Method Article

إعداد وضع الأنسجة حاسة الشم الطرفية الجزيئية والتحليل المناعي في المورفولوجية

DOI:

10.3791/57716

⸱

June 13th, 2018

 , 
1Department of Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا للمرحلة وتشريح وضع الأنسجة حاسة الشم من الأنواع المورفولوجية . تشريح الأنسجة يمكن استخدامها في وقت لاحق للتحليلات الجزيئية، مثل كمية RT-PCR (عكس النسخ-البلمرة المتسلسل) أو الحمض النووي الريبي التسلسل (رناسيق)، فضلا عن التحليلات في فيفو مثل إيمونوهيستوتشيميستري أو في الموقع التهجين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام حاسة الشم المورفولوجية نظام يستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الأعصاب التنموي ونظم علم الأعصاب، وكذلك العصبية والسلوك وتطور السلوكية. بيت المورفولوجية حاسة الشم أنسجة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (أورنس) التي كشف الإشارات الكيميائية المتطايرة بالإضافة إلى الخلايا العصبية الحسية الطاقة المائية والحرارية. في هذا البروتوكول، يصف لنا التشريح لتطوير النسيج حاسة الشم الطرفية من الأنواع المورفولوجية الكبار. أولاً نحن تصف كيفية المرحلة واليرقات المورفولوجية ، متبوعاً بتشريح القرص باللوامس من المراحل المبكرة الخوادر، متبوعاً بالتشريح للهوائيات من مراحل منتصف الخوادر والكبار في السن. نعرض أيضا الأساليب التي يمكن أن تستخدم في الأعمال التحضيرية في التقنيات الجزيئية، مثل استخراج الحمض النووي الريبي لبكر قرة أو رناسيق أو إيمونوهيستوتشيميستري. يمكن أيضا تطبيق هذه الأساليب للأنواع المورفولوجية الأخرى بعد يتم تحديد أوقات التنمية الخوادر إبلاغها، وتحسب كل المراحل للشيخوخة المناسبة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام حاسة الشم المورفولوجية نظام يستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الأعصاب التنموي ونظم علم الأعصاب، وكذلك العصبية ودراسات السلوك وتطور السلوكية1،2،3، 4. البيت المورفولوجية حاسة الشم أنسجة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (أورنس) التي كشف الإشارات الكيميائية المتقلبة بالإضافة إلى5،1،الخلايا العصبية الحسية الطاقة المائية والحرارية6. والهدف العام من هذه المخطوطة شرح كيفية المرحلة وتشريح وضع الأنسجة حاسة الشم الخوادر والكبار في الأنواع <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول التالي ينسجم مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها "لجنة أخلاقيات البحوث جامعة ديوك".

1-إعداد الأنسجة والتدريج التنموية لعذراء melanogaster المورفولوجية

  1. أولاً، تحديد كم عدد الذباب سيكون ضروريا للتشريح. RT-PCR ورناسيق، جمع 100-200 أقراص باللوامس وهوائيات من الأفراد التي ضرورية في مراحل بريبوبال، ح 8 الإدارة العامة الاتحادية، ح 40 الإدارة العامة الاتحادية، والكبار. ل immunohistochemistry، تشريح الفرد 10-20.
  2. تنظيف جميع المواد، بما في ذلك منصات التشريح والملقط، استخدام مناديل مع 70% EtOH. إذا كانت المواد تشريح لاستخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي وتنظيف كل شيء مع نيوتراليزيرس رناسي وجعل جميع الحلو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشريح الأنسجة حاسة الشم النامية يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي تليها RT-PCR لتقييم التعبير الجيني أو يمكن اتخاذها من خلال بروتوكولات immunohistochemistry لتحديد نمط التعبير، والتعريب الخلوية الفرعية من جينات الفائدة. في هذا القسم، نقدم نتائج تمثيلية من أما بروتوكول. الشكل رقم 1 هو الممثل الكمية RT-PCR عرض النسخ من مستقبلات سطح الخلية والجينات مستقبلات الشم في البرية من نوع هوائيات الكبار. ويبين الشكل 2 ح 6-8 والذباب .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول مورد مفيد لمختبرات المهتمة في تحديد البرامج الوراثية والنسخي العاملة في تطوير أنسجة حاسة الشم المورفولوجية ، فضلا عن إجراء تحليل مقارن لهذه البرامج عبر المورفولوجية الأنواع. أنها مفيدة بشكل خاص إذا كانت هناك حاجة ملامح نظم المستوى النسخي من مراحل إنمائية مختلفة تمهيدي للدراسات المستقبلية. البروتوكول هو موضح هنا يوضح كيفية المرحلة وعزل الأنسجة حاسة الشم من المورفولوجية للحصول على عينات من أربع مراحل رئيسية لتطوير نظام حاسة الشم من قبل الزخرفة للتفريق بين طرفية، لاستخدامها في تطوير.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية" إلى Pelin جيم فولكان (ديب-1457690).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X محلول ملحي مخزن بالفوسفاتGibco70011-044تمييع إلى 1X في الماء الخالي من RNase
CO2 < / خزان >فرعيغاز الهواءCD R200
ملقطان حادان (Dumont # 55)أدوات العلوم الدقيقة11255-20
TrizolInvitrogen15596-026حلول عزل الحمض النووي الريبي
تشريح المجهر
دلو صغير مع ماصات دقيقة ثلج
P20 و P200 وأطراف
1.7 مل أنابيباشتر نوكلياز مجاني للحصول على أفضل النتائج
0.2 مل أنابيب PCR مسحوق
ParaformaldehydePolysciences380
10٪ Triton X-100TeknovaT1105خفف إلى 0.2٪ من الحجم: الحجمي / الحجمي في 1X PBS
2 "أطباق
55 مم ورق ترشيحWhatman1001-055بلل بالماء وضعه في طبق بتري للحفاظ على رطوبة الشرانق
حاضنة
منزوعة الأيونات H2Oقم بشراء خالية من النوكلياز أو معالجتها باستخدام DEPC
Sylgard 184 مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكونDow Corningلاستخدامها في صنع منصات التشريح من أغطية ألواح Terizaki.
صواني MicroWell الصغيرة مع الأغطية يمكنNunc438733لصنع منصات تشريح السيليكون
الأرانب المضادة للجسم المضاد ل GFPMBL international corporPM005الجسم المضاد الأساسي
للفأر المضاد للجثب CD2AbD seroTecMCA154RHDLالجسم المضاد الأساسي
ADL195 (مضاد لللامين ، الماوس)دراسات Dev حظر hydomaالجسم
المضاد الأساسي ADL195-sAlexa Fluor® 488 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L)invitrogenA11008الجسم المضاد الثانوي
Cy3 الماعز المضاد للفأر IgGجاكسون ImmunoResearch115-166-003الجسم المضاد الثانوي
Triton X-100 ، منظف بدرجة البروتين ، محلول 10٪ ،منظف648463CALBIOCHEM
مختبر الدوارالحراري العلمي
الماء الخالي من النوكليزGrowcells.comNUPW-0125الخفيفة للمياه
VWR82003-822لتنظيف مستلزمات التشريح
Superscript IIinvitrogen18064014Reverse Transcriptase   ؛
QIAshredder (50)الحمض النووي الريبيQIAGEN79654
Oligo(dT)12-18 PrimerRTlife technologies18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)استخراج الحمض النووي الريبيQIAGEN74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 مل) (500 RXN)qPCRRoche04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER  كيو بي سي آرروش06402712001
لايت سايكل 480 - لوحة متعددة الآبار 96qPCRروش04729692001
NEBNext عالي الدقة 2X PCR ماستر ميكسqPCRNEBM0541S
Microfuge بتري25 درجة مئوية استخدام أغطية معقم مفلتر الدوار مساحات المناديل استخراج

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
  2. Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olf....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Olfactory TissuePeripheral Olfactory SystemAntennal Disc DissectionPupal Development StagingRNA Extraction ProtocolImmunohistochemistry AnalysisAntenna Dissection MethodDevelopmental Neurobiology TechniquesGene Expression AnalysisSensory System Development

Related Articles