مضادات الميكروبات توصيف المواد المتقدمة لتطبيقات الهندسة الحيوية

Summary

نقدم بروتوكول لتوصيف المواد المتطورة المضادة للميكروبات. هنا، ونشاط مضادات الميكروبات على الأسطح المادية يقاس بطريقتين التي يكمل كل منهما الآخر: واحد يستند إلى اختبار نشر القرص أجار، والآخر إجراء قياسي استناداً إلى المعيار ISO 22196:2007.

Abstract

تطوير مواد جديدة متقدمة مع خصائص محسنة أصبحت أكثر وأكثر أهمية في مجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة الحيوية. هكذا، يجري تصميم العديد من المواد الحيوية رواية لمحاكاة البيئات المحددة المطلوبة للتطبيقات الطبية الحيوية مثل هندسة الأنسجة وإيصال الأدوية الخاضعة للرقابة. تطوير مواد ذات خصائص محسنة لتجميد الخلايا أو الإنزيمات أيضا موضوع أبحاث الحالية في مجال الهندسة البيولوجية. واحدة من الخصائص الأكثر استصواباً لمادة في هذه التطبيقات غير أن قدرة مضادات الميكروبات لتجنب أي عدوى غير مرغوبة. لهذا، فإننا نقدم بروتوكولات سهلة لمتابعة للميكروبات توصيف المواد استناداً إلى الاختبار (ط) نشر القرص أجار (طريقة الانتشار) و (الثاني) المعيار ISO 22196:2007 لقياس نشاط مضادات الميكروبات على الأسطح المادية (جهة الاتصال الأسلوب). يجب تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام والخميرة لتغطية مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة. على سبيل مثال، يتم اختبار المواد 4 مع الطبيعة الكيميائية مختلفة عقب هذا البروتوكول ضد الإشريكيّة القولونية، المكوّرات العنقودية الذهبيةو المبيضات البيض. نتائج هذه الاختبارات معرض النشاط غير مضادات الميكروبات للمادة الأولى وزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام للمواد الأخرى 3. إلا أن أيا من هذه المواد 4 قادرون على تحول دون نمو المبيضات البيض.

Introduction

فشل عملية الزرع في كثير من الأحيان نتيجة للعدوى الميكروبية التي تحدث على الرغم من ظروف العمل العقيم والاتقاء بمضادات الميكروبات. هذه المشكلة تسبب تكاليف الرعاية الصحية مرتفعة جداً والمحزن بين المرضى¹. أهمية البكتيريا مثل المكوّرات العنقودية الذهبية هي حاليا تعتبر مسببات الأمراض الخطرة جداً في العداوي المستشفوية المرتبطة بالقسطرة ويزرع الطبية الأخرى وهي الملوثات الرئيسية للأدوات الطبية². ولذلك، وضع استراتيجيات مضادة للميكروبات رواية مطلوب على وجه السرعة للاستخدامات اليومية والطبية على حد سواء.

وتشمل مضادات الجراثيم المضادات الحيوية³ومركبات الأمونيوم الرباعية⁴، الأيونات المعدنية/أكاسيد⁵ومضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير)⁶. وأصبحت تدريجيا أقل كفاءة بسبب مقاومة البكتريا⁷، الذي أخذ في الازدياد بسبب الإفراط في استخدام المضادات الحيوية⁸المضادات الحيوية. مركبات الأمونيوم الرباعية فقط فعالة جداً لاستخدام قصيرة الأجل بسبب المقاومة الميكروبية⁹. الأيونات المعدنية/أكاسيد استخدمت طويلاً كعوامل مضادة للميكروبات فعالة جداً، وتستخدم في العديد من المنتجات التجارية المشتركة بما في ذلك ضمادات، مرشحات المياه، والدهانات، إلخ^10،،من¹¹¹². ومع ذلك، وقد ثبت أن هذه الأنواع من المركبات يمكن أن تكون سامة لبعض أنواع خلايا الثدييات¹³.

إظهار الامبير مضادات الميكروبات ممتازة وخصائص إيمونومودولاتوري^14،15، والبكتيريا ويبدو أن تجد من الصعب جداً تطوير مقاومة ضدها¹⁶. عملية لإنتاج الامبير نقية غير مكلفة؛ ولذلك، إنتاج على نطاق واسع غير قابلة للبقاء. وهكذا، وضع استراتيجيات للتصدي للمشاكل في إنتاج الامبير كانت (مثلاً، بيبتويد المضادة للبكتيريا الجزيئات الصغيرة يقلد¹⁷، بيبتويدس¹⁸, α-الببتيدات¹⁹ و β-الببتيدات²⁰). البروتينية انتهت الميثاكريليت وبوليبيبتويدس قد تم تصنيعه ل طلاء مضادات الميكروبات والمضادة للحشف على السفن²¹.

تطوير مضادات الجراثيم الجديدة مثل المواد المتقدمة في نقية أو النموذج الهجين، قادرة على منع وعلاج الالتهابات المقاوم للأدوية المتعددة، وضروري بشكل متزايد. وضعت مجموعة واسعة من مواد متقدمة جديدة للعديد من حقول الهندسة الحيوية مثل الأنسجة والهندسة البيولوجية مع تحسين الخواص الكيميائية والفيزيائية في العقود الماضية من خلال عدة أساليب: البلازما--البلمرة تطعيم على الركازة مسعور^22،،من²³²⁴، والخياطة crosslinking الكثافة^،من²⁵إلى²⁶، البلمرة في الحل^27،،من^{2829 , 30}, بورجين انحلال^3231،، وعن طريق إدماج المواد النانوية مثل الجرافين أوكسيد (GO)^33،34،،من³⁵³⁶ و الكربون النانو (كنفس)³⁷.

دراسة قدرة الميكروبات من هذه المواد الجديدة يمكن أن تزيد أضعافاً مضاعفة على إمكانية تطبيق الهندسة الحيوية و، ولذلك أصبح من الضروري. نقدم بروتوكولا سهلة المتابعة لقياس نشاط مضادات الميكروبات من هذه المواد المتقدمة الجديدة. هنا، بعد إعداد نموذج، يتم اتباع أسلوبين من أساليب تكميلية: الأولى يستند أجار القرص نشر اختبار³⁸ (طريقة الانتشار) والثاني يستند إلى ال ISO 22196:2007 المعيار³⁹ لقياس نشاط مضادات الميكروبات في الأسطح المادية (أسلوب الاتصال).

Protocol

1. إعداد نموذج

1. قطع عينات المواد إلى أقراص قطرها 10 ملم يبلغ قطرها 10 ملم لكمه أسطواني.
   ملاحظة: يمكن خففت في المذيبات معقمة مناسبة ح 1 مواد هشة وقطع ثم إلى الأقراص. على سبيل المثال، المواد ماء مثل الزنك الجينات تم اختبارها بعد هذا البروتوكول وكان مبلل في الماء يعقم قبل قصها تفاديا لكسر عينة. ومع ذلك، لا تحتاج مواد أخرى مسعور مثل poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) أي نوع من تورم السابقة من أجل أن تقطع بشكل صحيح.
2. الجاف للأقراص عينة المادية عند 60 درجة مئوية في فرن فراغ (< 10^-2 ميلليمتر زئبق) ح 24.
   ملاحظة: قد تحتاج بعض مواد تجفيف ارتفاع في درجة حرارة. ومع ذلك، من المهم ليس للوصول إلى درجة حرارة التي يمكن أن تتحلل حرارياً بالمواد.
3. قياس سمك المواد الفيلم مع قدمه ذات الورنيّة رقمية.
   ملاحظة: هذا البروتوكول وتوصي باستخدام الأفلام المادية مع سمك ثابت ومماثلة عند مقارنة نشاط مضادات الميكروبات لمواد مختلفة.
4. تعقيم كل عينة بالانغماس في الإيثانول 70% لمدة 10 دقائق واللاحقة البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ح 1 في كل جانب.
   ملاحظة: يمكن إجراء الأشعة فوق البنفسجية وضع كل عينة في طبق بتري معقم داخل غطاء الاندفاق الصفحي مع مصباح ث 12.0 لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية-ج.
   تنبيه: الباحثين ينبغي عدم تعريض أنفسهم للأشعة فوق البنفسجية، لأنها مطفرة.
5. نفذ الخطوات 1.1، 1.2، 1.3 و 1.4. مع الأقراص السيطرة المادية.
   ملاحظة: البولي ايثلين (PET) أو مواد بديلة غير مضادات الميكروبات يمكن كأقراص التحكم في أسلوب نشرها والاتصال. وعلاوة على ذلك، عندما وصف نانومترى أو مواد المعالجة، ينبغي استخدام المواد الأساسية كمواد لعنصر التحكم.

2-الموصى به الكائنات الحية الدقيقة

ملاحظة: نوصي باستخدام 3 الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لدراسة قدرة الميكروبات المواد المختبرة ضد طائفة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة.

1. استخدام الثقافات نقية للكائنات الدقيقة 3: البكتيريا إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبيةوالبكتيريا سلبية الغرام الإشريكيّة القولونيةوالخميرة المبيضات البيض.
   ملاحظة: أنواع الكائنات الدقيقة الأخرى يمكن أيضا اختبار مع هذا البروتوكول عن طريق تعديل شروط الحضانة إذا لزم الأمر.
   تنبيه: يجب أن يتبع مقاييس السلامة المطلوبة وفقا للنوع من الكائنات الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول.
2. العمل مع المواد المعقمة مسبقاً أو يعقم واستخدام موقد بنسن خلال العملية برمتها من التلاعب بالميكروبات أو خزانة سلامة بيولوجية (إذا لزم الأمر) لضمان ظروف معقمة.
   ملاحظة: شروط اﻷوتوكﻻف الموصى بها 121 درجة مئوية خلال 15 دقيقة لوسائل الثقافة و 121 درجة مئوية خلال 20 دقيقة للعامل المادي والمخلفات البيولوجية.

3-أجار القرص نشر الاختبار (طريقة الانتشار)

ملاحظة: عند انتشار سائل من المركبات المضادة للميكروبات قد تكون الميكروبات هي الآلية الرئيسية للمواد المتقدمة، يمكن أن توفر طريقة نشر معلومات مفيدة جداً حول قدرة الميكروبات من هذه المواد. القرص مادية تقع في وسط اللوحة أجار يمكن أن تشكل منطقة الطوق شفافة (هالة) حيث يحدث تثبيط نمو الكائنات الدقيقة بعد 24 ساعة ثقافة (انظر الشكل 1).

1. نشر الاختبار الداخلي
   1. الإعداد وفول الصويا تريبتيك اﻷوتوكﻻف أجار (TSA) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   2. من أجل السياحة في أطباق بتري معقمة تحت ظروف معقمة باستخدام موقد بنسن أو غطاء الاندفاق الصفحي.
      ملاحظة: يجب أن تكون لوحات حساب السياحة الفرعي 4-6 مم.
   3. الثقافة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لفحصها هوائيا ح 18 – 24 في أطباق بتري بحساب السياحة الفرعي في حاضنة في 37 درجة مئوية.
   4. إعداد ومرق الصويا تريبتيك اﻷوتوكﻻف (TSB) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   5. من أجل TSB في أنبوب الطرد مركزي قبل تعقيم 50 مل مع ماصة معقمة قبل مصلية تحت ظروف معقمة باستخدام موقد بنسن أو غطاء الاندفاق الصفحي.
   6. ريسوسبيند مستعمرات قليلة من الخطوة 3.1.3 في 25 مل من TSB الواردة في أنبوب عقيم للطرد مركزي باستخدام مسحه القطن المعقمة ودوامه لهم لمدة 1 دقيقة لتحقيق خلط موحدة.
   7. ضبط امتصاص (في 540 نانومتر) الثقافة مع جهاز المطياف الضوئي لعدد مناسب من مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) كل مل: حوالي 1.5 × 10⁸ زيمبابوي/مل للبكتيريا ومن 1 × 10⁶ إلى 5 × 10⁶ زيمبابوي/مل للخميرة.
      ملاحظة: يجب تحديد حجم الثقافة وومبومو لقياس امتصاص وفقا لنوع جهاز المطياف الضوئي تستخدم.
   8. دوامة مرق الميكروبية لمدة 5 ثوان لتحسين تشتت الكائنات الدقيقة وتغرق بإيجاز مسحه القطن معقمة في هذا التعليق للميكروبات. إزالة فائض السائل من المسحة بالضغط عليه ضد جدار الأنبوبة التي تحتوي على الثقافة.
   9. خط تعليق مرق الميكروبية مع مسحه القطن معقم على سطح اللوحات حساب السياحة الفرعي في 3 طائرات لتغطية سطحها كله مع الكائنات الدقيقة وأتركها تجف لمدة 5 دقائق بعد التطعيم بالتساوي.
      ملاحظة: لإزالة أي رطوبة، لوحات السياحة يجب أن توضع مفتوحة في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة قبل التلقيح.
   10. تعقيم زوج من ملاقط أغرق لهم في كوب مع الإيثانول 96% ويلهب لهم ثم مع موقد بنسن أو موقد الكحول.
   11. ضع الأقراص العينة لاختبار ومراقبة القرص في وسط لوحات حساب السياحة الفرعي باستخدام زوج ملاقط معقمة.
   12. احتضان هوائيا لوحات حساب السياحة الفرعي في وضع مقلوب عند 37 درجة مئوية ح 24.
       ملاحظة: لتفادي أي خطر التلوث، ينصح لاحتضان لوحات حساب السياحة الفرعي في وضع مقلوب. ومع ذلك، إذا كان القرص العينة يفصل من لوحات حساب السياحة الفرعي، غير تنفيذ هذه الخطوة في وضع مقلوب. في هذه الحالة، من المستحسن أن تجف اللوحات في هود الاندفاق الصفحي. يجب إجراء هذا الاختبار مضادات الميكروبات في كوادريبليكاتي على الأقل في أيام مختلفة لضمان إمكانية تكرار نتائج.
2. فحص تركيز تعليق الميكروبية ونقاء
   ملاحظة: الخطوات التالية ضرورية من أجل التحقق من أن تركيز الميكروبية مصممة مع جهاز المطياف الضوئي في خطوة 3.1.7 الصحيح، وضمان عدم وجود أي تلوث البيئة الميكروبية. ويمكن الكشف عن تلوث البيئي الميكروبات بسهولة بظهور أنواع مختلفة من المستعمرات الجرثومية بعد 24 ساعة ثقافة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكفل أي تلوث الميكروبية المتوسطة TSB خلال التلاعب به في تخفيف المسلسل عشرية مع لوحة تحكم TSB سلبية.
   1. الاستغناء عن TSB العقيمة (أعد الخطوة 3.1.4) في أنابيب معقمة ميكروسينتريفوجي باستخدام ميكروبيبيتي مع نصائح يعقم مناسبة في ظروف معقمة. واحد منهم سوف تستخدم كعنصر تحكم TSB سلبية.
   2. إجراء تخفيف المسلسل عشرية مع تعليق مرق الميكروبية المستخدمة في الخطوة 3.1.9 في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة التي تتضمن TSB.
   3. نشر 100 ميليلتر من كل تمييع في لوحات حساب السياحة الفرعي باستخدام ملعقة دريجالسكي قبل تعقيم أو أداة بديلة. وانتشرت أيضا 100 ميكروليتر من المتوسطة TSB دون الكائنات الدقيقة (أعد الخطوة 3.2.1) على طبق حساب السياحة الفرعي كلوحة تحكم TSB سلبية.
   4. احتضان هوائيا لوحات تسا هوائيا في 37 درجة مئوية ح 24.
   5. حساب عدد المستعمرات للتحقق من أن زيمبابوي/مل مماثلة لتلك المحددة في الخطوة 3.1.7.
   6. تحقق من أنه لا يوجد أي تلوث البيئة الميكروبية على لوحات حساب السياحة الفرعي بنوع واحد فقط من المستعمرات.
   7. تحقق من أنه لا يوجد أي تلوث جرثومي على لوحة التحكم السلبي TSB عرض لا مستعمرات

4-قياس نشاط مضادات الميكروبات على الأسطح المادية (أسلوب الاتصال)

ملاحظة: عند الاتصال السطحية قد تكون الميكروبات هي الآلية الرئيسية لبعض المواد المتقدمة، يمكن أن توفر وسيلة الاتصال معلومات مفيدة جداً حول قدرة الميكروبات من هذه المواد. في هذا الأسلوب، والكائنات الحية الدقيقة وتوضع مباشرة على سطح المادة ويمكن تحديده تثبيط النمو بعد فترة معينة من الزمن.

1. الإجراءات الأولية
   1. إعداد والاوتوكلاف TSB اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   2. من أجل TSB في أنبوب الطرد مركزي قبل تعقيم 50 مل مع ماصة معقمة قبل مصلية تحت ظروف معقمة باستخدام موقد بنسن أو غطاء الاندفاق الصفحي.
   3. الثقافة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة اختبار هوائيا بين عشية وضحاها في الأنبوب مع TSB في شاكر مداري (140 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
   4. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 20 مل TSB في أنبوب الطرد مركزي قبل تعقيم 50 مل بتركيز من ما يقرب من 10⁶ زيمبابوي/مليلتر (مصممة مع جهاز المطياف الضوئي في 540 نانومتر).
      ملاحظة: يجب تحديد حجم الثقافة وومبومو لقياس امتصاص وفقا لنوع جهاز المطياف الضوئي تستخدم.
   5. إجراء تخفيف المسلسل العشرية لهذه الثقافة في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة التي تتضمن TSB. نشر 100 ميليلتر للثقافة في لوحات حساب السياحة الفرعي واحتضان أنه هوائيا في 37 درجة مئوية ح 24.
   6. حساب عدد المستعمرات لضمان تركيز خلية أولية زيمبابوي/mL تقريبا 1 × 10⁶
   7. 4 مكان مراقبة الأقراص للعد الميكروبي بعد 24 ساعة و 4 أقراص عينة من كل نوع من المواد المختبرة للعد الميكروبي بعد يفصل ح 24 في الآبار للوحة 48-جيدا العقيمة.
   8. "الماصة؛" 150 ميليلتر من تعليق الميكروبية على كل سطح القرص.
2. الميكروبية تعتمد على مراقبة واختبار مواد (بعد 24 ساعة)
   1. بعد خطوة 4.1.6، احتضان هوائيا الأقراص العينة 4 المتبقية في لوحة 48-جيدا في 37 درجة مئوية ح 24.
      ملاحظة: يمكن تعديل هذا الوقت حضانة 24 ساعة من أجل دراسة تثبيط النمو في أوقات أقصر أو أطول.
   2. بعد 24 ساعة حضانة، "الماصة؛" ميليلتر 850 من PBS العقيمة على سطح الأقراص العينة 4 ومزجها مع 150 ميليلتر من تعليق الميكروبية.
   3. جمع الخليط تعليق برنامج تلفزيوني/الميكروبية وكل قرص من لوحة 48-جيدا وتحويلها إلى أنبوب معقم قبل 10 مل.
   4. دوامة الخليط تعليق برنامج تلفزيوني/الميكروبية وكل قرص لمدة 1 دقيقة، sonicate أنه في 50 هرتز لمدة 5 دقائق ودوامه مرة أخرى 1 دقيقة لضمان بقاء الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء لا تلتزم بسطح المادة.
   5. إجراء تخفيف المسلسل العشرية لكل ثقافة سونيكاتيد في أنابيب ميكروسينتريفوجي العقيمة التي تتضمن TSB وانتشر 100 ميليلتر للثقافة في لوحات حساب السياحة الفرعي واحتضان أنه هوائيا في 37 درجة مئوية ح 24.
   6. حساب العدد المستعمرات، وهي عدد الكائنات الدقيقة قابلة للتطبيق على كل سطح القرص العينة والتحكم. أعرب عن هذا العدد من الخلايا قادرة على البقاء في (زيمبابوي/mL).
   7. التقاط صورة الثقافة الميكروبية النهائي للأقراص العينة والتحكم.

5-الميكروبات نتائج التحليل

رقم 1: قياسات للعرض تم تسويتها لمضادات الميكروبات "هالو". ويبين هذا الفريق قطر منطقة تثبيط (د_عز) وقطر القرص (d). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

1. نشر أسلوب تحليل النتائج
   1. قياس قطر منطقة تثبيط (د_عز) وقطر القرص (د) (انظر الشكل 1) مع قدمه ذات الورنيّة رقمية.
      ملاحظة: يتم تشكيل تثبيط المنطقة أو مضادات الميكروبات "هالو" نتيجة لتثبيط نمو الجراثيم التي تنتجها الميكروبات القرص المادية (انظر الشكل 1). من الممكن أن نلاحظ أن هناك منطقة الطوق شفافة قريبة من العينة بالمقارنة مع بقية اللوحة فيها الكائنات الحية الدقيقة قد نمت بشكل صحيح (منطقة معتمة).
   2. تحديد عرض مضادات الميكروبات "هالو" (شمال غرب_هالو) لكل قرص تم تسويتها عن طريق تطبيق المعادلة (1).
      (1)
   3. تحديد المتوسط والانحراف المعياري لعرض القيم nw_هالة الميكروبات "هالو" مع 4 يحدد لكل عينة تم تسويتها.
   4. التقاط صورة من ثقافة الميكروبية النهائي مع القرص المادية.
      ملاحظة: قطر منطقة تثبيط (د_عز) وقطر القرص (د) يمكن أيضا أن يقاس من الصورة المأخوذة في الخطوة 5.1.4 باستخدام برامج معالجة صور مناسبة.
2. تحليل نتائج أسلوب الاتصال
   1. تحديد عدد الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء استردادها وفقا للمعادلة (2).
      (2)
      ملاحظة: هنا، N هو عدد الكائنات الدقيقة قابلة للتطبيق استرداد كل سم² لكل عينة الاختبار؛ ج هو تعداد الصحن؛ د هو عامل التخفيف؛ (أ) هو المساحة السطحية لاختبار العينة في سم² مصممة مع قطر القرص عينة.
   2. تحديد فقدان الصلاحية (LV) تعكس تثبيط نمو الخلايا عن طريق تطبيق المعادلة (3).
      (3)
      ملاحظة: هنا، هو ج في زيمبابوي/mL•cm²، تعافي من العينات المراقبة بعد 24 ساعة؛ متوسط عدد الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء (N) S هو عدد الكائنات الدقيقة قادرة على البقاء (N) في زيمبابوي/mL•cm²، تعافي من عينات الاختبار بعد 24 ساعة.
   3. تحديد المتوسط والانحراف المعياري الخسارة للبقاء مع القيم LV(%) العزم 4 لكل عينة.

Results

كان يعمل هذا البروتوكول، على سبيل مثال، لاختبار قدرة الميكروبات المواد 4 مع الطبيعة الكيميائية المختلفة ضد 3 يوصي بالكائنات الدقيقة: الإشريكيّة القولونية، المكوّرات العنقودية الذهبيةو المبيضات البيض . أظهرت نتائج الاختبارات نشر القرص أجار (طريقة الانتشار) النشاط غير مضادات الميكروبات للمواد الأولى (M1) كما أنه حدث في قرص التحكم (C، لا تظهر الصورة) وزيادة النشاط المضاد للبكتيريا ضد إيجابية وسلبية الغرام البكتيريا للمواد الأخرى 3 M2, M3 و M4 (انظر الشكل 2).

رقم 2: نتائج أسلوب نشر الميكروبات. يظهر هذا الفريق طريقة نشر الميكروبات 4 المادية (M1, M2, M3 و M4) الأقراص (قطرها 10 مم × سمك 1 مم) ضد س المذهبة و كولاي بعد 24 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الشكل 3 عروض طبيعية مختلفة من مضادات الميكروبات "هالو" (شمال غرب_هالو) مثال مختلف المواد M1، M2 و M3 و M4 ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام محسوبة بالمعادلة (1). ومع ذلك، لم يستطع تعوق نمو الخميرة المبيضات البيض (الصور لا تظهر) أي المواد 4.

الشكل 3: نتائج انتشار الميكروبات "هالو". ويبين هذا الفريق تطبيع "هالو" (شمال غرب_هالو) لكل المواد (M1, M2, M3 و M4) القرص (قطرها 10 مم × سمك 1 مم) ضد س المذهبة و كولاي بعد 24 ساعة حضانة. الاختلافات معتدا به إحصائيا (p < 0.01). ومع ذلك، أظهرت العينة M1 أي نشاط مضادات الميكروبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كما سجلت نتائج أسلوب الاتصال نشاط غير مضادات الميكروبات للمواد الأولى (M1) كما أنه حدث في عنصر تحكم القرص (ج) وتزايد النشاط المضاد للبكتيريا ضد جرامبوسيتيفي والبكتيريا سلبية الغرام لغيرها من المواد 3 (انظر الشكل 4).

الشكل 4: الميكروبات الاتصال نتائج الأسلوب. ويبين هذا الفريق لوحات كل منها 90 مم 4 المادية (M1, M2, M3 و M4) نشاط مضادات الميكروبات السطحية المقايسة وفقا ISO 22196:2007 بعد 24 ساعة من الحضانة س المذهبة و كولاي (عامل التخفيف من 10^-4). ج من البكتيريا قادرة على البقاء استردادها من القرص التحكم بعد 24 ساعة حضانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مصممة فقدان الصلاحية (%) حسب المعادلة (2) و (3) كما هو مبين في هذا البروتوكول (انظر الشكل 5).

الرقم 5: فقدان الصلاحية بأسلوب الاتصال- ويبين هذا الفريق فقدان الصلاحية (%) M1 و M2 M3 M4 ضد س المذهبة و كولاي على أسطح المواد. أظهرت العينة M1 أي نشاط مضادات الميكروبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ومع ذلك، لم يستطع تعوق نمو الخميرة المبيضات البيض بطريقة الاتصال أما (الصور لا تظهر) أي المواد 4. ولذلك، 3 من هذه المواد المتقدمة 4 أظهرت نتائج إيجابية مضادات الميكروبات ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام وهكذا يمكن أن تكون مفيدة جداً للعديد من تطبيقات الهندسة الحيوية مع متطلبات عالية النشاط المضاد للبكتيريا. ومع ذلك، لم يستطع تعوق نمو الخميرة أي المواد 4.

Discussion

يمكن تحليل نشاط مضادات الميكروبات لمواد متقدمة جديدة بموجب هذا البروتوكول سهلة لمتابعة تتكون من 2 إجراءات تكميلية تستند إلى الأساليب القائمة 2: نشر القرص أجار اختبار³⁸ وقياس نشاط مضادات الميكروبات في مواد السطوح وفقا للمعيار ISO 22196:2007³⁹.

في هذا المجال البحثي، العديد من اختبارات مضادات الميكروبات التي ذكرت في الأدبيات تعتمد اعتماداً كبيرا على المقايسة. ولذلك، من المهم أن تكون مفصلة جداً ويتفق البروتوكولات في مكان عبر المختبرات. هذه المادة خطوة في هذا الاتجاه. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تكون مفيدة جداً للعديد من الباحثين الذين هم أقل خبرة في هذا الميدان وتتطلب إجراءات معمقة، خطوة بخطوة لمتابعة لنتائج دقيقة.

يمكن استخدام هذا البروتوكول مع العديد من أنواع المواد يقتطع من الأشكال القرص قطرها 10 ملم. يمكن تورم المواد هشة في مذيب مناسب ح 1 لجعل عملية القطع أسهل. وهكذا، يمكن رطب ماء مواد مثل الجيناتيس في الماء المقطر يعقم. ويمكن استخدام المذيبات الأخرى، مثل الإيثانول، كيتون، والميثان، إلى تضخم المواد عمود المصباح ح 1 قبل قصها. ومع ذلك، لا تحتاج بعض المواد مثل poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) منتفخة وأنها يمكن أن تخفض مباشرة. بعد ذلك، من المهم جداً لتجف الأقراص المادية العينة في فرن فراغ وتعقيم كل عينة مع الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية ح 1 لتجنب أي خطر التلوث.

هذا البروتوكول وتوصي إدارة أمن النقل و TSB كثقافة وسائل الإعلام، واستخدام الثقافات نقية للكائنات الدقيقة 3 للوصول إلى مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة: البكتيريا إيجابية البكتيريا سلبية الغرام الإشريكيّة القولونية، المكوّرات العنقودية الذهبية، والخميرة المبيضات البيض. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام وسائل الإعلام الثقافة البديلة والكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تحتاج إلى احتضان مختلف الظروف مع هذا البروتوكول. في بعض الأحيان، يتم اختبار الكائنات الدقيقة 1 فقط الحصول على فكرة أولية لنشاط مضادات الميكروبات من مادة جديدة.

المواد التي تبين نشاط مضادات الميكروبات قوية ضد 3 الموصى بها مختلفة ينبغي اختبار أنواع من الكائنات الحية الدقيقة ضد العوامل الممرضة المقاومة للمضادات الحيوية مثل مقاومة للميثيسيلين ابيديرميديس المكوّرات العنقودية (مرسى)، التي وقد استخدمت بنجاح مع هذا البروتوكول. أخرى الكائنات الدقيقة المقاومة للعقاقير الهامة التي تتسبب في الكثير من القلق هي مثسلين مقاومة إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبية (الجرثومة) ومقاومة للفانكوميسين انتيروكوكساي (فري) و الغرام الزائفة الزّنجاريّة^40،41.

لا يمكن اختبار تثبيط بيوفيلم ونشاط مضادات الميكروبات لمواد ضد أنواع أخرى من الكائنات المجهرية مثل الفيروسات والطفيليات مع هذا البروتوكول. ومع ذلك، يوفر هذا البروتوكول نقطة انطلاق مفيدة للغاية لدراسة الميكروبات جديدة متقدمة المواد.

في اختبار نشر القرص أجار مضادات الميكروبات، يحدث خطوة حاسمة عندما القرص عينة أن توضع في وسط اللوحة لأن بعض المواد أمثال حالما تحصل على اتصال مع وسائط الإعلام أجار. وفي هذه الحالة، من المستحسن استخدام زوج عقيمة من ملاقط تتكشف العينة بعناية. من ناحية أخرى، في أسلوب الاتصال، من الأهمية بمكان أن يغسل عنصر التحكم والأقراص العينة جيدا مع برنامج تلفزيوني قبل بيبيتينج منهم أربع مرات يليه فورتيكسينج قوية و sonication بغية التأكد من أن لا من الكائنات الدقيقة قابلة للتطبيق تظل يلتزم بالمواد السطح.

ويمكن استخدام هذا البروتوكول الفيديو في العديد من تطبيقات الهندسة الحيوية، مثل الهندسة البيولوجية وهندسة الأنسجة وتسليم العقاقير الخاضعة للمراقبة، ومواد التعبئة والتغليف، ومعالجة مياه الصرف الصحي والزراعة التي تستخدم المواد الحيوية مع درجة عالية قدرة الميكروبات المرغوب فيه.

النتائج التي تم الحصول عليها مع أحكام هذا البروتوكول النوعية (الصور) والكمية (عرض طبيعية للبكتيريا "هالو"، وفقدان الصلاحية) مع تحليل جيد في إمكانية تكرار نتائج لها (يعني ± الانحراف المعياري). عند مقارنة مختلف المواد، يجب تحليل هذه القيم الوسطية التي تم الحصول عليها مع تحليل نتائج أسلوب نشرها والاتصال باتجاه واحد ANOVA، يليها تحليل الوظائف المخصصة لتركيا، من أجل دراسة إذا كانوا، إحصائيا، إلى حد كبير مختلفة (ف < 0.01).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
لكمة أسطوانية			بقطر 10 مم
	سوريا جينلاب	P101	قطر 90 مم ،
أجار الصويا الترژيتي المعقم (TSA)	Liofilchem	610052	وسط مجفف 500 جم (مسحوق)
مرق الصويا Tryptic (TSB)	Liofilchem	610053	متوسط مجفف 500 جم (مسحوق)
مسحة قطنية معقمة	EUTOTUBO	300200
طرد مركزي أنابيب	VIDRA FOC ، SA	429900	50 مل ، معقم
الإيثانول	VWR	83813360	الإيثانول المطلق
معقم 48 بئرا صفيحة	COSTAR	3548	قاع مسطح مع غطاء ، معالجة ثقافة الأنسجة ، غير بيروجيني ، البوليسترين
زوج من الملقط	BRAUN	24612036
ملحي معقم بدون أسنان (PBS).	VWR	E404-100TAPBS
فرن فراغ مع مضخة تفريغ متصلة	JP Selecta ، SA	5900620
غطاء التدفق الصفحي	TELSTAR Technologies ، SL	TELSTAR AH-100	مصباح 12.0 واط من الأشعة فوق البنفسجية من
الدرجة الثانية خزانة السلامة البيولوجية	LABOGENE	MARS 1200
حاضنة	ASTEC CO، LTD	SCA-165DR
خلاط دوامة	Biosan	V-1 Plus
مقياس الطيف	Macherey-Nagel ، ألمانيا	Nanocolor UV / VIS II
Bunsen burner	JP Selecta ، SA	7001539
موقد الكحول	VIDRA FOC ، SA	1658/20	في حالة ضرورة إجراء التعقيم داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة
الثانية شاكر مداري	sartorius stedim	8864845
Sonicator	SELECTA	3000617	50/60 هرتز
الماسك الرقمي	ACHA	17-260	0-150 مم
ماصة مصلية	Fisherbrand	13-678-11	25 مل ،
ماصة مصلية		VWR 612-4950	5 مل ،
ماصة مصلية	VWR	612-5541	10 مل ، معقمة
ماصة دقيقة	جيلسون	FA10005P	Pipetman L P200L ، بلاستيك 20-200 & L
Micropipette	GILSON	F123602	Pipetman P1000 ، 200-1000 & L
ماصة دقيقة	جيلسون	FA10016	Pipetman L P12X300L ، 20-300 & micro ؛ L
نصائح الماصة الدقيقة	LABBOX	TIBP-200-960	2-200 & micro ؛ L
أطراف الماصة	الدقيقة LABBOX	TIBP-1K0-480	100-1000 & micro ؛ L
أنبوب معقم مسبقا   ؛	INSULAB	301402	10 مل & nbsp ؛
كاميرا الصور	Canon EOS 5D		يمكن أيضا استخدام أي كاميرا عالية الدقة
البكتيريا موجبة الجرام المكورات العنقودية الذهبية < / م >		؛ سلالة V329	Cucarella et al. J Bacteriol< / em> 183 (9)< / strong>,  2888– 2896 (2001)
البكتيريا سالبة الجرام الإشريكية القولونية< / em>	Colecció n Españ ola de Cultivos Tipo CECT	CECT 101
خميرة المبيضات البيضاء < / em>	Colecci ó ؛ n Españ ola de Cultivos Tipo CECT	CECT 1394
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة	DASLAB	175508	1,5 مل
الأوتوكلاف	JP Selecta ، SA	4002136
مقياس الطيف الضوئي كوفيتس	UVAT Bio CB	F-0902-02	4,5 مل
ملعقة Drigalski	LABBOX	SPRP-L05-1K0	معقمة ، يمكن التخلص منها   ؛
كرات زجاجية (قطر 2 مم)	Hecht Karl	1401/2	جهاز قابل للتعقيم ، جهاز بديل لأكياس الأوتوكلاف ملعقة Drigalski
	DELTALAB	200318	لتعقيم المخلفات الميكروبيولوجية أو المواد الملوثة
جهاز تعبئة الماصة الإلكترونية	زجاجة مختبر JetPip	JET BIOFIL
بخيط ISO ، متخرج ، بورسليكات 3.3	LABBOX	SBG3-100-010	100 مل ، لوسائط التعقيم زجاجة
مختبر بخيط ISO ، متخرجة ، بورسليكات 3.3	LABBOX	SBG3-250-010	250 مل ، لوسائط ثقافة التعقيم
زجاجة مختبر بخيط ISO ، متخرجة ، بورسليكات 3.3	LABBOX	SBG3-500-010	500 مل ، لوسائط التعقيم زجاجة
مختبر بخيط ISO ، متخرجة ، بورسليكات 3.3	LABBOX	SBG3-1K0-010	1000 مل ، لوسائط ثقافة التعقيم
قفازات اللاتكس	DENIA	22780000000
شريط مؤشر للتعقيم	LABBOX	STAP-A55-001	شريط ذاتي اللصق مع ورق مشرب يتحول إلى اللون عند التعرض لعملية التعقيم.
رف أنبوب اختبار عالمي	LABBOX	MTSP-001-001	لعقد أنابيب الطرد المركزي رف
أنبوب الطرد المركزي	الدقيق VWR	211-0210	لعقد أنابيب الطرد المركزي
الدقيقة حلقة معقمة	ACEFE SA	100140055	10 & L من القدرة على الاستزراع الميكروبي
المواد: M1	Universidad Cat ó. lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV) نوع		المواد 1   ؛
المواد: M2	Universidad Cat & oacute ؛ lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV) نوع		المواد 2   ؛
المواد: M3	Universidad Cat ó. lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)		نوع المواد 3
مادة M4	Universidad Cat ó ؛ lica de Valencia San Vicente Má rtir (UCV)		نوع المادة 4   ؛
المادة C	Universidad Cat & oacute ؛ lica de Valencia San Vicente Má مادة التحكم rtir (UCV)