايرة الليزر لضمان الدقة في الأبعاد لمنطقة فوتوبلياتشيد. قبل معايرة، نقل مجال الرؤية إلى منطقة تفتقر إلى أي إشارة الخلايا/الأسفار ومراقبة الصورة على شاشة العرض.
5. حدد التكبير موضوعية بواسطة النقر فوق الزر تكبير كل منهما وتقليل قوة الليزر (3 – 5 ميغاواط) في "الفريق | كثافة "القائمة. لبدء المعايرة اليدوية في برنامج فيسيفيو (v2.1.4)، حدد "تكوين | قائمة فراب "وانقر فوق" معايرة | قائمة ضبط يدوي ". ضمان أن الليزر يمكن تمييزها كنقطة حادة. إذا لم يكن كذلك، أما تركيز أو ضبط أجهزة الليزر.
6. إجراء المعايرة بتوجيه الليزر يدوياً إلى إحداثيات محددة سلفا برنامج س-ص. يرشد هذا البرنامج كيفية تستهدف على وجه التحديد الليزر لمنطقة المعرفة من قبل المستخدم للتكبير الحالي.
7. قبل تحريك الليزر، قم بالتبديل إلى قناة التجارة والنقل والشروع في اقتناء الصورة/الوقت الفاصل.
8. رسم المنطقة لأن فوتوبليتشيد على قناة بروتينات فلورية خضراء، أثناء عرض العرض يدوياً.
9. بدء فوتوبليتشينج بمشغل يدوي من 405 نانومتر الليزر، إطارات على الأقل 3 – 4 بعد الشروع في الحصول على الصور. الحصول على الإطارات قبل فوتوبليتشينج مطلوب من أجل تطبيع الصورة في وقت لاحق من تحليل البيانات.

6-فوتواكتيفيشن الداخلي

ملاحظة: البرامج وإعداد المجهر والإعدادات، باستثناء السلطة الليزر، مماثلة لتلك التي فراب. في فوتواكتيفيشن، فرقا هاما بالمقارنة مع فراب، هو أن سلطة 405nm-ليزر أقل بكثير من التي تستخدم فوتوبليتشينج يجب أن تستخدم، لتنشيط التجارة والسلطة الفلسطينية--النقل دون فوتوبليتشينج في نفس الوقت فإنه.

1. ترانسفيكت نوع الخلية ذات الاهتمام المشترك (B16-F1 الخلايا هنا؛ راجع الخطوة 2.5) مع الحمض النووي بلازميد ترميز آخر البروتين المسمى فلوريسسينتلي (مثلاً، مشري أو مشري-ليفيكت) والسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين.
   ملاحظة: في معظم الحالات، مشري-إيجابية الخلايا أيضا ستكون إيجابية بالنسبة لناقلات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين، ينظر إليه عادة على قناة بروتينات فلورية خضراء قبل فوتواكتيفيشن الأخيرة. ولتعزيز فرصة أن الخلايا مشري-الإيجابية أيضا إيجابية للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، استخدام نسبة 1:2 تعداء mCherry:PA-التجارة والنقل-أكتين. في أعقاب هذا البروتوكول، وأكثر من 90% من الخلايا معربا عن مشري عرض تنشيط ناجح للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين.
2. خلايا البذور B16-F1 على كوفيرسليبس لامينين المغلفة (الخطوة 2، 10).
3. قم بتجميع الدائرة التصوير (الفرع 3).
4. قبل الشروع في تجارب فوتواكتيفيشن، إذا لزم الأمر، إجراء المعايرة الليزر للهدف المحدد (الخطوة 5، 5، 4-6).
5. تعيين اكتساب صورة بروتينات فلورية خضراء/488 نانومتر إلى 500 مللي 1,500 مرض التصلب العصبي المتعدد والتعرض الفاصل الزمني (بالاعتماد على التصميم التجريبي).
6. ضبط إعدادات البرنامج للحصول على أفلام الوقت الفاصل بين قناة ثنائية أو ثلاثية القنوات بوسم المربع "سلسلة الطول الموجي" وتحديد العدد المطلوب من القنوات في "الحصول على | الطول الموجي "القائمة. من المستحسن أن الأفلام مرور الوقت تكتسب مع تباين المرحلة وقنوات التجارة والنقل.
   1. بشكل اختياري، وتشمل أيضا قناة مشري؛ ومع ذلك، قد حمل تعريض الخلايا مع الكثير من الضوء د. وهذا يمكن تلافيها الزبالين الأكسجين مثل أوكسيراسي¹⁷، على الرغم من أن العلاج الفعال يتطلب ختم الدائرة الخلية.
7. البحث عن الخلايا ترانسفيكتيد على قناة مشري.
8. قبل تحريك الليزر، الشروع في اقتناء الصورة/الوقت الفاصل ورسم المنطقة لأن فوتواكتيفاتيد على قناة التباين المرحلة، أثناء عرض العرض يدوياً.
9. بدء فوتواكتيفيشن بمشغل يدوي من 405 نانومتر الليزر (تعيين كثافة بين 5 – 15 ميغاواط من "الفريق | كثافة "القائمة)، إطارات على الأقل 3 – 4 بعد بدء الحصول على الصورة.

7-بيانات تحليل وعرض النتائج فراب

ملاحظة: يتم استخدام الأسلوب الذي قدم للتحقيق في دوران البروتين تتراكم في مواقع الجمعية أكتين ديناميكية، وفي هذه الحالة بسب، الذي يربط مع مواقع الالتصاق والنصائح من جاحظ لاميليبوديا. أننا تقوم بتحليل حجم أعمالها على طرف لاميليبوديوم، ولكن يمكن تطبيق نفس مبادئ تحليل للتحقيق في دوران فاسب أو أي البروتين الأخرى وسائر الأجزاء الأخرى سوبسيلولار.

1. فتح الوقت الفاصل بين الأفلام المستمدة من فيسيفيو في برنامج ميتامورف. واستخدمت في هذه المقالة، v7.8.10 ميتامورف.
2. استخلاص قيم الكثافة للمناطق فوتوبليتشيد بتحديد المناطق المعنية على ميتامورف يدوياً. رسم شكل في غيض لاميليبوديوم التي تغطي كامل أو جزء من منطقة فوتوبلياتشيد، وتعديل موقفها بشأن الإطارات التالية يدوياً إذا لزم الأمر (أي، إذا كان هو الحافة بارزة) في النظام لتتبع التغيرات في كثافة لاميليبوديال المكون كل منها خلال التشريد تلميح.
3. للتصحيح للحصول على معلومات أساسية وفوتوبليتشينج، تحليل المناطق داخل وخارج الخلية. انظر الشكل 2 لمناطق تمثيلية لقياس كثافة.
4. بينما يتم تحديد عائد الاستثمار استخراج قيم كثافة في ميتامورف باستخدام القائمة "التدبير | قياس المنطقة ". تأكد من تحديد خيارات "الوقت المنقضي" و "متوسط كثافة" في القائمة "تكوين". انقر فوق "فتح سجل" وحدد "تبادل البيانات الديناميكي". انقر فوق "موافق" لفتح جدول بيانات Excel وانقر فوق الزر "فتح سجل" مرة أخرى للصق القيم ميتامورف في Excel.
   ملاحظة: يتم استخدام هذه القيم لإنشاء منحنيات الانتعاش الأسفار.
5. لإنشاء منحنيات الانتعاش fluorescence في تلميح لاميليبوديوم من مناطق فوتوبلياتشيد (تطبيع لكثافة المنطقة قبل فوتوبليتشينج)، تطبيق المعادلة التالية:
      معادلة 1
   حيث: اربط^Tn هو كثافة المنطقة فوتوبليتشيد لكل إطار من الفائدة بعد فوتوبليتشينج؛ إلى^تينيسي كثافة منطقة اتخذت خارج الخلية (خلفية) لكل إطار من الفائدة بعد فوتوبليتشينج؛ وظائف^Tn اثنين في المتوسط داخل المنطقة كثافة لكل إطار من الفائدة بعد فوتوبليتشينج (تستخدم لتطبيع لاكتساب فوتوبليتشينج على مر الزمن)؛ فراب^T-1 هو كثافة المنطقة فوتوبلياتشيد قبل فوتوبليتشينج؛ ^T-1 كثافة منطقة اتخذت خارج الخلية (خلفية) قبل فوتوبليتشينج؛ ووظائف^T-1 اثنين في المتوسط داخل المنطقة كثافة لكل إطار من المصلحة قبل فوتوبليتشينج.
6. لكل إطار زمني للفائدة، استخدم المعادلة 1 الحصول على منحنى انتعاش الأسفار التي تحتوي على جميع الأطر الزمنية التحقيق. طول الفترة الزمنية يعتمد كلياً على البروتين قيد التحقيق. عندما غير معروف، إجراء تجارب أولية للحصول على معدل الدوران للبروتين.
7. لحساب النصف الوقت للتعافي، لصق قيم المنحنى fluorescence الانتعاش مع الوقت المقابل (بالثواني) في مؤامرة سيغما (خامسا – 12)، وأداء منحنى تناسب استخدام "ديناميكية تناسب المعالج | أداة زيادة هائلة إلى الحد الأقصى ". حدد مونو-أسي (واحد، 3 معلمات) أو ثنائية الأسية (مزدوج، 4 معلمات) الوظائف حسب منحنى أفضل احتواء.
8. استخدم الصيغة التالية للدالة الأسية مونو:
      المعادلة 2
9. استخدم الصيغة التالية للدالة الأسية ثنائية:
      المعادلة 3
10. قم بلصق معلمات "ب" و "د" المستمدة من "الأرض سيغما" (المعادلة 2 أو 3 المعادلة) إلى Excel لحساب النصف الوقت للتعافي. تطبيق المعادلات التالية:
       المعادلة 4
    أو
       المعادلة 5
11. عندما ينتج الدالة الأسية مونو منحنى دقيقة تناسب، تنطبق فقط 4 المعادلة.
12. عندما لا تؤدي الدالة الأسية مونو في منحنى جيدة تناسب، تطبيق صيغة ثنائية الأسى بحل المعادلة 4 و 5 المعادلة. النظر في الناتج-مرتين النصف الانتعاش أنها تمثل أجزاء مختلفة من البروتين هما: سرعة وكسر تبادل ببطء، على التوالي.

8-تحديد سعر بلمرة الأكتين لاميليبوديال قبل اربط

1. لتحديد معدل بلمرة الأكتين لاميليبوديال، ترانسفيكت الخلايا B16-F1 مع المعلمة اجفب β-أكتين، واستخدام فوتوبليتش منطقة لاميليبوديال (الخطوة 5.9) 1.5 s الفاصل الزمني والتعرض بروتينات فلورية خضراء 500 مللي ثانية.
2. افتح الأفلام الوقت الفاصل بين المكتسبة من فيسيفيو في ميتامورف، ومعايرة نسبة بكسل/ميكرون طبقاً للهدف المستخدمة من قبل "التدبير | أداة معايرة المسافات ".
3. تشغيل الفيلم الوقت الفاصل بين ووقفها على الإطار عند استرداد الأسفار لاميليبوديال، الذي يتدفق إلى الوراء نحو الرقيقة كخط، وصلت في لوحة ولا يمكن تعقب التدفق الخلفي.
4. قياس المسافة في ميكرومتر بين غيض من لاميليبوديوم والجزء الخلفي من الأسفار المستردة. يتوافق مع هذه المسافة لمجموع تدفق إلى الوراء ونتوء المسافات.
5. وبدلاً من ذلك، فصل في نتوء من التدفق إلى الوراء، مارك نصيحة لاميليبوديال مع إطار سطر واحد قبل فوتوبليتشينج. استخدام الخط كمرجع نقطة في الإطارات التالية للإشارة إلى الموقع الأصلي لنصيحة لاميليبوديوم في وقت فوتوبليتشينج؛ يمكن استخدام نقطة مرجعية لقياس المسافة نتوء والتدفق إلى الوراء.
6. ملاحظة الوقت (بالثواني) المطلوبة لاسترداد الأسفار بعد فوتوبليتشينج تحدث. الوقت يمكن حسابها يدوياً من معدل الإطار أو تصور من ميتامورف من خلال "التدبير | أداة قياس المنطقة ".
7. استخلاص معدل بلمرة الأكتين باستخدام المعادلة التالية (مع بعض المعلمات المعادلة على أساس القياسات ميتامورف من الخطوات 8.4 و 8.6):
      معادلة 6
   حيث معدل بلمرة الأكتين في الدقيقة ميكرومتر، تدفق إلى الوراء مسافة في ميكرومتر، لاميليبوديال نتوء مسافة في ميكرومتر، والوقت بالثواني.

9-تحليل نشر البروتين والتنقل عند فوتواكتيفيشن

ملاحظة: يصف الأسلوب الذي قدم هنا تحليل أكتين مونومر التنقل باستخدام فوتواكتيفيشن أكتين تنصهر فيها السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل، كما يتضح من التصور والتقدير الكمي للبروتين نشرها من خلال سيتوسول.

1. لقياس انتشار أكتين فوتواكتيفاتابل بعيداً عن منطقة سيتوسوليك، فضلا عن التراكم داخل منطقة لاميليبوديال، استخدم ميتامورف لتحديد الكثافة على مر الزمن في المناطق التالية (الموضحة في الشكل 3 ): منطقة فوتواكتيفاتيد سيتوسوليك (السلطة الفلسطينية)؛ منطقة لاميليبوديال، في فوتواكتيفاتيد الذي يتوقع بروتينات تتراكم على مر الزمن (لام)؛ منطقة خارج الخلية المستخدمة للتطبيع للأسفار الخلفية (بها).
2. وعند تحديد تنقل أكتين داخل سيتوسول، قياس مناطق متميزة سيتوسوليك (انظر الشكل 3من مناطق R1-R5). لاحظ أنه يتعذر تحديد الحصول على فوتوبليتشينج بطريقة مماثلة إلى فراب، بسبب زيادة في الأسفار التنسيق-وفي نهاية المطاف على نطاق الخلية عند التنشيط.
3. تحويل قيم الكثافة لجميع المناطق من ميتامورف إلى جدول بيانات Excel، كما هو موضح في الخطوة 7، 4.
4. لفحص معدل نزوح أكتين فوتواكتيفاتابل بعيداً عن منطقة سيتوسوليك في فوتواكتيفيشن أو المعدل لإدراجها ضمن منطقة لاميليبوديال (وكلاهما يمثل كنسبة كثافة في منطقة فوتواكتيفاتيد سيتوسوليك في الوقت 0) ، إنشاء منحنيات الأسفار من البيانات في الخطوة 9، 3. تطبيق المعادلات التالية:
      المعادلة 7
      المعادلة 8
   حيث: السلطة الفلسطينية^Tn هو الكثافة من منطقة فوتواكتيفاتيد سيتوسوليك لكل إطار من الفائدة بعد فوتواكتيفيشن؛ لام^Tn هو الكثافة من منطقة لاميليبوديال لكل إطار من الفائدة بعد فوتواكتيفيشن؛ إلى^تينيسي كثافة منطقة المتخذة خارج الخلية (خلفية) لكل إطار من الفائدة بعد فوتواكتيفيشن؛ السلطة الفلسطينية^T-1 هو الكثافة من منطقة فوتواكتيفاتيد سيتوسوليك قبل فوتواكتيفيشن؛ لام^T-1 هو الكثافة من منطقة لاميليبوديال قبل فوتواكتيفيشن؛ ^T-1 هو كثافة منطقة المتخذة خارج الخلية (خلفية) قبل فوتواكتيفيشن؛ السلطة الفلسطينية^T0 هو الكثافة من منطقة فوتواكتيفاتيد سيتوسوليك في وقت 0 (أي، الإطار الأول بعد فوتواكتيفيشن)؛ و^T0 هو كثافة منطقة المتخذة خارج الخلية (خلفية) في وقت 0 (أي، الإطار الأول بعد فوتواكتيفيشن).
5. بشكل اختياري، للحصول على رؤية أفضل للبيانات، تطبيع منحنيات شدة إلى 0 بطرح كثافة الإطار الأول بعد فوتواكتيفيشن من كل إطار اللاحقة.
   ملاحظة: أسلوب التحليل التالي (خطوات 9.6 – 9.8) كما يسمح حساب تشتت أكتين فوتواكتيفاتيد داخل سيتوسول سيتوسوليك.
6. قياس الكثافة لمناطق سيتوسوليك، التي تتمركز ديستالي التتالي من منطقة التنشيط.
7. لتمثل الكثافة في هذه المناطق كنسبة كثافة من منطقة فوتواكتيفاتيد في الساعة 0، يتم تطبيق المعادلة 8، حيث يتم استبدال كثافات لاميليبوديال بكثافة لكل سيتوسوليك دوروا. حجم وعدد من المناطق قد تختلف تبعاً للمسافة الحجم وتشتت الخلية تقاس.
8. لصق بالوقت وقيم المنحنى لزيادة كثافة الأسفار لكل منطقة في الأرض سيغما (مشابه لتحليل فراب في القسم 7)، واستخدام لاستخلاص قيمة قابلة للقياس الكمي لمعدل البروتين فوتواكتيفاتيد التسلل إلى كل منطقة سيتوسوليك، المعادلة 2 و 4 المعادلة لاشتقاق النصف الوقت لشدة الأسفار التوصل إلى هضبة. مقارنة قيم t_1/2 بين المجموعات التجريبية المختلفة.

Results

ز الرقم 1 ح، و إظهار الصور التباين المرحلة خلية تنتجها الخلايا الليفية NIH3T3 السابقة و microinjection بعد 10 دقائق من Rac1، وهو جتباسي رو-أسرة صغيرة قادرة على استحثاث تشكيل لاميليبوديا من خلال تفاعله مع موجه معقدة. هو تصور الخلية الأولى قبل microinjection (الشكل 1ز)، للتأكد من صلاحيتها ومورفولوجيا، مثلاً، عدم وجود لاميليبوديا. في microinjection بعد 10 دقيقة، تغيرت الخلية الواضح في التشكل، الذي من المتوقع من هذه المعاملة، ويشير إلى حقنه ناجحة (الشكل 1ح).

للبساطة والوضوح، بعد توفير نتائج مثالية لتحليل فراب وفوتواكتيفيشن في الخلايا التي لا ميكروينجيكتيد بالإضافة إلى ذلك.

يبين الشكل 2وتحليل دوران فاسب معلم اجفب على طرف لاميليبوديوم. لاحظ أن بسب يستهدف بالإضافة إلى ذلك إلى التصاقات الوليدة والتنسيق، النقط الصغيرة وممدود في الخلية الداخلية^18،19. كثافة الأسفار من منطقة لاميليبوديال مع إلى تراكم VASP واضحة في التلميح المبيضة وقياس لكل إطار زمني، باتباع الكفاف من العائد على الاستثمار قبل وأثناء وبعد تبيض كما يبرز لاميليبوديوم إلى الأمام. كما يتم يجري إعادة تدويرها المبيضة اجفب-بسب البروتينات بالجزيئات غير مقصور على هذه المواقع، يلاحظ الانتعاش التدريجي للأسفار (الشكل 2ب). منحنى فراب الانتعاش تطبيع لشدة ما قبل التبييض (معبراً 1) والتي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يتبين في الشكل 2ج. فوتوبليتشينج الكفاءة يمكن أن تختلف، وكان حوالي 20 في المائة من القيمة قبل تبيض في هذا المثال، كما هو محدد من القيمة عند t0 (الإطار الأول بعد فوتوبليتشينج). زيادة ومضان يصل إلى هضبة في المثال الموضح في ما يقرب من 80 في المائة الأسفار قبل التبييض. في بنية ثابتة أثناء وقت التجربة، مثل التصاق المحورية، بلغ الفرق بين كثافة قبل التبييض والأسفار الهضبة بعد استرداد يعرف الكسر غير متحرك (إذا، سهم أحمر في الشكل 2 ج، ه،) وحين استرداد مبلغ الأسفار بين وقت الانتعاش الكامل وتبيض يعرف الكسر المتنقلة (مزدوج الرأس سهم أخضر في الشكل 2ج، ه). لاحظ أن في بنية متغيرة بشكل حيوي مثل نصيحة لاميليبوديوم حلل هنا، مدى إذا قد تمثل الجزيئات غير متحرك، بل تنبع أيضا من خفض سرعة نتوء، وكما هو معروف كثافة اجفب-بسب أن تعتمد على هذا ¹⁸من المعلمة. لحساب النصف الوقت للتعافي، تم إنشاء منحنى تناسب على الأرض سيغما (الشكل 2د). وفي هذه الحالة، يساوي قيمة المعلمة "ب" المستخرجة من حل المعادلة 2 0.0754، عند تطبيق الدالة اللوغاريتمية (المعادلة 4) النتائج في نصف-وقت المقدر لانتعاش 9.19 s (الشكل 2د ، الفريق اليمين المتطرف)، وهو نسبيا سريعة في هذه الخلية خاصة مقارنة بالمتوسط سبق نشرة⁵. تجدر الإشارة إلى أن نصف-أوقات الانتعاش قد أحياناً تختلف اختلافاً كبيرا من خلية إلى خلية داخل نفس السكان. ولذلك، للحصول على نتائج تمثيلية، نوصي بتحديد هذه المعلمة كمتوسط من خلايا على الأقل 15-20. لتوضيح درجة التباين، الوسائل الحسابية الانتعاش اجفب-بسب في المتوسط من الخلايا 15 لكل الوقت نقطة يتم إنشاؤه (الشكل 2ﻫ)، ومنحني متوسط يناسب إنشاء وعرض بطريقة مماثلة (الشكل 2 و).

معدل البلمرة شبكة أكتين لاميليبوديال يضم مجموع نتوء الشبكة إلى الأمام وإلى الوراء من تدفق. ويمكن تطبيق فراب لقياس معدل بلمرة الأكتين بخلايا ترانسفيكتينج (في هذه الحالة B16-F1) مع المعلمة اجفب β-أكتين وفوتوبليتشينج منطقة لاميليبوديال بارزة (الشكل 2ز). لتحليل البلمرة شبكة أكتين لاميليبوديال، ويتم تقييم الانتعاش الأسفار عند تبيض من معلم اجفب β-أكتين على مر الزمن. بلمرة الأكتين مونومرات تقدم في نهايات الشائكة من خيوط أكتين لاميليبوديال (كلها تشير إلى أن الجبهة²⁰)، هي الشبكة ريرواردس ذوبانها باستمرار وتتقدم إلى الأمام، المعدلات التي يمكن بسهولة التي تم الحصول عليها من خلال استعادة الاستقطاب من الأسفار عند فوتوبليتشينج. اكتمال استرداد الأسفار لاميليبوديوم حالما وصلت إلى منطقة المبيضة منطقة انتقالية بين الجزء الخلفي من لاميليبوديوم والرقيقة، التي تتسم بأقل كثافة من حزم الشعيرة ترتيبها أفقياً أكثر تسليم ببطء أكثر بكثير من ما يلاحظ في لاميليبوديوم. كما هو موضح في الشكل 2ز، يمكن تصور الانتعاش الأسفار كخط أفقي إلى الحافة وتتدفق إلى الوراء نحو الرقيقة، الذي يتيح قياس المسافات نتوء والتدفق إلى الوراء (تمثيل فردي في اللوحة اليمنى الآن من الشكل 2ز كالسهام مزدوج الرأس البرتقالي والأحمر، على التوالي).

وقد طبقنا أيضا فوتواكتيفيشن في الخلايا B16-F1 transfected مع السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين لتعقب تنقل أكتين مونومرات داخل سيتوسول ومعدل إدماجها ضمن جاحظ لاميليبوديا. كما هو موضح في الشكل 3أ، ب، منطقة سيتوسوليك فوتواكتيفاتيد بالتعرض لليزر 405 نانومتر، بينما الصور التي تم الحصول عليها في التجارة والنقل القناة كل 1.5 ثانية لتصور توزيع التجارة والنقل-معلم، أكتين فوتواكتيفاتيد. ويمكن رؤية فوتواكتيفاتيد بروتينات فلورية خضراء-أكتين نشرها خارج منطقة سيتوسوليك في الشكل 3ب. ويمثل معدل انخفاض كثافة fluorescence في منطقة سيتوسوليك فوتواكتيفاتيد بالنسبة المئوية لكثافة الأولية في t0 (الإطار أولاً بعد فوتواكتيفيشن؛ الشكل 3 ج)-أكتين فوتواكتيفاتيد يدمج أيضا على نصائح لاميليبوديا، حيث يتم إضافة جديدة أكتين مونومرات إلى تزايد نهايات الشائكة التمطيط خيوط أكتين خلال نتوء. لتقدير معدل إدماج لاميليبوديال، قمنا بقياس كثافة الأسفار على مر الزمن من الأبعاد كونتور/منطقة ميكرومتر تقريبا 5 في العرض و 1 ميكرومتر في الطول؛ أن المنطقة كانت باستمرار إعادة وضعه في غيض لاميليبوديوم أنها من بروز. إدراج أكتين مثلت بالنسبة المئوية لكثافة fluorescence في منطقة سيتوسوليك فوتواكتيفاتيد في t0 (الشكل 3د). كما تقدم استطالة خيوط الأكتين، وقد أدرجت الجديدة أكتين مونومرات في الجبهة لاميليبوديال. جزء صغير من هذه المركبات الكيماوية أكتين ستوتشاستيكالي مستمدة من مجمع سيتوسوليك حيث كانت مونومرات فوتواكتيفاتيد. وهذا يؤدي الزيادة السريعة في عدد الأسفار في لاميليبوديا في أول 20 ثانية بعد فوتواكتيفيشن. كما يتم إضافة مونومرات جديدة لجبهة لاميليبوديال، تدفق مونومرات أكتين أدرجت سابقا مع خيوط صوب لوحة من التدفق إلى الوراء. مع مرور الوقت، دوروا مليء تماما مونومرات الفلورسنت وهو التوصل إلى هضبة في الأسفار (الشكل 3د). ويلاحظ حدوث انخفاض تدريجي في الأسفار ثم عندما، عقب نشر مونومرات فوتواكتيفاتيد في جميع أنحاء الخلية، غير فوتواكتيفاتيد أكتين مونومرات متزايدة إعادة تضاف إلى جبهة لاميليبوديال. سوف تجد هذا انخفاض في الأسفار هضبة جديدة، التي سيتم التوصل إليها حالما يتم التوصل إلى توازن في الخلية بأكملها بين مونومرات فوتواكتيفاتيد وغير فوتواكتيفاتيد (البيانات لا تظهر).

تنقل مونومرات أكتين في جميع أنحاء سيتوسول مستمدة بقياس كثافة fluorescence في مناطق متساوية في الحجم المتمركزة ديستالي من منطقة فوتواكتيفاتيد (المتمثلة في الشكل 3 حسب لون ترميز المناطق المسماة R1-R5). كما هو موضح في الشكل 3ﻫ، كثافة الأسفار في كل منطقة من هذه المناطق يتناقص تدريجيا بعيداً عن سيتوسوليكالي منطقة فوتواكتيفاتيد، كجزء مونومرات أكتين فوتواكتيفاتيد يصبح متزايد المخفف مع عدم تنشيط مونومرات (أي غير الفلورية). وعلاوة على ذلك، يتم التوصل إلى ذروة fluorescence لاحقاً: بعيدة أكثر المنطقة المقاسة يقع من منطقة فوتواكتيفاتيد، ويعد الوقت الذي مطلوب من أجل مونومرات أكتين منتشر في هذه المناطق. يمكن اشتقاق قيمة تمثيلية لدرجة أكتين مونومر تسلل إلى كل منطقة بالتحديد الكمي لنصف الوقت للتوصل إلى الهضبة الأسفار. أكثر بعدا في المنطقة، ويعد يستغرقه أكتين فوتواكتيفاتيد منتشر في ذلك، وبالتالي المزيد من الوقت المطلوب للهضبة الفلورسنت التوصل إلى يؤدي في النهاية إلى قيمة_1/2 ر أعلى (الشكل 3ه).

الشكل 1 : التصوير الداخلي قاعة الجمعية و microinjection. () مكونات غرفة التصوير. الشحوم (ب) سيليكون ملطخ بعناية حول افتتاح السدادة البلاستيكية. (ج) ساترة يتوضع مع الجانب الخلية مواجهة في وسط قاعة التصوير فتح. هو أنشأتها الختم (د) أمن المواقع السدادة البلاستيكية على رأس ساترة وتشديد المشابك الجانبية. هو بيبيتيد المتوسطة (ﻫ) الفحص المجهري في فتحه الدائرة. يتم وضع (f) قاعة التصوير في مرحلة مجهر وكاشف الحرارة واقطاب مرتبطة بوحدة تدفئة المحددة مسبقاً إلى 37 درجة مئوية، والخلايا ويسمح للتكيف لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الشروع في الفحص المجهري. في هذا المثال، مرحلة مجهر مزودة أيضا ميكرومانيبولاتور لأداء ميكروينجيكشنز، وهو انخفض إبرة microinjection في المتوسط تغطي طبقة الخلية في قاعة التصوير. هو تصور الخلية تنتجها الخلايا الليفية (ز) NIH3T3 قبل microinjection بالتباين مرحلة الفحص المجهري. الصليب الأحمر في حجرة بيرينوكلير يشير إلى موقع microinjection المستقبل، الذي يتوافق مع منطقة هيولى عالية بسبب القرب الشديد لنواة ضخمة. (ح) 10 دقيقة بعد microinjection مع Rac1، يتفاعل مع الخلية بتشكيل بارز من لاميليبوديا حول محيط الخلية بأكملها (المشار إليها بواسطة الأسهم الخضراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: فراب يسمح تحديد معدلات بروتين بلمرة الأكتين دوران أو لاميليبوديال- () ممثل المثال الخلية B16-F1 معربا عن اجفب-بسب قبل فوتوبليتشينج منطقة لاميليبوديال كما هو مبين. تتم تسمية معالم/الأشكال الملونة بطريقة مختلفة للإشارة إلى المناطق التي اعتبرت لقياس كثافة الأسفار على مر الزمن. علامة ملاحظة كفاف أحمر مع علامة تعجب، وتسميات منطقة سيتوسوليك المتمركزة في منطقة تحتوي على عدة حويصلات والكشكشة سطح الخلية. وينبغي تجنب المجالات الحيوية مثل هذا لتحديد مناطق مرجعية الأسفار، كما أنها تتسم بالتقلبات القصيرة الأجل قوية من الأسفار، يحتمل أن يسبب نتائج غير دقيقة. (ب) لاميليبوديال المنطقة من الخلية وإذ تعرب عن اجفب-بسب قبل وبعد فوتوبليتشينج. هو تصور استرداد إشارة الفلورسنت بعد فوتوبليتشينج داخل المنطقة بوضع علامة في الأرجواني مع مرور الوقت. يشير السهم إلى غيض من ميكروسبيكي، إثراء ل VASP المحتمل بسبب كثافة عالية من خيوط الأكتين مبلمرة هناك¹⁹. منحنى الاسترداد (ج) مثال فراب المستمدة من قياس كثافة لاميليبوديوم فوتوبليتشيد (كفاف الأرجواني) في ب الأحمر نيون وتبين خطوط خضراء على اليمين، على التوالي، الكسور غير متحركة ومتنقلة. (د) تناسب المنحنى فراب الانتعاش في ج (اللوحة اليمنى) ومثال لطريقة الحساب المستخدمة لاستخلاص استرداد نصف الوقت (اللوحة اليمنى). منحنى (ﻫ) مثال على انتعاش فراب المستمدة من متوسط منحنيات الانتعاش fluorescence الخلايا 15، مع أشرطة SEM تشير إلى درجة التغيرية ضمن السكان عينة. (و) منحنى تناسب المستمدة من متوسط يناسب المنحنى الانتعاش فراب الخلايا 15 (اللوحة اليمنى) ومثال لطريقة الحساب المستخدمة لاستخلاص استرداد نصف الوقت (اللوحة اليمنى). (ز) الوقت الفاصل بين أفرقة جاحظ لاميليبوديوم خلية B16-F1 معربا عن معلم اجفب β-أكتين قبل وبعد تبيض لمنطقة لاميليبوديال كما هو مبين، تليها الانتعاش fluorescence في لاميليبوديوم على مر الزمن. على لوحة اليمين المتطرف، قياس القيم لبروز ويتم توفير مسافات إلى الوراء (باللون البرتقالي والأحمر، على التوالي). حسابات تحت الألواح الصورة تكشف عن كيفية استخدام مجموع نتوء ومسافات إلى الوراء لاشتقاق معدل البلمرة شبكة أكتين لاميليبوديال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين لتتبع في جميع أنحاء الخلية مونومر. () بمثال على خلية B16-F1 معربا عن السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين قبل تحريك فوتواكتيفيشن في منطقة سيتوسوليك كما هو مبين بدائرة حمراء (السلطة الفلسطينية). تتم تسمية ملامح ملونة بشكل مختلف للإشارة إلى المناطق التي اعتبرت لقياس كثافة الأسفار على مر الزمن. (ب) مثال على التوزيع الزماني للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-أكتين يلي فوتواكتيفيشن. ملاحظة الخفض التدريجي للأسفار في فوتواكتيفاتيد، منطقة سيتوسوليك (دائرة حمراء)، كما ينشر أكتين فوتواكتيفاتيد بعيداً عن ذلك. بسبب انتشارها إلى الجبهة والجمعية في الشبكة، تتعزز مونومرات أكتين فوتواكتيفاتيد تدريجيا في لاميليبوديا (منطقة السماوي) وفي جميع أنحاء سيتوسول (مناطق مرمزة مختلفة) بطريقة تعتمد على مسافة والزمن. (ج) انخفاض الممثل، والزمانية من الأسفار داخل منطقة سيتوسوليك فوتواكتيفاتيد (كونتور أحمر في ب). (د) المؤقت التغييرات في شدة الأسفار في منطقة لاميليبوديال (كفاف السماوي في ب). (ﻫ) منحنيات تمثيلية للتغيرات الزمنية في كثافة الأسفار من مناطق سيتوسوليك (مرمزة في ب) نظراً لتحديد المواقع في مسافات متغيرة من منطقة فوتواكتيفيشن. ملاحظة كيف الهضبة مرة نصف التوصل إلى الأسفار (المشار إليها في وسيلة الإيضاح على اليمين) زيادة مع المسافة من نظراً للمنطقة إلى منطقة فوتواكتيفيشن، يرجح أن ربط مع زيادة الأوقات اللازمة لنشر مونومرات أكتين في المنطقة الخاصة بكل منها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هنا نناقش الخطوات الحاسمة في التقنيات الموضحة في هذه المقالة، وكيف يمكن أن يكون الأمثل للتطبيق في ظروف تجريبية مختلفة.

Microinjection هو طريقة التي يمكن تطبيقها على رصد الآثار الفورية من إدخال البروتينات الخارجية أو مثبطات أو المخدرات في الخلايا. يمكن أن تكون مفيدة خاصة لتحديد وظائف البروتينات في صعوبة ترانسفيكت أنواع الخلايا أو في حالات عندما ليس هو المطلوب التعبير الطويل الأجل. تجدر الإشارة إلى أن بقاء أنواع معينة من الخلايا يختلف اعتماداً على أنها هي تبذر في المصفوفة خارج الخلية. آخر بطانية أو الظهارية أو تنتجها الخلايا الليفية مثل أنواع الخلايا، حتى الصغيرة منها مثل السمك كيراتوسيتيس (انظر دانغ et al. يمكن حقن ²¹ وأندرسون و عبر²²) بنجاح. ومع ذلك، هناك استثناءات، مثل الخلايا B16-F1 المصنف في لامينين، التي تشكل نظاما نموذجا ممتازا للهجرة الخلية، ولكن غير متوافقة مع حقن على هذا النوع من التحتية لسبب غير معروف. للخلايا NIH3T3 تنتجها الخلايا الليفية، ونقوم بشكل روتيني حقن فيبرونيكتين التحتية، وتقنيات photomanipulation إضافية مثل اربط (حتى مع فوتواكتيفيشن؛ وهو مبين للخلايا B16-F1 هنا) يمكن أن يتم أيضا في هذه الخلايا الليفية (انظر على سبيل المثال، Köstler et al. ³)-فإنه يجب النظر أيضا في أن البروتينات المختلفة، وفقا لخصائصها الوظيفية وأهداف التجربة، قد يستغرق كميات مختلفة من الوقت لتتسبب في تغييرات، تتراوح بين ثوان إلى ساعات. ميزة هذا الأسلوب هو أن الجرعة/تركيز وكيل خارجية يمكن التحكم بأدق على مستوى الخلية الواحدة من مثلاً، عند استخدام تعداء بلازميد. وبالإضافة إلى ذلك، علامات مضيئة للبروتين لا ضرورة لضمان وجودها في الخلية، والتي يمكن أن تزيد من المرونة إذا كان مطلوباً المتزامنة التصور متعدد القنوات الأخرى البروتينات معلم فلوريسسينتلي. Microinjection يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لتحليل الآثار الفورية لبروتينات محددة أو مخاليط البروتين على التغيرات الدينامية مورفولوجيا الخلايا أو سيتوسكيليتون (مثلاً، دانغ et al. ²¹ على سبيل مثال من آثار فورية على الهجرة المانع المعقدة Arp2/3 أربين). عيب هذا الأسلوب هو في اختزاع، الذي يمكن أن يسبب تلف الخلايا أو التأثير على مورفولوجيا الخلايا. ولذلك، هو رصد أحد الاعتبارات هامة عند أداء ميكروينجيكشنز بقاء الخلية. يعتمد الأسلوب الذي قدم هنا على التلاعب اليدوي. في شروط اختبارها لتكون متوافقة مع حقن الناجحة، مثل الخلايا الليفية التي تنمو على فيبرونيكتين التحتية، يسمح بروتوكول الحقن اليدوي الموضحة هنا بمعدل نجاح 100 ٪ قريب؛ وهذا ضروري عند الجمع بين هذا النهج مع تجارب متابعة معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً، بما في ذلك الفحص المجهري الفيديو أو فراب، كما نشرت سابقا³. وهذا لا يستبعد أن أحياناً، وخلايا فردية قد يعانون من حدث microinjection، الذي يمكن التعرف عليه بأمان بالتغيرات المفاجئة لتباين كل من النواة والسيتوبلازم، متبوعاً بسحب حافة الخلية. استبعاد هذه الحالات التجريبية نادرة وبالتالي عدم النظر في مزيد من التحليلات.

بيد نهجاً نصف أوتوماتيكية أيضا يستخدم عادة، على سبيل المثال استخدام السريع (< 300 مللي) إبرة تسيطر آلة تخفيض تزامنت مع زيادة ضغط الحقن، حيث أن الإبرة فقط يجب أن توضع فوق كل خلية قبل كل منهما حقن. معدل نجاح حقن نصف أوتوماتيكية بتعريف أقل من دليل النهج المبين أعلاه، ببساطة لأنه الأمثل للسرعة، متبوعاً بتحليل العديد من الخلايا التي نجت بنجاح هذا العلاج؛ وهكذا فإنه لا تعتمد على حقن ناجحة من خلية مفردة. ولذلك، بدلاً من تحليل خلية مفردة، حقن نصف أوتوماتيكية أكثر ملاءمة لتحليل آثار حقن الخلايا مئات عدة، مثلاً، بالفيديو المجهري تكبير منخفضة أو عند تثبيت الخلية وتلطيخ. بغض النظر عن المتبع مفصلة، microinjection لا يشكل مقايسة نقطة نهاية، ولكن يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك فراب أو فوتواكتيفيشن³.

وعند تحديد معدل دوران البروتين من فراب، كثافة الليزر يجب أن يكون الأمثل، تبعاً لظروف الإعداد والتصوير بالمجهر (التكبير، الأهداف، إلخ، فضلا عن نوع الخلية والهيكل، والبروتينات الفلورية ل فوتوبليتشينج). لاحظ أن في طاقة الليزر الأمثل، تبيض فعالة هو جنبا إلى جنب مع د أقل قدر ممكن، لتجنب الانكماش أو إكمال سحب هيكل إطار التحليل (مثلاً، لاميليبوديا أو فيلوبوديا) أو الضرر حتى على المستوى الخلوي. ومن الناحية المثالية، ينبغي تحقيق 70 – 80 في المائة على الأقل من ابيضاض الكفاءة، على الرغم من أن التبييض كاملة قد تعوقها عن الدوران السريع للغاية من البروتين، في هذه الحالة، أي شيء أكثر من 50 في المائة قد أيضا يكون مقبولاً. ينبغي اختبار قوة تبيض الأمثل لهيكل معين وصبغة الفلورسنت تجريبيا، بدءاً بليزر منخفض طاقة متبوعاً زيادة تدريجية. وبطبيعة الحال، أي صبغة الفلورسنت يمكن بتعريف يكون مقصور بالليزر الخفيفة القريبة من ذروته الإثارة (488 نانومتر للأصباغ الخضراء المستخدمة بشكل متكرر مثل فيتك أو اجفب). ومع ذلك، أشعة الليزر مع أطوال موجية أقصر، مثل أشعة الليزر، والقرب من الأشعة فوق البنفسجية تسليم سلطات أعلى وبالتالي يمكن أن تستخدم أيضا للتبييض الفعال من الأصباغ المستخدمة عادة. أننا نستخدم بشكل روتيني 405 نانومتر ليزر صمام ثنائي (120 ميجاوات) للتبييض اجفب وصبغات الفلورسنت الأحمر (مثل مشري)، أن كان ذلك بكفاءة أقل بشكل طفيف في حالة الأخير (البيانات لا تظهر). كما يمكن أيضا استخدام nm 405-صمام ثنائي فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل (انظر أدناه)، فإنه يمنح هذا النظام بالمرونة القصوى.

وطبقت للهياكل الخلية B16-F1 والبروتينات الفلورية فوتوبليتشيد هنا، 405 نانومتر الليزر القوى بين 65 – 100 ميغاواط. عند تحليل منطقة فوتوبليتشيد، من المهم أن تنظر في ما إذا كان هيكل معين يتم الاحتفاظ في شكله الأصلي على التحليل الفترة الزمنية. على سبيل المثال، عند تحليل دوران بروتينات في نصائح لاميليبوديا، ينبغي الحرص ما إذا كان يتم تعديل انحناء لاميليبوديا بشكل ملحوظ على مر الزمن، كالتغيرات في انحناء قد تؤدي إلى نتائج غير دقيقة إذا حلل المنطقة/الكفاف لا كامل يشمل الهيكل في كل إطار المقاسة بأكملها. وبالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الحزم المضمنة في لاميليبوديا، مثل ميكروسبيكيس، قد تسبب الانحرافات في كثافة الأسفار. كما هو موضح في الشكل 2ب (السهم الأبيض في الإطار الزمني s 9)، بنية ميكروسبيكي تشبه يقع بجوار منطقة فوتوبليتشيد المقاسة، ولكن يبقى خارجها طوال فترة القياس، ومما لا يسبب أي عدم دقتها. لمزيد من التحليل لدوران البروتين، اعتبارات هامة عند اختيار الموقع والحجم لتحليل المناطق أن الأسفار مرور الوقت يجب لا إلى حد كبير يتأثر بالتغييرات في مورفولوجيا الخلايا أو عوامل أخرى من جد لتجنب اقتناء فوتوبليتشينج. على سبيل المثال، هياكل تقديم مساهمة كمية كبيرة في هيكل تحليل ينبغي أن لم نقل خارج المنطقة المقاسة أثناء التحليل؛ وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن لا أدخل الكيانات غير ذات صلة، ونيون مثل هياكل حويصلية التي تجتذب البروتين مجال الاهتمام أثناء التحليل. لتحديد معدل بلمرة الأكتين لاميليبوديال، ينبغي الحرص أن يتم تحليل لا التراجع أو الإزعاج (أي، صعودا للطي) لاميليبوديا، كما أن هذا سوف تؤثر بقوة على دقة النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، قد تظهر تراجع مناطق لاميليبوديال إزفاء الخلفي السريع، يمكن أن يفضي إلى المبالغة في تقدير معدلات بلمرة الأكتين لاميليبوديال. وهناك اعتبار آخر هو مسافة مناطق التطبيع داخل الخلايا (التي اتخذت كمواقع مرجعية لتصحيح فوتوبليتشينج اقتناء) من الوضع الفعلي فوتوبليتشينج، التي ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لتجنب المباشرة التأثير بمنطقة فوتوبليتشيد.

عند إعداد الشروط المثلى فوتواكتيفيشن من بنيات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم، ينبغي الحرص على تجنب تبيض فورية أثناء فوتواكتيفيشن. في عملنا، وتم الحصول على أفضل النتائج مع سلطات ليزر أقل من 5-10 مرات من العاملين لحسابهم عادة للتبييض من اجفب. للحصول على الصور من جزيئات فوتواكتيفاتيد، زمن التعرض للضوء والفاصل الزمني بين الإطارات ينبغي الأمثل بالنظر إلى حجم المناطق والهياكل لتكون فوتواكتيفاتيد وتحليلها، فضلا عن إمكانية تنقل فوتواكتيفاتيد البروتينات إلى مواقع أخرى سوبسيلولار. أما بالنسبة لجميع أنواع التصوير الأسفار، الحفاظ على بقاء الخلية أمرا حاسما للحصول على النتائج ذات الصلة فسيولوجيا.

من حيث المبدأ، يشكل فوتوكونفيرسيون الأخضر إلى الأحمر من البروتينات الفلورية مثل ميوس أو درونبا المتغيرات¹² طريقة قوية على قدم المساواة لديناميات التالية ودوران الهياكل سوبسيلولار مثل لاميليبوديوم (انظر على سبيل المثال، برنت et al. ²³)-الاستفادة من الأسلوب الأخير بدلاً من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل ستكون إمكانية متابعة الديناميات البروتين قبل وبعد التحويل مع اثنين من الألوان المميزة، دون الحاجة للتعبير عن المشاركة بروتين فلورسنت أحمر إضافية. بيد في تجاربنا الأولية، مدى تغيير التباين وشدة الفلورسنت إشارة تحقيقه عند فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل أكبر مقارنة بالمسابير فوتوكونفيرتيد، ربما كان بسبب السمات الطيفية متفوقة الأخضر مقابل الأحمر الفلورسنت المسابر (البيانات لا تظهر). على أي حال، دراسات مفصلة عن دوران خيوط الأكتين في نتوءات الحافة الخلية مثل لاميليبوديا أو ذيول أكتين الناجمة عن فيروس اللقاحية حتى الآن فقط تم نشر استخدام السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء مشتقات^5،،من⁶²⁴.

عند النظر في أي منطقة الخلية لتحليل أثر فوتواكتيفيشن، عدة عوامل يجب أن تؤخذ في الاعتبار، التي تناقش باستخدام مثال محدد هو موضح هنا (دمج مونومرات أكتين على حافة الخلية عند التنشيط في سيتوسول)، ولكن ويمكن استقراء التأكيد لمختلف المشاكل العلمية المماثلة. أولاً، عند قياس معدل إدماج لاميليبوديال سيتوسوليكالي فوتواكتيفاتيد البروتينات، على سبيل المثال، في ظروف تجريبية متميزة (كما هو موضح في ديمتشيف et al. ⁶)، ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة بين المجموعات التجريبية أحجام المناطق سيتوسوليك وعلى مسافات لحواف لاميليبوديال. من المهم أيضا النظر في ذلك عند مناطق سيتوسوليك فوتواكتيفاتينج، سمك الخلية أكبر في مواقف أقرب إلى النواة. قد ينتج عن تنشيط المناطق الخلوية سمكا كميات أعلى من البروتينات المنشط، نظراً لأن توزيع البروتين تنشيط المتجانس وتوزع في سيتوسول. وأخيراً، مستويات التعبير من البروتين لتفعيلها يمكن بالتأكيد اختلافاً كبيرا في الخلايا الفردية. نظراً لكل هذه الاعتبارات للتغير، من الأهمية بمكان لمقارنة مستويات التأسيس سيتوسوليكالي المنشط البروتينات في الخلية بالنسبة للأسفار الإجمالية التي تم الحصول عليها عند التنشيط في مناطق محددة في أماكن أخرى.

لقد قمنا بوصف كيف يمكن استخدامها كأداة للتحقيق في آثار البروتينات في الخلية مورفولوجيا microinjection وقد تجسد هذا بإظهار التعريفي قوية من هياكل لاميليبوديال في NIH3T3 ميكروينجيكتيد الخلايا تنتجها الخلايا الليفية مع GTPase Rac1 الصغيرة. نحن سابقا تطبيق هذا الأسلوب تتداخل مع الدالة Arp2/3 في الخلايا ميكروينجيكتيد مع المجال تضاعفت ج--المحطة الطرفية من الندبة/الموجه³. يمكن تحليل معلمات مختلفة في الخلايا ميكروينجيكتيد بفحوصات أخرى، مثل فراب أو فوتواكتيفيشن. لقد قمنا بوصف كيف يمكن أن تستخدم للتحقيق في ديناميات سوبسيلولار والتنقل من مونومرات أكتين فراب وفوتواكتيفيشن. فراب قد استخدمت مجموعتنا⁵ سابقا للتحقيق في الدوران من البروتينات إضفاء الطابع المحلي على لاميليبوديا، مثل بسب، وأبي، كورتاكتين، كوفيلين، ووضع حد أقصى للبروتين، أو لتوضيح دوران مكونات في الالتصاقات المحورية في الوجود ونظرا لغياب راك الإشارات⁴. وعلاوة على ذلك، يمكن إنجاز قياس معدلات بلمرة الأكتين فوتوبليتشينج معلم اجفب β-أكتين⁵، ولكن توجد طرق بديلة. كما يمكن تتبع إينهوموجينيتيس نيون كما يراها المسابير المتوافقة مع تصوير الخلية الحية وسم خيوط أكتين الخلوية، مثل ليفيكت²⁵، العاملين^6،في الفترة من²⁶. الميزة هنا أنه يمكن تجنب overexpression من β-أكتين، التي قادرة على زيادة بروز حافة الخلية والهجرة، ومما يحتمل أن يتداخل مع المقايسة محددة أو مسألة تجريبية (انظر مثلاً كاجيه et al. ²⁶؛ بيكهام et al. ²⁷). بيد أن وضع غير مؤات متميزة للتحقيق ليفيكت تشكل السريع تشغيل/إيقاف حركية من ربط خيوط الأكتين، حيث أن تبيض هياكل خيوط أكتين المسمى من قبل ليفيكت في الخلايا يوفر معلومات فقط حول دوران التحقيق، لكن عدم دوران خيوط الأكتين، الذي كان يربط²⁵. تتبع إينهوموجينيتيس fluorescence المستخدمة سابقا^6،26 تقدم حلاً وسطا عمليا، أدرجت في الخيطية cytoskeletal مشابهة كثيرا للتتبع المستخدمة على نطاق واسع لتلامس الأسفار هياكل (انظر مثلاً، سمك السلمون، والملاح²⁸)، ولكن قد لا تكون دقيقة قدر فراب الهياكل اجفب معلم واكتين وكما مستقيم إلى الأمام لاستخدام. وقد طبق فوتواكتيفيشن لنا لتقدير معدلات إدماج أكتين موحودي جاحظ لاميليبوديا، فضلا عن التنقل في جميع أنحاء سيتوسول، في سياق ضبطها تجريبيا سيتوسوليك أكتين و مستويات⁶. الأسلوب مفيد عند دراسة الحركة وتوزيع البروتينات المستمدة من مناطق كبيرة نسبيا، مثل مناطق سيتوسوليك. ومع ذلك، دراسة توزيع البروتينات المستمدة من هياكل فوتواكتيفاتيد صغيرة نسبيا؛ قد يكون مثلاً النمو الأقماع صعبة نظراً لانخفاض عدد جزيئات الفلورسنت المنشط، وإشارات ضعيفة، وهكذا الافتقار إلى الحساسية. وقد تشمل تقنيات بديلة محتملة إلى فوتواكتيفيشن أو فوتوكونفيرسيون للأسفار (انظر أعلاه) معكوس فراب، الذي يعتمد على فوتوبليتشينج الخلية بأكملها باستثناء العائد على الاستثمار، متبوعاً بتتبع حركة الجزيئات الفلورسنت بعيداً عن هذه المنطقة. هذه التقنية لا تتطلب overexpressing الإصدارات فوتواكتيفاتابل من البروتينات، ولكن سوف تنطوي دائماً على التعرض لجرعة عالية على نحو غير عادي من طاقة الليزر، يحتمل أن تسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل د.

ومن الواضح أن فوتواكتيفيشن وفراب لا يميز إذا كانت البروتينات تتحرك مونومرات، dimers، أو ليغومرات حتى الصغيرة، وعما إذا كانت تتحرك في تركيبة مع الشركاء ملزمة إضافية. يمكن الحصول على معلومات من هذا النوع بدلاً من ذلك من الأسفار ارتباط مطيافية تقنيات²⁹ ، أو بدلاً من ذلك، بكى فليم³⁰. ومع ذلك، فراب وفوتواكتيفيشن تشكل النهج واضحة لتقييم ديناميات البروتين المحلية والعالمية في الخلايا، بغض النظر عن البروتين الفائدة، موقع سوبسيلولار، أو نوع الخلية درس مباشرة.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
خلايا الورم الميلانيني في جلد الفأر B16-F1	مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي ، ماناساس ، VA	CRL-6323
NIH-3T3 خلايا	مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ، ماناساس ، VA	CRL-1658
DMEM 4.5 جم / لتر جلوكوز   ؛	تقنيات الحياة ، ثيرمنو فيشر العلمية ، ألمانيا	41965-039
هام s F-12 متوسط	Sigma-Aldrich	N8641
مصل عجل الجنين  (FCS)	مختبرات PAA ، لينز ، النمسا	A15-102
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	سيجما ألدريتش ، ألمانيا	F7524	Lot054M3396
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية   ؛	Gibco ، ThermoFisher Scientific ، ألمانيا	11140035
L-Glumatine 200mM (100x)	Life Technolgies	25030-024
Pen-Strep 5000 U / mL	تقنيات الحياة	15070063
بيروفات الصوديوم (100 ملم)	جيبكو ، ثيرموفيشر العلمي ، ألمانيا	11360-039
Laminin	Sigma-Aldrich	L-2020
Laminin طلاء العازلة			عصامي: 50 ملي متر تريس ph7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم
فيبرونكتين من البلازما البشرية   ؛	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11 051 407 001
Jetpei	Polyplus Transfection, Illkirch, France	101-10N
JetPei buffer	Polyplus Transfection, Illkirch, France	702-50	150mM NaCl
PA-GFP-actin البلازميد DNA			الموصوف في Koestler et al.2008
pEGFP-actin البلازميد DNA	Clontech ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
بروتين Rac1 للحقن			المجهري منقى كإصدار موسوم بضريبة السلع والخدمات ، ومقطوعة من ضريبة السلع والخدمات قبل الحقن
المجهري عازلة			ذاتية الصنع: 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي مولار Tris-HCl ph7.5 ، 5 ملي مولار MgCl 2< / sub> ، 1 ملي مولار DTT
ديكستران ، تكساس الأحمر ، 70،000 ميجاوات ،	مجسات جزيئية قابلة للإصلاح ليسين ، ثيرمنو فيشر العلمية ، ألمانيا	D1864
غطاء دائري مجهر 15 مم ، رقم 1 & nbsp ؛	Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany	1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Caspiry Tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	930000035
شحم السيليكون	ACC سيليكون ، بريدجووتر ، إنجلترا	SGM494
الألومنيوم المفتوح حمام حمام غرفة التصوير	Warner instruments	RC-26
جهاز التحكم في درجة الحرارة الأوتوماتيكي	Warner Instruments	TC-324B
المجهر: Axio Observer   ؛	كارل زايس, جينا, ألمانيا
كاميرا CoolSnap-HQ2	القياسات الضوئية ، توكسون ، AZ
Lambda DG4 مصدر الضوء	Sutter Instrucment, Novato, CA
مصدر الليزر			Visitron
Eppendorf FemtoJet microinjector	Eppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا		مع ضاغط مدمج لإمداد الضغط
نيكون Narishige نظام Micromanipulator	نيكون الأدوات ، اليابان
Visiview البرمجيات v2.1.4	Visitron Systems ، Puchheim ، ألمانيا
Metamorph Software v7.8.10	الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA
Sigma Plot v.12	Systat Software Inc.