مقالة منهجية

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

DOI:

10.3791/57702

⸱

أبريل 19, 2018

 , 
1Development and Stem Cells Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طريقة مؤتمتة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد من germline ايليجانس كاينورهابديتيس . أسلوبنا يحدد عدد والموقف من كل نواة داخل الخط وتحليلات germline البروتين التوزيع وهيكل cytoskeletal.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استخدام الخط ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) لدراسة عدة عمليات هامة بيولوجيا بما في ذلك ديناميات التنمية والمبرمج وكروموسوم الخلية الجذعية. بينما الفعل نموذجا رائعا، التحليل غالباً اثنان الأبعاد نظراً للوقت والعمالة اللازمة لتحليل ثلاثي الأبعاد. قراءات الرئيسية في مثل هذه الدراسات هي العدد/موقف النوى وتوزيع البروتين ضمن الفعل. نقدم هنا، طريقة لإجراء تحليل الآلي للخط استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] والنهج الحسابية لتحديد عدد وموقف النوى في كل منطقة الفعل. كما يحلل لدينا أسلوب توزيع البروتين germline التي تمكن من فحص ثلاثي الأبعاد للبروتين في التعبير في مختلف الخلفيات الوراثية. علاوة على ذلك، يبين دراستنا الاختلافات في بنية سيتوسكيليتال في مناطق متميزة الفعل أنه يمكن استيعاب متطلبات التنمية المكانية محددة. وأخيراً، تمكن لدينا طريقة العد الآلي للحيوانات المنوية في سبيرماثيكا لكل germline. أخذت معا، تمكن لدينا أسلوب التحليل المظهرية السريع واستنساخه من germline C. ايليجانس .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجعل المحافظة على إشارات المسارات مع الثدييات C. ايليجانس نموذجا ممتازا لدراسة متعددة العمليات البيولوجية1،2. في لدينا مختبر، نستخدم germline C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا الجذعية، والمبرمج، والتعبير الجيني. بينما الفعل هيكل ثلاثي الأبعاد، العديد من الدراسات وهما الأبعاد نظراً لطبيعة تحليل ثلاثي الأبعاد تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة. أنه من المحتمل جداً أن تحليل الأبعاد قد تشوه في فيفو الأحداث في الفعل. وقد خنثي الكبار C. ايليجانس هما germline الأسلحة، كل منها يضم خلية جسدية نصيحة القاصي (DTC) الذي يحافظ على الخلايا الجرثومية القاصي في3،دولة غير متمايزة4. هذه الخلايا الجرثومية ابدأ أن يميز أنها تتحرك بعيداً عن DTC، الإفلات من تأثيرها، وتصبح بويضات والحيوانات المنوية كما أنها تصل إلى نهاية الدانية الفعل. وخلال هذه العملية، يخضع نواة الخلية الجرثومية الانقسام، قبل الانتقال إلى الانقسام الاختزالي5،6. اكتمال إنتاج الحيوانات المنوية بمرحلة اليرقات 4 (L4) التنمية، وبعد ذلك يتم إنتاج بويضات خلال مرحلة البلوغ. يتم تخزين الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا حيث أنها تخصب بويضات لتوليد أجنة.

وهناك العديد من العوامل الوراثية والبيئية التي يمكن أن تؤثر على التنمية germline في C. ايليجانس أسفر عن تغييرات في عدد الأنوية، عدد من الأحداث أبوبتوتيك، وديناميات كروموسوم، وتعبير البروتين و/أو التعريب7 ،،من89،،من1011. تحليل هذه الأحداث تتطلب تحديد كل مرحلة من التمايز على أساس مورفولوجيا النووية والتوزيع. لدقة تحليل هذه المعلمات يدوياً مع حجم عينة كبيرة كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً. للالتفاف على هذه العيوب، ولتمكين اتساق التحليل، قمنا بتطوير أسلوب الآلي لفحص ثلاثي الأبعاد ل germline C. ايليجانس للنوى العد، وتوزيع الأنوية، تعبير البروتين، وسيتوسكيليتال الهيكل. بالجمع بين الفحص المجهري [كنفوكل] التقديم ثلاثي الأبعاد، نحن إنشاء معلمات حجم وشكل للتعرف على كل مرحلة من تمايز الخلية الجرثومية. علاوة على ذلك، يتيح هذا الأسلوب عد نواة الخلية الجرثومية والحيوانات المنوية بالإضافة إلى سجل لعدد الصبغيات في كل البويضات.

هيكل حاسم واحد في الفعل هو سيتوسكيليتون، الذي يوفر الاستقرار إلى حجرة germline والجري هيولى الإيدز والحماية بالفعل أنوية12. استخدام التقديم الحسابية، نحن إجراء إعادة البناء ثلاثي الأبعاد ل germline cytoskeleton وتحديد السمات المميزة سيتوسكيليتال ضمن الفعل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح التحليل الحسابي كيف جنبا إلى جنب مع [كنفوكل] التصوير يتيح تحليلاً شاملا ل germline C. ايليجانس .

ونحن نقترح طريقة سريعة لتحليل ثلاثي الأبعاد C. ايليجانس germline (الشكل 1). استخدام تحليل ثلاثي الأبعاد، فمن الممكن لدراسة توزيع ثلاثي الأبعاد من نوى germline (الشكل 2 و الشكل 3)، الآلي عد الخلايا (الشكل 2)، إعادة إعمار cytoskeleton germline ( 3 الرقم)، توزيع البروتينات (الشكل 4)، وسجل عدد الحيوانات المنوية في سبيرماثيكا والصبغيات في بويضات (الشكل 5). الأسلوب ليس فقط تمكن الكمي سهل ودقيق للخط ولكن يحدد تعمل فسيولوجيا ذات الصلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد وتربية دودة

ملاحظة: تشير الجدول للمواد لجميع معلومات المنتج.

  1. OP50 الإشريكيّة القولونية الثقافة: الثقافة البكتيريا OP50 في مرق ليسوجيني (رطل) (تريبتوني 1%، الخميرة 0.5%، 0.5% كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المضادات الحيوية.
  2. البذور 400 ميليلتر من البكتيريا OP50 لنمو السلكية وسائط الإعلام (NGM) لوحات (1.5 غرام من كلوريد الصوديوم، ز 8.5 من أجار، ز 1.25 من ببتون، 1 مل 1 م كاكل2، 1 مل 5 ملغ/مل الكولسترول في الإيثانول، 1 مل 1 م MgSO4 ، و 25 مل من المخزن المؤقت4 مشرف 1 متر) والهواء الجاف للبكتيريا ح 48.
  3. اختيار الديدان في المصنف NGM لوحات واحتضان في 15 درجة مئوية أو 20 درجة مئوية.
    1. لتحليل germline خنثي الكبار، انتقاء جيدا تغذية الديدان L4 المرج البكتيرية واحتضان بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية.
    2. لتسجيل عدد الحيوانات المنوية في المنحرفين، احتضان الديدان L4 في 20 درجة مئوية ح 12 حتى تصل الديدان إلى تساقط L4/الكبار. لمزامنة الديدان إلى مرحلة L4، تحضير البيض بالتقاط الديدان الكبار مع الكثير من البيض في حل التبييض (1 م هيدروكسيد الصوديوم والتبييض بنسبة 1:1). السماح للبيض يفقس وانتقاء الحيوانات L4 للتجربة.
  4. إعداد شرائح المجهر تفلون بوضع 25 ميليلتر من حل بولي-L-يسين على الشريحة ونشر الحل أيضا، استخدام تلميح ماصة. بعد إزالة الزائدة بولي-L-يسين مع منشفة ورقية، السماح للشرائح للهواء الجاف واحتضان الشرائح عند 65 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.

2-Germline تشريح والمصبوغة6،13

  1. بقعة 10 ميليلتر من تيتراميسولي 0.01 ٪ (مخدر) في ساترة 22 مم × 22 مم وانتقاء البالغ من العمر اليوم واحدة من الديدان الكبار في ذلك.
  2. تشريح الدودة في الذيل كما أنه يصبح مخدراً استخدام المحاقن (5 مل) وابرة (24 "× 1")، والتأكد من أنه الفعل غير معطوب.
    ملاحظة: يجب إجراء التشريح قبل الدودة يصبح مشلولا تماما حيث أن الضغط السلبي في حركة الدودة والدودة المعونة طرد الفعل. للتهديف الحيوانات المنوية، يجب اتخاذ الاحتياطات لا على الضرر سبيرماثيكا بالإبرة خلال التشريح. تجنب لمس الفعل مع الإبرة ما عدا النقطة التشريح بعد سبيرماثيكا. إذا كان هناك كسر في حجرة germline أو يتم ملاحظة أي إفرازات من الخط، ينبغي عدم استخدام الفعل للتحليل.
  3. ضع ساترة مقلوب على شريحة مغلفة بولي-L-يسين، إبقاء germline تشريح على الشريحة.
  4. إزالة السائل الزائد تحت ساترة بوضع برج ورق في زاوية ساترة، ثم مكان الشريحة في نيتروجين سائل لإزالة الحد الأدنى 1 بسرعة ساترة استخدام إبرة مع جيرملينيس على الشريحة.
  5. نقل الشرائح إلى الميثانول-20 درجة مئوية ل 30-60 ثانية في دائرة، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة في الحل تحديد الطازجة (1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على 0.08 م حبيس pH 6.9، 1.6 مم MgSO4، 0.8 ملم جليكول-bis(beta-aminoethyl خماسي البروم ثنائي الفينيل)-ن، ن، ن '، ن'--بارافورمالدهيد tetraacetic حمض (عطا)، و 3.7 في المائة) في درجة حرارة الغرفة.
  6. يغسل الشرائح عن طريق وضع في دائرة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1، الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 0.1% توين-20 للحد الأدنى 10 تكرار هذه الخطوة مرة واحدة.
  7. كتلة جيرملينيس مع 30 ميليلتر من عرقلة الحل (30% مصل الماعز أعدتها إضافة 900 ميليلتر من مصل الماعز في 1700 ميليلتر من المقطر ح2س و 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 10) في دائرة رطبة على استعداد بوضع منشفة ورقية رطبة في مربع بلاستيك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  8. إضافة 50 ميليلتر من حل جسم REC-8 إعداد مصل الماعز 30% في رافعة نسبة لكل عينة. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  9. يغسل الشرائح عن طريق وضع في دائرة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 مع 0.1% توين-20 للحد الأدنى 10 كرر الخطوة مرة واحدة وإزالة السائل الزائد بوضع منشفة ورقية في زاوية الشريحة.
  10. تحضير حل جسم الثانوية بتمييع fluorophore الخضراء (488 نانومتر الانبعاثات الطول الموجي) الأجسام المضادة مترافق الثانوي (1: 1000)، فالويدين (أكتين وصمة عار، 1:4000) و DAPI (الحمض النووي وصمة عار، 1:4000) في مصل الماعز العادي 30%.
  11. إضافة 50 ميليلتر من حل جسم الثانوية إلى الشريحة.
  12. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  13. يغسل الشرائح مرتين عن طريق وضع في دائرة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 مع 0.1% تمحو توين-20 للحد الأدنى 10 السائل الزائد.
  14. إضافة 30 ميليلتر من تحديد الكاشف على الشريحة ومكان 12 مم2 × 1.5 ميكرومتر ساترة في الأعلى وجاف الشرائح عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

3-[كنفوكل] مجهرية

  1. قم بتشغيل المجهر [كنفوكل]، وأشعة الليزر والماسح الضوئي رنانة البرمجيات مجهر [كنفوكل]. ضع الشرائح مع جيرملينيس الملون على حامل الشرائح أعلاه الهدف X 63.
  2. موقع الفعل، التركيز على الجزء العلوي الخط ووضع علامة عليه باستخدام البرمجيات مجهر [كنفوكل]. وبالمثل التركيز على الجزء السفلي من الخط ووضع علامة عليه تحديد سمك الخط الإجمالية.
  3. صورة germline كامل عن طريق تحديد سمك كل شريحة ما يصل إلى 0.5 ميكرومتر. مارك germline كاملة واقتناء ابدأ. مسح كل شريحة 8 مرات، ومتوسط القيم لتحسين جودة الصورة. وسوف تسمح الماسح الضوئي رنانة مسح سريع لتجنب تبيض أثناء التصوير. إذا لم يكن لديه المجهر ماسح رنانة، تقليل عدد عمليات التفحص إلى أربعة لتجنب تبيض.

4-وظيفة التصوير تحليل الأنوية العدد والتوزيع

ملاحظة: تشير التكميلية الرقم 1 للقطات من البرامج والأدوات والأزرار المستخدمة.

  1. استيراد الصورة إلى إيماريس 8.4.1 أو الإصدارات الأحدث من البرنامج.
  2. تعريف المنطقة الانقسامية والمنطقة الانتقالية والمنطقة هو، المنطقة البويضات وسبيرماثيكا الفعل بتحديد مورفولوجيا النووية في كل منطقة.
  3. استخدم الزر الدالة السطحية ("تكميلية الشكل" 1A) من البرنامج لتحديد منطقة الفائدة.
  4. إلغاء معالج إنشاء السطح التلقائي ورسم منطقة الفائدة في الشريحة الأولى والأخيرة من الصورة يدوياً من المكدس ثلاثي الأبعاد.
  5. انقر فوق إنشاء سطح.
    ملاحظة: سيضع البرنامج تلقائياً إلى الكدسات بين مكدس الأول والأخير.
  6. قناع كل القنوات ما عدا DAPI بواسطة النقر فوق زر قناة قناع ("تكميلية الشكل" 1B--جيم).
  7. تعريف معلمات حجم النووية باستخدام زر الدالة بقعة ("تكميلية الشكل" 1A). لمنطقة الانقسامية، تعريف قطر س ص 2 ميكرومتر بينما يترك القطر Z غير معروف. الانتقال لمنطقة تعريف قطر س ص 2 ميكرومتر وقطر Z ك 1.5 ميكرومتر. (تكميلية الشكل 1).
    ملاحظة: استكشاف الأخطاء وإصلاحها في أقطار وفقا للتكبير والمواصفات من المجهر. للبروتوكول الحالي، هدف استخدامها 63 X وتقدم إضافي مرات 1.70 التكبير أثناء التصوير. إذا تم تغيير الهدف، على سبيل المثال 40 X، يجب تغيير في الأقطار تبعاً لذلك. ينبغي القيام باستكشاف الأخطاء وإصلاحها مع جيرملينيس wildtype إنشاء المعلمات الصحيحة. منطقة الانقسامية في ذراع germline نوع البرية بحوالي 250 الأنوية. وينبغي تعديل القطر لتحقيق هذه القيمة. استخدام جيرملينيس 15 على الأقل لتحديد القيمة المثلى للقطر. ينبغي استخدام نهج مماثل لمعايرة في المنطقة الانتقالية (نويات 150-170) وهو منطقة (600-700 نوى).
  8. تقييد الكشف عن بقع بتعريف الحد الأدنى (1E الشكل التكميلية). استخدام DAPI الملون جيرملينيس نوع البرية تحديد عتبة الحد الأدنى بزيادة عتبة الحد الأدنى التقديم ثلاثي الأبعاد حتى يظهر الموقع الأول خارج الفعل.
  9. حفظ الصورة والحصول على عدد الأنوية من الجدول إنشاؤها تلقائياً بواسطة البرنامج. تصدير الصور كملفات TIF.

5-مرحلة ما بعد التصوير التحليل للتهديف الحيوانات المنوية وعدد الصبغيات

  1. أداء العرض ثلاثي الأبعاد بتحديد سبيرماثيكا كالمنطقة للفائدة. للكشف عن كل الحيوانات المنوية، وتحديد قطر بقعة بين 0.75-µm 1.0 ل X والمحور Y، بينما قطر ض ما زال غير معروف. استخدم الزر دالة البقع كما هو موضح في التكميلية الرقم 1.
  2. طرح الخلفية التي تدق خلفية طرح مربع واستخدام خلفية تصحيح القيم المحسوبة بالبرنامج (تكميلية الشكل 1).
    ملاحظة: البرامج إيماريس يختار النقاط عالية الكثافة أولاً، ولذلك أثر الخلفية الحد الأدنى ما دام هناك فرق كبير بين منطقة الاهتمام والخلفية. طريقة ثانية تحديد تصحيح الخلفية يدوياً، وعند الاقتضاء قيم يمكن أن تعطي للخلفية. التصحيح اليدوي الخلفية سيكون مناسباً إذا كانت كثافة العينات المستقلة تحتاج المقارنة.
  3. ضبط عتبة التقديم ثلاثي الأبعاد للكشف عن جميع الحيوانات المنوية DAPI الملون في سبيرماثيكا (1E الشكل التكميلية).
  4. لعد كروموسوم، تحديد قطر بقعة < ميكرومتر 0.75 ل X والمحور Y قبل وضع نماذج ثلاثية الأبعاد.
  5. احفظ الصورة وتصديرها كملف TIF.

6-مرحلة ما بعد التصوير التحليل لإعادة إعمار سيتوسكيليتال الفعل

  1. تحديد المنطقة للاهتمام الفعل وتخفي جميع القنوات إلا فالويدين بواسطة النقر فوق زر قناع القنوات .
  2. تعريف تفاصيل سطح من 0.25 ميكرومتر باستخدام الزر دالة السطحية (تكميلية الشكل 1).
    ملاحظة: هذا يعني كل 0.25 ميكرومتر سيتم تقديمها إلى نماذج ثلاثية الأبعاد. تفاصيل السطح يمكن أن تكون ثابتة لأي منطقة الخط حيث سيتم إنشاء نموذج سطح ثلاثي الأبعاد لكل 0.25 ميكرومتر. ومع ذلك، يمكن زيادة تفاصيل السطح لمنطقة البويضيه، إلى 0.35-0.5 ميكرومتر سبب وجود ألياف الأكتين واضحة المعالم في هذه المنطقة.
  3. طرح الخلفية التي تدق خلفية طرح مربع واستخدام خلفية تصحيح القيم المحسوبة بالبرنامج (تكميلية الشكل 1).
  4. ضبط عتبة التقديم ثلاثي الأبعاد اعتماداً على هيكل تتطلب التحليل (1E الشكل التكميلية).
  5. حفظ الصورة ثلاثية الأبعاد المتقدمة وتصديره كملف TIF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشير الرقم 1 إلى الوقت اللازم لتحليل الخط ثلاثي الأبعاد. تشريح لعزل جيرملينيس المنحرفين L4 المحتضنة عند 20 درجة مئوية والملون مع DAPI، فالويدين، والأجسام المضادة ضد germline البروتينات. جيرملينيس يتم تصويرها باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. مجهرية المصبوغة و [كنفوكل] يتطلب حوالي 24 h. التحليل الحسابي للخط الكامل يتطلب 10-15 دقيقة عد عدد والموقف من النوى، وتحديد توزيع البروتين، تحليل هيكل سيتوسكيليتال ونقاط عدد الحيوانات المنوية. التحليل اليدوي الكامل يتطلب أك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول هو تحسين الدقة وتقليل الوقت اللازم لتحليل الخط. بعد إعداد قياسية من جيرملينيس تشريح، إعداد نموذج ثلاثي الأبعاد لنوى germline التقديم الحسابي. بينما يسمح لمراقبة توزيع الأنوية germline في الفضاء، التقديم ثلاثي الأبعاد بحساب عدد الأنوية في مناطق محددة الفعل. الجوانب البالغة الأهمية في أسلوبنا تعريف دقيق لمعلمات حجم وشكل نواة. وهذا يعتمد على الوضوح في تلطيخ والتكبير المستخدمة للصورة. نحن يؤكد دقة الأسلوب بمقارنة لنشر البيانات يدوياً تحليل1. لزيادة التأكد من دقة أسلوبنا، استخد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر ميكرويماجينج موناش لتقديم الدعم التقني لهم. وقدمت بعض سلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). هذا العمل كان يدعمها زمالة اكتشاف الطب الحيوي جامعة موناش، ومنحة مشروع NHMRC (GNT1105374)، NHMRC أقدم زمالة بحثية (GNT1137645) والزمالة الابتكار فيسكي: 23 VIF لروجر بوكوك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C. elegans< / em> سلالات: النوع البري (N2 ، بريستول) ، rnp-8 (tm2435) I / hT2 [bli-4 (e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III  < / em>مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) OP50
الإشريكية القولونية < / em> البكتيرياالخيطية محلية الصنع
(NGM) لوحاتمحلية الصنع
مضاد ل REC-8 & nbsp ؛SDIX29470002
Alexa 488 الجسم المضاد المترافق الذي تم تربيته في الماعزThermofisher ScientificA-21236
صبغة الهيكل الخلوي phalloidin   ؛ثيرموفيشر ScientificA-12380
DAPI ثيرموفيشر العلمية 62248
بولي إل ليسين سيجما ألدريتشP5899
تتراميسول  سيجما ألدريتشP5899
MgSO4سيجما ألدريتشM7506
1M عازلة HEPES ، درجة الحموضة 7.4   ؛سيجما ألدريتشG0887
10X PBS درجة الحموضة 7.4  ثيرموفيشر العلميAM9625
Tween-20 سيجما ألدريتشP1389
EGTAسيجما ألدريتشE3889
37٪ محلول بارافورمالديهايدميرك ميليبور1040031000
مصل الماعز العاديسيجما ألدريتشG9023
كاشف تثبيت الفلوروشيلد  سيجما ألدريتشF6182
الإيثانول  Millipore 1009832511
الميثانولسيجما ألدريتش34860
20 درجة ؛ ج & أمبير 25 درجة ؛ حاضنة أي علامة تجارية
مجهر خفيفأي علامة تجارية
مجهر متحد البؤر   ؛  أي علامة تجارية (Leica ، Zeiss)
كمبيوتر مزود بنسخة Imaris 8.4.1 أو إصدار أحدث ، ترخيص كامل لاستخدام البرنامج وبرنامج Matlab.Bitplane
Phospho محلول ملحي مخزن ، درجة الحموضة 7.4محلية الصنع
  ؛Tekdon   941-322-8288
وسائط نمو الديدان أرنب متعدد النسيلة شرائح مجهر تفلون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
  2. Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
  3. Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
  4. Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372(2014).
  5. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
  6. Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
  7. Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
  8. Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).
  9. Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
  10. McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).
  11. Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
  12. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
  13. Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
  14. Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
  15. Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
  16. Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
  17. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).
  18. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
  19. Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
  20. Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
  21. Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C elegans

مقالات ذات صلة