يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

7.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57651

⸱

يونيو 13, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الخلايا المناعية جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الكولاجين (3D) ثلاثي الأبعاد باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. ويفصل هذا البروتوكول أيضا كيفية تعقب الهجرة الخلية في 3D. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.

الملخص

في فيفووالتنشيط وانتشار ووظيفة كل الخلايا المناعية تحدث في بيئة (3D) ثلاثي الأبعاد، على سبيل المثال في الغدد الليمفاوية أو الأنسجة. حتى الآن، تعتمد معظم أنظمة في المختبر على ثنائي الأبعاد (2D) السطوح، مثل لوحات زراعة الخلايا أو كوفيرسليبس. لتقليد أمثل الظروف الفسيولوجية في المختبر، فنحن نستخدم مصفوفة الكولاجين 3D بسيطة. الكولاجين هو أحد المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وقد استخدمت على نطاق واسع لتشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. لتصوير ثلاثي الأبعاد، ظهرت التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) مع اكتساب عالية السرعة وعمق اختراق كبير وتبيض منخفضة وفوتوسيتوتوكسيسيتي. وعلاوة على ذلك، ورقة الخفيفة الميكروسكوب مفيد خاصة لقياس المدى الطويل. هنا يصف لنا بروتوكولا أمثل كيفية إعداد والتعامل مع الخلايا المناعية البشرية، مثل الابتدائي البشرية السامة للخلايا T لمفاوية (CTL) وخلايا القاتل الطبيعي (ناغورني كاراباخ) في المصفوفة الكولاجين 3D للاستخدام مع ورقة الضوء مجهرية لتصوير الخلايا الحية و نماذج ثابتة. وترد الإجراءات المتعلقة بالحصول على الصور وتحليل الهجرة الخلية. ويرد تركيز بصفة خاصة لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة وعوامل لإعداد العينات وتحليل البيانات. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة الكولاجين ثلاثي الأبعاد، ولا يقتصر على الخلايا المناعية.

المقدمة

معظم المعارف حول ترحيل الخلايا يأتي من تجارب 2D1،2،3، التي تجري عادة في الزجاج أو سطح البلاستيك الثقافة/التصوير الطبق. ومع ذلك، يتطلب سيناريو فسيولوجية، في معظم الحالات، المكروية 3D، الذي المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دوراً حاسما. إدارة المحتوى في المؤسسة ليس فقط يوفر هيكل ثلاثي الأبعاد الأساسية للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا السليمة ولكن يقدم أيضا إشارات البقاء على قيد الحياة أو إشارات الاتجاه الأداء الأمثل للعديد من الخلايا4،5 . ولذلك، مطلوب بيئة ثلاثية الأبعاد تحديد أفضل الوظائف الخلوية والسلوك في بيئة أفضل مما يعكس السياق الفسيولوجية.

في الجسم البشري، ومعظم الخلايا خاصة الخلايا المناعية، ممارسة وظائفهم بموجب سيناريو 3D. على سبيل المثال، تنشيط خلايا تي دوريات الأنسجة البحث عن الخلايا الهدف، وترحيل السذاجة تي الخلايا عن طريق الغدد الليمفاوية في البحث عن خلاياها المشابهة مستضد-عرض خلالها وضع الهجرة والآلات يتم تكييفها للمقابلة خارج الخلية البيئة3،،من67. جل الكولاجين 3D قد استخدمت على نطاق واسع كخلية 3D راسخة وجيدة تتسم ثقافة نظام8،9،10. أعمالنا السابقة يظهر أن الخلايا الليمفاوية البشرية الأولية كثيري التنقل والهجرة بسرعة متوسط من حوالي 4.8 ميكرومتر/دقيقة في مصفوفة المستندة إلى الكولاجين 0.25%11. إعادة ترتيب cytoskeleton دوراً رئيسيا في هجرة الخلية12. تتراكم الأدلة تبين أن الخلايا الليمفاوية لا تنطبق إلا في وضع واحد للهجرة حتى الآن يمكنك التبديل بين سلوك معين الهجرة اعتماداً الموقع، المكروية، السيتوكينات، والتدرجات chemotactic، وخارج الخلية الإشارات التي تصل قيمتها المهاجرة من السلوك في طرق مختلفة 3.

لتحليل موثوق وظائف الخلايا المناعية والسلوك، على سبيل المثال، الهجرة، وتشكيل نتوء أو النقل حويصلية، أنها ميزة كبيرة لتكون قادرة على الحصول على الصور بأحجام كبيرة نسبيا 3D بطريقة سريعة وموثوق بها. ويوفر التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) لتصوير ثلاثي الأبعاد،13،حل مرض14. أثناء التصوير اقتناء، يتم إنشاء ورقة خفيفة ثابتة رقيقة لإلقاء الضوء على العينة. وبهذه الطريقة، على متن الطائرة التركيز، يمكن مضيئة مساحة كبيرة في وقت واحد دون التأثير على الخلايا خارج الطائرة. تمكن هذه الميزة بسرعة اقتناء عالية مع انخفاض شديد تبيض وفوتوسيتوتوكسيسيتي. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تصور الخلايا المناعية البشرية الأولية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري وكيفية تحليل الهجرة في سيناريو 3D.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

البحوث التي أجريت لهذه الدراسة مع المواد البشرية (الكريات البيض دوائر نظام الحد من المتبرعين بالدم البشري) وقد أذنت لجنة الأخلاقيات المحلية (إعلان من 16.4.2015 (84/15؛ الأستاذ الدكتور رتيغ-Stürmer)) وفيما يلي المبادئ التوجيهية المناظرة.

1-إعداد حل معادلتها الكولاجين (500 ميليلتر)

  1. نقل 400 ميليلتر الكولاجين المبردة حل الأسهم (10.4 ملغم/مل) إلى أنبوب معقم 1.5 مل تحت غطاء الثقافة الخلية. ببطء بإضافة 50 ميليلتر من المبرد 10 x PBS (pH 7.0-7.3) إلى 400 ميليلتر من حل الأسهم الكولاجين المبردة. مزيج الحل قبل التبليط الأنبوب بلطف.
    ملاحظة: جميع الخطوات في الجزء 1، وينبغي أن يتم تحت غطاء ثقافة خلية.
  2. إضافة 8 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم في 500 ميليلتر من الحل الكولاجين من 1.1. لضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.6. استخدام شرائط اختبار درجة الحموضة (الأس الهيدروجيني النطاق: 6-10) لتحديد قيمة pH الخليط.
    ملاحظة: قد تختلف أحجام لمجموعات مختلفة من الكولاجين. وقد حل هيدروكسيد الصوديوم لتكون مختلطة ببطء لتجنب فقاعات الهواء. ينبغي أن يوضع هذا الخليط على الجليد لتجنب جيليشن الكولاجين.
  3. إضافة 2 ميليلتر من ddH العقيمة2س جعل وحدة التخزين النهائي إلى 500 ميليلتر. مزيج جيد وتخزين هذا الحل الكولاجين (8.32 مغ/مل) على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: تحت هذا الشرط، الكولاجين معادلتها يمكن استخدامها ل 24 h. لا ينصح مختبرين لتجنب فقاعات الهواء.

2-نموذج إعداد Fluorescence الضوء-ورقة الفحص المجهري باستخدام الشعيرات الدموية

  1. فلوريسسينتلي تسمية الخلايا الحية من اهتمام بالأصباغ الفلورية الأساسي المطلوب15 أو بروتينات الفلورسنت11 كما هو موضح سابقا.
  2. نقل 1 × 106 خلايا في أنبوب معقم 1.5 مل تحت غطاء ثقافة خلية. الطرد المركزي الأنبوب في ز 200 x للدقيقة 8 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من مستنبت.
    ملاحظة: يوصي بكثافة الخلية 5 × 106 خلايا/مل للتصور للهجرة الخلية المناعية البشرية، خاصة بالنسبة اللمفاويات T السامة للخلايا (CTL) والخلايا القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ).
  3. إضافة ميليلتر 85.9 الحل الكولاجين معادلتها من 1.3. في تعليق خلية من 2.2. والمزيج بشكل صحيح للوصول إلى تركيز الكولاجين من 2.5 ملغ/مل. اترك هذا المزيج خلية/الكولاجين على الجليد في غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: لنفترض أن المطلوب تركيز الكولاجين ن مغ/مل، تحييد الحجم محلول الكولاجين (لتعليق خلية ميليلتر 200) = 200 × ن/(8.32-N)
  4. المقبل، وضع المكبس مطابقة شعري (القطر الداخلي ~ 1 مم) حتى 1 مم من شعري المكبس. ويت المكبس بغمس في الثقافة المتوسطة (الشكل 1A).
    ملاحظة: يمكن أن تساعد هذه الخطوة منع فقاعات الهواء عندما يتم انخفض شعري في مزيج خلية/الكولاجين. لم يكن لديك الشعرية والمكبس أن تكون عقيمة.
  5. وتراجع شعري في مزيج خلية/الكولاجين من 2.3. ببطء سحب المكبس مرة أخرى عن 10-20 ملم (الشكل 1B). مسح الجدار الخارجي لشعري بمنشفة ورقية مبلل برذاذ الإيثانول 70% لإزالة الحل الكولاجين المتبقية.
  6. جبل شعري مع نمذجة الطين على الجدار الداخلي لأنبوب 5 مل ودفع هذا المزيج خلية/الكولاجين إلى حافة الشعرية (الشكل 1).
  7. الحفاظ شعري في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 1 للكولاجين البلمرة.
  8. إضافة الثقافة المتوسطة (حوالي 1-2 مل) إلى أنبوب 5 مل. اضغط قضيب الكولاجين مبلمرة بها بعناية في المتوسط إلى حوالي 3/4 الكولاجين شنقاً في الأجل المتوسط (الشكل 1).
  9. تبقى الشعرية، مثل هذه، على 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لآخر 30 دقيقة حجته على قضيب الكولاجين مع المتوسط.
    ملاحظة: بعد ذلك، رود الكولاجين يمكن سحب مرة أخرى إلى الشعرية ومثقف آخر قبل استخدامها مرة أخرى.

3-صورة اقتناء استخدام الضوء-ورقة الفحص المجهري

  1. الجمعية قاعة العينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتشغيل في الحضانة والمجهر لتسخين غرفة العينة إلى 37 درجة مئوية (بالنسبة للخلية الحية التصوير فقط).
  3. شعري في قاعة عينة وتحديد موقع عينة لإيجاد مجال الاهتمام للحصول على الصور.
  4. تنشيط laser(s) المقابلة. تعيين الإعدادات التالية: ليزر للسلطة، وزمن التعرض للضوء، خطوة-حجم المكدس z، وبداية ونهاية الموقف z-المكدس، والفاصل الزمني لتصوير الخلايا الحية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، العينة في الشكل 2 تم تصويرها كل 40 ثانية ح 6 في 37 درجة مئوية مع خطوة-حجم 1 ميكرومتر (مجموع سمك: ميكرومتر 538). وكان قوة الليزر 1% مع وقت تعرض للسيدة 30 حجم بكسل في اتجاه x-y ميكرومتر 0.23.
  5. ابدأ الحصول على الصور.

4-تتبع التحليل الآلي

  1. فتح الملف المحول، انقر فوق إضافة ملفات اختيار ملفات التصوير ليتم تحويلها إلى تنسيق ملف برنامج (*.ims). انقر فوق استعراض ، وحدد مجلد الذي تريد حفظ الملفات المحولة. انقر فوق بدء تشغيل كافة.
  2. فتح برنامج التحليل. انقر فوق تجاوز. انتقل إلى الملف وانقر فوق فتح، ثم اختر ملف التصوير يتم تحليلها.
    ملاحظة: إذا كان حجم الملف كبير هذه الخطوة قد يستغرق الوقت. ملفات أكبر من 1 تيرابايت (TB) لا ينصح لتجربة واحدة كالعملية مثل هذه الملفات الكبيرة هي القدرة الحسابية عاليا مطالبين.
  3. انقر فوق إضافة مواقع جديدة. تحقق من مربع العملية كامل الصورة أخيرا. انقر فوق التالي.
  4. أدخل إحداثيات x و y (بكسل) لتعريف منطقة الاهتمام. أدخل عدد الإطارات (الوقت والموقف z) لتحليل. انقر فوق التالي.
  5. قم بتحديد القناة المستهدفة، التي تحتوي على كائنات لتعقب، في القائمة المنسدلة قناة المصدر. أدخل المقدرة xy القطر (ميكرومتر). انقر فوق التالي.
    ملاحظة: xy يقدر قطرها هو قطر متوسط في البعد س ص للكائنات لتعقب.
  6. انقر فوق جودة. ولقد حددت عتبة، معظم الخلايا (كائنات) التي ينبغي أن تدرج. انقر فوق التالي.
  7. اختيار خوارزمية المطلوبالحركة أوتوريجريسيفي (مستحسن). أدخل المسافة كحد أقصى20 ميكرومتر (مستحسن)، وحجم الفجوة ماكس (3 أو 2 هو مستحسن). انقر فوق الصورة كامل عملية أخيرا.
    ملاحظة: المسافة ماكس و الحد الأقصى لحجم الفجوة عتبات اثنين للخروج من المسارات. وبشكل أكثر تحديداً، في إطارين المستمر عندما يتجاوز المسافة بين نفس الكائن مسافة ماكس، هذا الكائن في الإطار لاحقاً سينظر ككائن جديد. في بعض الأحيان من خلال اقتناء، قد تختفي إطارات قليلة نفس الكائن وتظهر مرة أخرى. في هذه الحالة، إلا عندما يظهر هذا الكائن داخل الحد الأقصى لحجم الفجوة، سيتم اعتبار نفس الكائن.
  8. انقر فوق نوع عامل التصفية واختر خيار استبعاد المسارات غير مرغوب فيها.
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.
  9. انقر فوق التالي ومن ثم انقر فوق إنهاء.
    ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يستغرق ساعات حتى أيام اعتماداً على أداء الكمبيوتر.
  10. انقر فوق تحرير المسارات واختر الانجراف الصحيح. حدد الخوارزمية المناسبةالانجراف متعدية الجنسيات (مستحسن). حدد المطلوب نتيجة Dataset الحجم (الحجم الجديد مساوياً "الحجم الحالي" مستحسن). انقر فوق "موافق".
    ملاحظة: هذه الخطوة فقط المطلوبة عند الكولاجين جنحت أثناء الحصول على الصور.
  11. انقر فوق إحصائيات واختر قائمة قيم إحصاءات تظهر تكوين. تحقق من خيارات المصلحة أن يكون تصدير (مثلاً إحداثيات والسرعة وهلم جرا). انقر فوق "موافق".
  12. انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى الملف وقم بإدخال اسم ملف.

5-التثبيت والفلوره تلطيخ الخلايا في مصفوفات الكولاجين

  1. نقل 1,000 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% (منهاج العمل، في برنامج تلفزيوني) في أنبوب 5 مل تحت غطاء كيميائية.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون متوازنا منهاج عمل بيجين إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. تراجع شعري مع الكولاجين مبلمرة من 2.9. إلى حل منهاج العمل (ل ~ 5 مم) وجبل شعري على الجدار الداخلي للأنبوبة 5 مل مع نمذجة الطين (كما هو موضح في الشكل 1).
  3. اضغط المكبس بلطف حتى نصف قضيب الكولاجين هو معلق في حل منهاج العمل (الشكل 1). إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  4. سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. إخراج الشعرية وتجاهل منهاج عمل بيجين.
  5. جبل شعري في أنبوب جديد وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. تأكد من أن الشعرية هي مغمورة في برنامج تلفزيوني.
  6. اضغط المكبس بلطف حتى نصف قضيب الكولاجين هو معلق في الحل. جبل شعري على الجدار الداخلي مع نمذجة الطين.
  7. إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  8. كرر 5.4. -5.7 لآخر 2 مرات.
  9. سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. تجاهل برنامج تلفزيوني. نقل 1-2 مل من حجب permeabilization المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 1-% 0.1% الفاعل غير الأيونية) في الأنبوب وكرر 5.6.
    ملاحظة: يمكن استبدال جيش صرب البوسنة (1%) بالمصل 5% الحيوان Ab الثانوي قد أثيرت في.
  10. إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
  11. سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. تجاهل المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن. نقل 200-500 ميليلتر من جسم الأولية في المخزن المؤقت لمنع بيرميبيليزيشن ويطرد القضيب في الحل.
  12. إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة ح 1.
  13. أغسل رود الكولاجين 3 مرات مع ببست (برنامج تلفزيوني + الفاعل غير الأيونية نسبته 0.1 في المائة) كما هو موضح في 5-4. -5.8.
  14. احتضان القضيب في جسم الثانوية في حجب permeabilization المخزن المؤقت لح 1 في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ عليه من الضوء.
  15. أغسل رود الكولاجين 3 مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في 5-4. -5.8.
  16. سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. الاحتفاظ العينات في برنامج تلفزيوني حتى التصوير.
  17. مسح العينات كما هو موضح في 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تشكيل نتوء أثناء الهجرة الخلية T هو عملية ديناميكية للغاية، واكتين تعتمد. تصور تشكيل نتوء CTL البشرية الأساسية، ونحن transfected عابر بروتين ميجفب تنصهر بتسمية cytoskeleton أكتين في CTL كما هو موضح قبل11. تعداء، بعد يوم واحد من الخلايا تم تضمينها في مصفوفة الكولاجين. رصات الصور اقتنيت كل 40 s مع خطوة-حجم 1 ميكرومتر في 37 درجة مئوية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. كما هو مبين في الشكل 2 ألف و التكميلية الفيلم 1، أثناء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تنفذ معظم فحوصات في المختبر على سطح ثنائي الأبعاد، على سبيل المثال في خلية ثقافة لوحات، أطباق بتري، أو في كوفيرسليبس، بينما في فيفو الخلايا، لا سيما الخلايا المناعية، تجربة معظمه المكروية 3D. ظهور أدلة تبين أن أنماط الهجرة من الخلايا المناعية تختلف بين 2D و 3D سيناريوهات17. وعلاوة على ذلك، كما تختلف ملامح التعبير للخلايا السرطانية في 2D و 3D استزراع الأنسجة18،،من1920. ولذلك، لمحاكاة أفضل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن عدم تضارب المصالح المالية أو التجارية.

شكر وتقدير

ونحن نشكر معهد "هيموستاسيولوجي السريرية" والطب نقل الدم لتقديم التبرع بالدم؛ كارمن Hässig وكورا خوجا للحصول على مساعدة تقنية ممتازة. ونحن نشكر ينس رتيغ (جامعة سارلاند) لناقل بماكس المعدلة، رولاند ويدليتش-المرتزقة (جامعة موينستر) لبناء ليفيكت-روبي الأصلي، وكريستيان يونكر (جامعة سارلاند) لتوليد بنية ليفيكت-ميجفب. مولت هذا المشروع سونديرفورشونجسبيريتش 1027 (المشروع A2 إلى B.Q.) و 894 (المشروع A1 إلى M.H.). مجهر الضوء-ورقة كانت تمولها DFG (GZ: فوغ أنست 256/4 19-1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Fibricol ، محلول كولاجين بقريAdvanced Biomatrix  # 5133-20MLمصفوفة كولاجين
0.5 م NaOH SolutionMerck1091381000لتحييد محلول Fibricol
ذوبان منخفض للغايةAffymetrix32821-10GMتحضير العينة في مجموعة
خلايا CD8 التائية البشرية التي لم تمسها DynabeadsThermo Fisher11348Dعزل الخلايا التائية البشرية الأولية CD8 + < / sup> من PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 لتوسيع الخلايا التائية وتنشيطهاThermo Fisher11132Dتنشيط مجموعات CTL PHC0023
الإنترلوكين البشري المؤتلفThermo FisherCTL P3 المزروعة
LonzaV4XP-30XXTransfection
&alpha ؛ -PFN1 الجسم المضاد ، الأرنب ، IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask غشاء البلازما البرتقالي وصمة عارThermo FisherC10045تسمية الخلية الفلورية
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's phopsphate المحلول الملحيThermo Fisher14190250IF
مصل الأبقار الألبومينSigmaA9418-100GIF
Goat & alpha ؛ أرنب 568 ، IgG ، أرنبThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (مجهر للصفائح الخفيفة)ZeissNA
غطاء مزرعة الخليةThermo FisherHeraSafe KS
حاضنة ثقافة الخلية HERACell 150i ثيرمو فيشرإن إيه
جهاز الطرد المركزي 5418 و 5452EppendorfNA
PippettesEppendorf3123000039 ، 3123000020 ، 3123000063
نصائح الماصةVWR89079-444 ، 89079-436 ، 89079-452   ؛
أنابيب 15 ملSarstedt  62.554.002
الشعيرات الدموية 50 وميكرو ؛ LVWR (العلامة التجارية)613-3373Zeiss LSFM لإعداد
المكبس للشعيرات الدمويةVWR (العلامة التجارية)BRND701934"طوابع بطرف تفلون" تحضير عينة LSFM
MColorPhast pHMerc1095430001لاختبار درجة الحموضة من محاقن Fibricol
BD Plastipak 1 ملBDZ230723  ؛ ALDRICHتحضير عينة بديلة
طين النمذجة (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohNA.
Imaris file converterBitplaneمتاح على http://www.bitplane.com تحويل ملفات التصوير إلى تنسيق ملف Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro ، Track ، Vantage)Bitplaneمتاح على http://www.bitplane.com تحليل بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد ورباعي الأبعاد
تحفيز مجموعة الحل الأولي العينة نصائح k

المراجع

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357(2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689(2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعادتتبع هجرة الخلاياتحضير العينةالحصول على الصورتصوير الخلايا الحيةتحليل العينات المثبتةالخلايا التائية السامة للخلاياالخلايا القاتلة الطبيعية
النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.