Method Article

النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

DOI:

10.3791/57651

⸱

June 13th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الخلايا المناعية جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الكولاجين (3D) ثلاثي الأبعاد باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. ويفصل هذا البروتوكول أيضا كيفية تعقب الهجرة الخلية في 3D. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في فيفووالتنشيط وانتشار ووظيفة كل الخلايا المناعية تحدث في بيئة (3D) ثلاثي الأبعاد، على سبيل المثال في الغدد الليمفاوية أو الأنسجة. حتى الآن، تعتمد معظم أنظمة في المختبر على ثنائي الأبعاد (2D) السطوح، مثل لوحات زراعة الخلايا أو كوفيرسليبس. لتقليد أمثل الظروف الفسيولوجية في المختبر، فنحن نستخدم مصفوفة الكولاجين 3D بسيطة. الكولاجين هو أحد المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وقد استخدمت على نطاق واسع لتشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. لتصوير ثلاثي الأبعاد، ظهرت التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) مع اكتساب عالية السرعة وعمق اختراق كبير وتبيض منخفضة وفوتوسيتوتوكسيسيتي. وعلاوة على ذلك، ورقة الخفيفة الميكروسكوب مفيد خاصة لقياس المدى الطويل. هنا يصف لنا بروتوكولا أمثل كيفية إعداد والتعامل مع الخلايا المناعية البشرية، مثل الابتدائي البشرية السامة للخلايا T لمفاوية (CTL) وخلايا القاتل الطبيعي (ناغورني كاراباخ) في المصفوفة الكولاجين 3D للاستخدام مع ورقة الضوء مجهرية لتصوير الخلايا الحية و نماذج ثابتة. وترد الإجراءات المتعلقة بالحصول على الصور وتحليل الهجرة الخلية. ويرد تركيز بصفة خاصة لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة وعوامل لإعداد العينات وتحليل البيانات. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة الكولاجين ثلاثي الأبعاد، ولا يقتصر على الخلايا المناعية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معظم المعارف حول ترحيل الخلايا يأتي من تجارب 2D1،2،3، التي تجري عادة في الزجاج أو سطح البلاستيك الثقافة/التصوير الطبق. ومع ذلك، يتطلب سيناريو فسيولوجية، في معظم الحالات، المكروية 3D، الذي المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دوراً حاسما. إدارة المحتوى في المؤسسة ليس فقط يوفر هيكل ثلاثي الأبعاد الأساسية للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا السليمة ولكن يقدم أيضا إشارات البقاء على قيد الحياة أو إشارات الاتجاه الأداء الأمثل للعديد من الخلايا4،5 . ولذلك، مطلوب بيئة ثلاثية الأبعاد تحديد أفضل الوظائف الخلوية والسلوك في بيئة أفضل مما يع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البحوث التي أجريت لهذه الدراسة مع المواد البشرية (الكريات البيض دوائر نظام الحد من المتبرعين بالدم البشري) وقد أذنت لجنة الأخلاقيات المحلية (إعلان من 16.4.2015 (84/15؛ الأستاذ الدكتور رتيغ-Stürmer)) وفيما يلي المبادئ التوجيهية المناظرة.

1-إعداد حل معادلتها الكولاجين (500 ميليلتر)

  1. نقل 400 ميليلتر الكولاجين المبردة حل الأسهم (10.4 ملغم/مل) إلى أنبوب معقم 1.5 مل تحت غطاء الثقافة الخلية. ببطء بإضافة 50 ميليلتر من المبرد 10 x PBS (pH 7.0-7.3) إلى 400 ميليلتر من حل الأسهم الكولاجين المبردة. مزيج الحل قبل التبليط الأنبوب بلطف.
    ملاحظة: جميع الخطوات في الجزء 1، وينبغي أن يتم تحت غطاء ثقافة خلية.
  2. إضافة 8 ميليلتر من 0.1 M هيدروك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكيل نتوء أثناء الهجرة الخلية T هو عملية ديناميكية للغاية، واكتين تعتمد. تصور تشكيل نتوء CTL البشرية الأساسية، ونحن transfected عابر بروتين ميجفب تنصهر بتسمية cytoskeleton أكتين في CTL كما هو موضح قبل11. تعداء، بعد يوم واحد من الخلايا تم تضمينها في مصفوفة الكولاجين. رصات الصور اقتنيت كل 40 s مع خطوة-حجم 1 ميكرومتر في 37 درجة مئوية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. كما هو مبين في الشكل 2 ألف و التكميلية الفيلم 1، أثناء .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنفذ معظم فحوصات في المختبر على سطح ثنائي الأبعاد، على سبيل المثال في خلية ثقافة لوحات، أطباق بتري، أو في كوفيرسليبس، بينما في فيفو الخلايا، لا سيما الخلايا المناعية، تجربة معظمه المكروية 3D. ظهور أدلة تبين أن أنماط الهجرة من الخلايا المناعية تختلف بين 2D و 3D سيناريوهات17. وعلاوة على ذلك، كما تختلف ملامح التعبير للخلايا السرطانية في 2D و 3D استزراع الأنسجة18،،من1920. ولذلك، لمحاكاة أفضل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن عدم تضارب المصالح المالية أو التجارية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر معهد "هيموستاسيولوجي السريرية" والطب نقل الدم لتقديم التبرع بالدم؛ كارمن Hässig وكورا خوجا للحصول على مساعدة تقنية ممتازة. ونحن نشكر ينس رتيغ (جامعة سارلاند) لناقل بماكس المعدلة، رولاند ويدليتش-المرتزقة (جامعة موينستر) لبناء ليفيكت-روبي الأصلي، وكريستيان يونكر (جامعة سارلاند) لتوليد بنية ليفيكت-ميجفب. مولت هذا المشروع سونديرفورشونجسبيريتش 1027 (المشروع A2 إلى B.Q.) و 894 (المشروع A1 إلى M.H.). مجهر الضوء-ورقة كانت تمولها DFG (GZ: فوغ أنست 256/4 19-1).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol ، محلول كولاجين بقريAdvanced Biomatrix  # 5133-20MLمصفوفة كولاجين
0.5 م NaOH SolutionMerck1091381000لتحييد محلول Fibricol
ذوبان منخفض للغايةAffymetrix32821-10GMتحضير العينة في مجموعة
خلايا CD8 التائية البشرية التي لم تمسها DynabeadsThermo Fisher11348Dعزل الخلايا التائية البشرية الأولية CD8 + < / sup> من PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 لتوسيع الخلايا التائية وتنشيطهاThermo Fisher11132Dتنشيط مجموعات CTL PHC0023
الإنترلوكين البشري المؤتلفThermo FisherCTL P3 المزروعة
LonzaV4XP-30XXTransfection
&alpha ؛ -PFN1 الجسم المضاد ، الأرنب ، IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask غشاء البلازما البرتقالي وصمة عارThermo FisherC10045تسمية الخلية الفلورية
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's phopsphate المحلول الملحيThermo Fisher14190250IF
مصل الأبقار الألبومينSigmaA9418-100GIF
Goat & alpha ؛ أرنب 568 ، IgG ، أرنبThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (مجهر للصفائح الخفيفة)ZeissNA
غطاء مزرعة الخليةThermo FisherHeraSafe KS
حاضنة ثقافة الخلية HERACell 150i ثيرمو فيشرإن إيه
جهاز الطرد المركزي 5418 و 5452EppendorfNA
PippettesEppendorf3123000039 ، 3123000020 ، 3123000063
نصائح الماصةVWR89079-444 ، 89079-436 ، 89079-452   ؛
أنابيب 15 ملSarstedt  62.554.002
الشعيرات الدموية 50 وميكرو ؛ LVWR (العلامة التجارية)613-3373Zeiss LSFM لإعداد
المكبس للشعيرات الدمويةVWR (العلامة التجارية)BRND701934"طوابع بطرف تفلون" تحضير عينة LSFM
MColorPhast pHMerc1095430001لاختبار درجة الحموضة من محاقن Fibricol
BD Plastipak 1 ملBDZ230723  ؛ ALDRICHتحضير عينة بديلة
طين النمذجة (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohNA.
Imaris file converterBitplaneمتاح على http://www.bitplane.com تحويل ملفات التصوير إلى تنسيق ملف Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro ، Track ، Vantage)Bitplaneمتاح على http://www.bitplane.com تحليل بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد ورباعي الأبعاد
تحفيز مجموعة الحل الأولي العينة نصائح k

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light sheet Microscopy3D Collagen MatrixHuman Immune CellsCell Migration TrackingSample PreparationImage AcquisitionLive Cell ImagingFixed Sample AnalysisCytotoxic T LymphocytesNatural Killer Cells

Related Articles