تقدم هذه الدراسة إجراء التحقق من صحة والأمثل للعزلة والثقافة البشرية الخلايا اللحمية الرحم لإجراء الفحص في المختبر ديسيدواليزيشن. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة طريقة مفصلة لضربة قاضية كفاءة جين معين باستخدام سيرناس في الخلايا اللحمية الرحم البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التفريق بين الخلايا البشرية stromal بطانة الرحم (هيسك) من ظهور مثل تنتجها الخلايا الليفية في أوروبية الافرازية تحول اللازمة لغرس الجنين في بطانة الرحم رحم الأم. تم إنشاء ديسيدواليزيشن غير لائق أنه سبب الجذري لعدم زرع وإجهاض الأجنة المبكرة اللاحقة. ولذلك، فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن مفيد لتحسين معدل الولادات الناجحة. كثيرا ما تحد في فيفو على أساس دراسات ديسيدواليزيشن الاصطناعية بسبب المعضلات الأخلاقية المرتبطة بالبحوث البشرية، فضلا عن مضاعفات متعدية الجنسيات في نماذج حيوانية. كنتيجة لذلك، غالباً ما تستخدم فحوصات في المختبر من خلال زراعة الخلايا الأولية لاستكشاف تحوير ديسيدواليزيشن عن طريق الهرمونات. وتوفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلاً لعزل هيس واللاحقة ديسيدواليزيشن الاصطناعية عن طريق مكملات الهرمونات إلى وسيلة تثقيف. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة أسلوب مصممة تصميماً جيدا لضربة قاضية الجينات أي اهتمام باستخدام ترانسفيكشنز siRNA على أساس المادة الدهنية. ويسمح هذا البروتوكول الأمثل لنقاء الثقافة فضلا عن المحصول المنتج، مما يؤدي إلى تعظيم القدرة على استخدام هذا النموذج كوسيلة موثوق بها فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن، والتقدير الكمي اللاحقة وكلاء يفرز من الخلايا اللحمية الرحم ديسيدواليزيد.
المقدمة
بين مرحلتي البلوغ وانقطاع الطمث، النساء في سن الإنجاب الخضوع لدورات شهرية لهرمون ينظم انتشار بطانة الرحم، والتمايز، وذرف اللاحقة في التحضير للحمل في عملية تعرف باسم الحيض1 ،2. هذه التعديلات المادية من بطانة الرحم البشرية ضرورية لغرس الجنين السليم داخل جدار الرحم1. تعديلات لبطانة الرحم، بما في ذلك التكيفات المورفولوجية والبيوكيميائية على حد سواء، هي وساطة طوال الدورة الشهرية عن طريق المبيض هرمونات الستيرويد الإستروجين والبروجسترون (P4)3،،من45. ضمن المرحلة التكاثري (أو الحبيبي)، مستويات الإستروج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تحققت جميع خزعات بطانة الرحم البشرية التي تم جمعها لهذا الدراسة من جامعة واشنطن في سانت لويس، قسم طب التوليد وأمراض النساء استخدام المجلس الاستعراض المؤسسي (IRB) وافق نموذج موافقة خطية.
1-إعداد
- إعداد 500 مل 1 × موازنة الملح الحل (حبس هانك) بإضافة البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين بزجاجة تحتوي على وسائط الإعلام (المشار إليها أيضا حبس + المتوسطة).
- إعداد 500 مل من "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو: "مزيج المغذيات" F-12 (DMEM/F12) مع الفينول الحمراء ولام الجلوتامين وحمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 15 ملم 4 (حبيس) بإضافة 1% حل مضاد حيوي فطري (النهائي تركيز هو البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ديسيدواليزيشن في الثقافة هيس
بعد عزلة، الخلايا اللحمية الرحم البشرية المستزرعة إلى تشكيل أحادي الطبقة مع كونفلوينسي 80-90% والتي يسببها ديسيدواليزيشن في المختبر بالتعامل مع 10 نانومتر E2، 1 ميكرومتر الآلام والكروب الذهنية، ومعسكر 50 ميكرومتر (EPC). وقد تصور التحولات المورفولوجية المقترنة في المختبر ديسيدواليزيشن في الشكل 1A. عند ديسيدواليزيشن، هيسكس الخضوع لإعادة ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دورة الطمث الإنجابية الإناث تتميز بارتفاع مستويات البروجسترون طوال الحيض، مما يحفز ديسيدواليزيشن من المفتاح ESC في الخلايا الافرازية جولة, طلائي مثل3،8. الشروع في ديسيدواليزيشن من الأنواع التابعة. في البشر، ويحدث ديسيدواليزيشن تلقائياً عند ارتفاع تركيز البروجسترون، بينما تتطلب وجود الكيسة10،11من الفئران. تجسد هذا التناقض في ديسيدواليزيشن فوائد المتعدية دراسة التمايز الخلوي في خطوط الخلايا البشرية. غالباً .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
هذا العمل هو مدعومة بتمويل من الوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة)/المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) منحة (R00 HD080742) وبدء العمل في "كلية الطب بجامعة واشنطن" الأموال إلى ر. ك. نود أن نشكر "عيادة الخصوبة جامعة واشنطن" لتقديم عينات خزعة بطانة الرحم.
شكر وتقدير
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Opti-MEM I (1X) مصل متوسط | متوسط Gibco | 31985-070 | لوسائط إزالة الانبعاثات |
| DMEM / F12 (1: 1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4٪) | Gibco | 15250-061 | لعدد الخلايا |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | لعزل / تنقية الحمض النووي الريبي |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | الحيوية التطبيقية | 4304437 | |
| مجموعة النسخ العكسي عالية السعة cDNA | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4374967 | |
| حقيقيات النواة 18S rRNA التحكم | تقنيات الحياة | 4319413E | للتحكم الداخلي qPCR |
| التعبير الجيني TaqMan مسبار البرولاكتين | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4331182 | للتحكم الداخلي qPCR |
| الجيني TaqMan فحص IGFBP1 | مسبار الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4331182 | للتحكم الداخلي qPCR |
| كاشف Phalloidin-iFluor 488 - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| مجموعة البرولاكتين البشري ELISA | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16٪ بارافورمالديهايد | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | كاشف التعداء |
| ProLong Gold المضاد للبهتان الكاشف مع DAPI | Invitrogen | P36935 | لتركيب |
| 0.25٪ Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| مصل الأبقار الجنيني المجرد | من الفحم Sigma | F6765-500ML | |
| بيكربونات الصوديوم (7.5٪) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS كاشف | فيشر 45001749 | ||
| كولاجيناز من المطثية الأنسجة | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقري | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | ل EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | لوسائط EPC |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | لوسائط EPC |
| مقص غرزة مستقيمة دقيقة | أدوات العلوم الدقيقة | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| مصل الأبقار الجنيني ، معطل بالحرارة | Gibco | 10-082-147 | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات | حراري 15240062 | ||
| هانك s محلول ملح متوازن | كورنينج | 21-021-cv | |
| 50 مل أنبوب فالكون مخروطي البولي بروبلين | كورنينج | 352098 | |
| دومون # 5/45 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-35 | |
| 100 × 15 مم طبق بتري زجاجي | VWR | 75845-546 | |
| مصفاة خلية 40 ميكرون | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 حمام مائي | فيشر Scientific | FS-215 | |
| جهاز الطرد المركزي LSE | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | مسبار qPCR الخاص بالجين |
| Steri-cycle i160 CO2 حاضنة | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | لقياس الحمض النووي الريبي |
| محلول ملحي مخزن فوسفات ؛ | فيشر ساينتفيك | 50146771 | |
| 75 سم قارورة ثقافة الخلايا ذات الرقبة المعلقة | Corning | 430641U | |
| 6 جيدا لوحة زراعة الخلايا غير | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 سم قارورة ثقافة الخلايا العنقية المعلقة | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 مل أنبوب فولي بروبيلين فالكون مخروطي | الشكل Corning | 352099 | |
| 10 مل حقنة | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 غطاء السلامة البيولوجية | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 جهاز طرد | مركزي فيشر Scientific | 13100675 | |
| 7500 سريع نظام PCR في الوقت الحقيقي | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 3052632 | |
| EVOS FL المجهر المناعي | تقنيات الحياة | 01414-155G-291 | |
| Leica مجهر الضوء المقلوب | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| جداول بيانات Excel | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser نظارات غطاء 18 مم | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | للمخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي |
| 1.2 مل 430658 قارورة بولي بروبيلين مبردة خارجية | للتجميد لخلايا HESC ؛ | ||
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما | D2650-100 مل | لتجميد الوسائط |
المراجع
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualiza....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
