تحدي الشباب من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ جديدة يمكن أن تكشف عن معلومات هامة بشأن كيفية البيئة sculpts مصير الخلايا العصبية والنضج. يصف هذا البروتوكول إجراء الحصاد السلائف إينتيرنيورون من مناطق محددة من الدماغ وزرع لهم أما هوموتوبيكالي أو هيتيروتوبيكالي في دماغ الجراء بعد الولادة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحديد مصير الخلايا العصبية ونضوج يتطلب تفاعل معقدة بين البرامج الوراثية والبيئية الإشارات. ومع ذلك، مقدر أدوار جوهرية مقابل الآليات الخارجية التي تنظم هذه العملية التمايز معضلة لجميع نيوروبيولوجيستس التنموية. يتم تكبير هذه المسألة جابايرجيك إينتيرنيورونس، سكان خلية غير متجانسة بشكل لا يصدق أن يولد من هياكل الجنينية عابرة والخضوع لمرحلة المهاجرة التي طال أمدها لتفريق طوال telencephalon. لاستكشاف مدى اختلاف الدماغ البيئات تؤثر على مصير إينتيرنيورون والنضج، قمنا بتطوير بروتوكول لحصاد السلائف المسمى فلوريسسينتلي إينتيرنيورون غير ناضجة من مناطق محددة من الدماغ في الفئران حديثي الولادة (P0-P2). في هذا العصر، إينتيرنيورون الهجرة أوشك على الاكتمال ويقيمون هذه الخلايا في بيئاتها يستريح النهائي مع التكامل متشابك قليلاً نسبيا. عقب مجموعة من الحلول خلية واحدة فقط عن طريق التدفق الخلوي، هي زرع هذه السلائف إينتيرنيورون إلى P0-P2 wildtype الجراء بعد الولادة. قبل تنفيذ كل هوموتوبيك (مثلاً، قشرة إلى قشرة) أو هيتيروتوبيك (مثلاً، اللحاء إلى الحصين) عمليات الزرع، يمكن للمرء أن تقييم كيفية تحدي إينتيرنيورونس غير ناضجة في بيئات جديدة في الدماغ يؤثر على مصيرهم، والنضج، ودمج الدوائر. يمكن حصادها في الفئران الكبار العقول وجزيئي مع طائفة واسعة من التحليل بوستوك على الخلايا المطعمة، بما في ذلك المناعي، الكهربية والنسخي التنميط. ويوفر هذا النهج العام المحققون مع استراتيجية للاعتداء بيئات الدماغ مختلفة كيف يمكن التأثير على الجوانب العديدة للتنمية العصبية وتحديد ما إذا كانت الخصائص العصبية تدفعها أساسا البرامج الوراثية ماثلة أو منبهات بيئية.
المقدمة
الوظيفة القشرية السليم يتطلب توازناً بين الإسقاط ضادات الخلايا العصبية والمثبطة جابايرجيك إينتيرنيورونس، سكان الغاية غير متجانسة مع مورفولوجيس متميزة، الخصائص الكهربية، والاتصال والكيميائية العصبية علامات. ارتبط وضع غير طبيعي ووظيفة إينتيرنيورونس (ومجموعات فرعية محددة إينتيرنيورون) بل اضطرابات نفسية مثل الفصام، التوحد والصرع1،،من23. وعلاوة على ذلك، العديد من الجينات المتورطين في هذه الاضطرابات الدماغ هي إثراء بقوة في إينتيرنيورونس الشباب4. وبالتالي، فهم أكبر للآليات التي تنظم تحديد مصير إينتيرنيورون والنضج ضروري لفهم التطور الطبيعي ومسببات محتملة للعديد من الأمراض في الدماغ.
إينتيرنيورونس forebrain يولدون أساسا من هذين الهيكلين الجنينية عابرة، الآنسي ووالذيليه امينينسيس جانجليونيك (MGE وفريق الخبراء الاستشاري، على التوالي). هذه الخلايا بوستميتوتيك (إينتيرنيورون السلائف) ثم الخضوع لمرحلة هجرة عرضية التي طال أمدها لتفريق في جميع أنحاء تيلينسيفالون حيث أنها الاندماج في مجموعة متنوعة واسعة من الدوائر. إينتيرنيورونس المستمدة من MGE تتألف من ثلاث مجموعات فرعية غير متداخلة إلى حد كبير، تعريف نيوروتشيميكالي: سريع التشويك بارفالبومين (PV+) إينتيرنيورونس، سريع-التشويك سوماتوستاتين (SST+) إينتيرنيورونس، والنتوءات أواخر العصبية النيتريك أكسيد إينتيرنيورونس synthase (ننوس+) التي تشكل الخلايا نيوروجليافورم واللبلاب هيبوكامبال. وحددت العديد من مختبرات عدة آليات داخل MGE التي تنظم قرارات مصير الأولية في PV+ أو درجة حرارة سطح البحر + إينتيرنيورونس، بما في ذلك التدرجات المكانية من مورفوجينس، وتاريخ الميلاد من السلائف إينتيرنيورون، ووضع شعبة العصبية 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-وقد اقترح أن إينتيرنيورونس التفريق في بادئ الأمر إلى 'فئات أساسية' وثم تنضج تدريجيا إلى 'فئات نهائي' كما أنها تتفاعل مع هذه البيئة11. الأدلة الحديثة تشير إلى أن بعض الأنواع الفرعية إينتيرنيورون ناضجة قد يكون وراثيا ماثلة كما تصبح هذه الخلايا بوستميتوتيك في امينينسيس جانجليونيك، مشيراً إلى أن أوائل البرامج الوراثية الجوهرية المحددة قد تلعب دوراً أكبر من أي وقت سبق 13من تقدير12،. بيد أن المسألة الرئيسية المتعلقة بكيفية تفاعل البرامج الوراثية الأصيلة التي مع منبهات البيئية إلى التمايز بالسيارة إلى أنواع فرعية متميزة إينتيرنيورون لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير.
العديد من الدراسات قد زرع الخلايا الجنينية MGE مباشرة إلى مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ، مع نتائج توافق الآراء المطعمة خلايا ناضجة، وإطلاق سراح غابا تمنع عموما في الدوائر المحلية الذاتية14،15، 16،17،،من1819. وهذه الملاحظات واعدة ولدت اهتماما كبيرا في استخدام الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك)-مشتقة إينتيرنيورونس لعلاج مجموعة متنوعة من أمراض المخ. ومع ذلك، عدد قليل جداً من هذه الدراسات تقييم ما إذا كانت هذه الخلايا المطعمة الناضجة إلى الأنواع المتوقعة من إينتيرنيورونس ناضجة، عنصرا حاسما عندما يكون أحد يفكر في النهج المتعدية.
لمعالجة كيفية تأثير البيئة إينتيرنيورون التمايز والنضج، تم استنباط استراتيجية زرع السلائف إينتيرنيورون غير ناضجة في بيئات جديدة في الدماغ من أجل دراسة ما إذا كانت إينتيرنيورونس المطعمة اعتماد ميزات المضيفة البيئة أو الاحتفاظ بميزات من البيئة المانحة20. زرع MGE ليست مناسبة لمعالجة هذه المسألة MGE يحتوي على عدد سكان مختلطة من إينتيرنيورون وجابايرجيك إسقاط الخلايا التي تفريق في أنحاء عديدة من مناطق الدماغ21. دون أن يعرفوا أن هاجروا فيها هذه الخلايا MGE، واحد يمكن عدم إجراء تقييم كامل لكيف تتأثر عمليات الزرع هذه البيئة الدماغ. قبل الحصاد السلائف إينتيرنيورون في تيميبوينتس بعد الولادة المبكرة، هو الالتفاف حول هذه المشكلة عن طريق الحصول على خلايا غير ناضجة أن أكملوا هجرتهم والتوصل إلى هدفهم الدماغ المنطقة ولكن الحد الأدنى من التفاعل مع البيئة. من خلال التركيز على سمات محددة من إينتيرنيورونس التي يتم التعبير عنها متباين بين مناطق الدماغ متميزة، واحد ثم تحديد كيفية تغيير بيئة المضيف خصائص إينتيرنيورون. ينبغي أن يكون النهج العام المبين في هذا البروتوكول تنطبق على أي محقق أن يريد دراسة الخلايا العصبية الشباب كيف تتصرف عندما طعن في بيئة جديدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع إجراءات تجريبية أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "المعاهد الوطنية للصحة"، ووافقت عليها NICHD رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (أكوك). يستخدم البروتوكول هو موضح أدناه Nkx2.1-لجنة المساواة العرقيةج/+؛ Ai9+/-- الجراء لحصاد السلائف المستمدة من MGE إينتيرنيورون، ولكن يمكن إجراؤها على أي خط الماوس مراسل الفلورسنت المرجوة. واستخدمت كل من الذكور والإناث المبكر الفئران بعد الولادة (P0-P2) عشوائياً للأنسجة المانحة والمضيفة.
1-حل إعداد
- إعداد السكروز الاصطناعي السائل الدماغي النخاعي (ساكسف) وفقا للوصفة التالية (وحدة في مم): 87 كلوريد الصوديوم، 26 NaHCO32.5 بوكل، 1.25 NaH2بو4، 0.5 كاكل2, 7 مجكل2، الجلوكوز 10، 75 السكروز مشبعة 95% O 2، 5% CO2 في pH = 7.4.
- ملء كوب مع 350 مل ddH نقية2س استناداً إلى حجم المطلوب النهائي (500 مل ساكسف ينبغي أن تكون كافية لليتر 1-2)، إضافة شريط إثارة مغناطيسية ووضع في الكأس على لوحة ضجة.
- وزن جميع الأملاح (كلوريد الصوديوم، ناكو3، بوكل، نة2بو4، الجلوكوز، السكروز)، في الوقت واحد، وإضافة إلى المياه وفقا للجدول التالي. ويمكن تعديل المبالغ تبعاً لحجم المطلوب النهائي.
كاشف الوزن الجزيئي تركيز (مم) غرام/500 مل كلوريد الصوديوم 58.44 87 2.54 بيكربونات الصوديوم 84.01 26 1.09 كلوريد البوتاسيوم 74.55 2.5 0.09 فوسفات الصوديوم مونوباسيك 119.98 1.25 0.08 الجلوكوز 180.16 10 0.9 السكروز 342.3 75 12.84 - فقاعة الحل مع 95% O2، 5% أول أكسيد الكربون2 (كاربوكسيجين) على الأقل 20-30 دقيقة قبل إضافة المقدار المناسب من كاكل2 (0.25 مل من حل م 1 ساكسف 500 مل) ومجكل2 (3.5 مل من حل م 1 ساكسف 500 مل) .
- تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني قياسي. إذا أعدت بشكل صحيح، أن الحل يجب أن يكون pH = 7.4.
- تحقيق الحل النهائي حجم 500 مل مع ddH نقية2س في اسطوانة تخرج.
- يمكن أن يكون ساكسف إعداد تصل إلى 1-2 في الأيام المقبلة. قبل الاستخدام، وضع على الجليد وفقاعة مع كاربوكسيجين لمالا يقل عن 15 دقيقة قبل بدء التشريح، والاحتفاظ بالزجاجة من ساكسف محتدما في جميع أنحاء التشريح.
2-تشريح إعداد
- ينبغي أن تكون الأدوات التالية للتعقيم/يعقم: منحنى واحد على الأقل الصغيرة الجميلة حادة مقص، ملقط غرامة 2 (نمط #5)، غرامة الملقط، الدماغ تمزيقها العفن ماتريسي والعديد من شفرات الحلاقة. ملعقة صغيرة لإزالة الدماغ من الجمجمة اختياري.
- قم بإعداد محطة العمل قرب مجاهر تشريح مع أطباق بتري (9 سم وأقطار 4 سم)، 50 مل مخروطية أنابيب بلاستيكية لجمع في المناطق المعزولة من المخ وكبيرة تتحمل نقل البلاستيك الممصات، كل ما تبقى على الجليد. إعداد عدة أنابيب 50 مل كامل من ساكسف كاربوكسيجيناتيد على الجليد. إذا كان تشريح أكثر من منطقة الدماغ، تأكد من أن بشكل صحيح ووضوح تسمية أنابيب جمع والماصات نقل لتجنب التلوث.
- وقد دلو الجليد إضافية للتخدير الجليد من الجراء عن طريق انخفاض درجة حرارة الجسم، وحقيبة سليم من نفايات الخطرة للتخلص من جثث.
- إعداد الزجاج المصقول النار باستور الماصات للأنسجة تريتوريشن. استخدام موقد بنسن تعقيم وشكل تلميح الماصة. إعداد عدة الماصات ذات الفتحات المختلفة وتتحمل: كبير (~ 600 ميكرون)، متوسطة (~ 300 ميكرومتر) والصغيرة (~ 100 ميكرومتر). اختبار التدفق من خلال نصائح استخدام المياه لضمان سرعة تريتوريشن مختلفة. مطلوب ماصة واحدة على الأقل من كل نوع لكل منطقة الدماغ معزولة، ولكن وجود عدد إضافي لكل حجم من أحجام يوصي في حالة انسداد أو كسر نصائح.
3-زرع إعداد
- استخدم ساحبة كهربائي لإعداد ميكروبيبيتيس الزجاج غرامة ذات الرؤوس. كسر أو مجسم مشطوف الحواف نصيحة لجعل نقطة زاوية حادة، مع تلميح وجود قطره ~ 20-40 ميكرومتر. بصريا تفقد النصائح مجهر للتأكد من لا الغبار أو جزيئات الزجاج المتبقية هي عرقلة الفتحة.
- باستخدام حقنه إبرة غرامة، تماما ملء ميكروبيبيتي الزجاج مع الزيوت المعدنية. إدراج في ميكروبيبيتي في جهاز نانوجيكت (أو أي جهاز آخر microinjection). الثالث نانوجيكت، تم إعداد البرنامج التالي: الحجم = 60 nL، معدل = 30، دورات = 25، تأخير = 1 s.
- تأمين نانوجيكت المناول المرتبط بقاعدة مغناطيسية، وضبط مناور حيث يشير نانوجيكت إلى أسفل، لا يميل على طول x أو y المحور.
- إرفاق بعض المعجون اللاصق (~ 1-2 سم على الجراء P0-P2) إلى الجزء العلوي من غلاف طبق بيتري إنشاء سطح مرتفعة لبقية الرأس ألجرو على.
- قص ~ 6-8 سم المشارب طويلة من مختبر الشريط وجعل ثقب على شكل الماس في الوسط. سيتم استخدام الشريط استقرار رأس ألجرو أثناء الإجراء، في حين تمتد الجلد أيضا والسماح للتصور سهلة المعالم والمنطقة المستهدفة.
- إعداد لوحة تدفئة بالقرب من محطة ضخ، وقم بتشغيل الإعداد 'منخفضة' قبل البدء بالحقن. تغطية لوحة المفاتيح مع بعض المناشف الورقية أو وسادة الحفاض.
- إذا كان أداء شروط زرع متعددة، وقد مقص صغيرة جاهزة لأداء القطع تو/ذيل للعلامة الجراء تلقي الحقن المختلفة.
4-إزالة الدماغ الماوس P0-P2
- حق قبل البدء في هذا الإجراء، ملء عدة أطباق بيتري مع برود، كاربوكسيجيناتيد ساكسف. أيضا ملء tube(s) جمع مع ساكسف ~ 25 مل.
- التفاف جرو P0-P2 في بعض بارافيلم أو القفازات ومكان ذلك بتغطية جيدة تحت الجليد. تعيين جهاز ضبط وقت لمدة 5 دقائق وبدء تشغيله. بعد ذلك الوقت، إزالة ألجرو والتحقق من أنها لا تستجيب معسر هيندباو.
- قطع رأس ألجرو وجمع الرأس في طبق بتري مليئة ساكسف. قطع الجلد على طول خط الوسط لفضح الجمجمة.
- موقع الافتتاح في الجمجمة في الحبل الشوكي هيندبرين/وإدراج واحدة من نهاية الملقط على طول جزء الظهرية للجمجمة. بلطف فهم الجمجمة في خط الوسط و 'قشر' القطع بعيداً جانبياً لكشف الدماغ، والحرص على عدم الأضرار الدماغ.
- عند إزالة الأجزاء الظهرية والجانبية للجمجمة، استخدم الملقط أو الملعقة بلطف إزالة الدماغ من الجمجمة بتجريف تحت السطح البطني للدماغ، ولا تحاول تلف أي منطقة. ضع المخ إلى آخر طبق بيتري مليئة ساكسف كاربوكسيجيناتيد.
ملاحظة: نحن نقدم اثنين من الاستراتيجيات المختلفة لتشريح الحصين والمخطط واللحاء. الاستراتيجية الأولى (خطوات 5.1-5.10) مفيد لأي خط الماوس بينما سيحتاج الاستراتيجية الثانية (خطوات 6.1-6.7) ماوس مراسل فلورسنت نظيفة فصل المخطط في pallidus جلوبس وغيرها من الهياكل الدماغ. إذا ليس هو المطلوب المخطط، قم بتجاهل أجزاء اثنين من التقنيات الخاصة بالمخطط
الشكل 1 : التخطيطي، وصور لتشريح الدماغ، أسلوب #1
تشريح التقنية المذكورة في الخطوات 5.1 5.10. إذا كان المطلوب هو الأنسجة سترياتال، ضع P1 الدماغ في الدماغ مصفوفات الجانب البطني أعلى. وضع شفرات الحلاقة في فتحات matrice عن طريق الدماغ الأمامي للحصول على مقاطع الاكليلية من خلال المخطط. إزالة القطع سترياتال من كلا نصفي الكرة الأرضية، وتكرار لكافة المقاطع التي تحتوي على المخطط التي عرفت الحصين. إذا ليس هو المطلوب الأنسجة سترياتال، ببساطة هيميسيكت الدماغ، ضع الجانب الآنسي نصفي الكرة أعلى في الطبق، وإزالة هياكل الدماغ البطني الآنسي (المهاد، ganglia القاعدية، وما إلى ذلك) لفضح الحصين. استخدام الملقط قرصه من الحصين، ثم اقلب نصف الكرة واستخدام الملقط لتشريح بقطعة من الأنسجة القشرية. خطوط سوداء عمودية من خلال نصفي الكرة التخطيطي حيث ستكون التخفيضات إزالة المقاطع سترياتال. شريط المقياس = 500μm. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5-حصاد المخطط وقرن آمون والقشرة، أسلوب #1
- وضع الدماغ كله على تقطيع matrice العفن، الجانب البطني حتى. 1 مكان شفرة حلاقة من خلال الجزء الأمامي أكثر من الدماغ (عن طريق المسالك حاسة الشم الأمامي).
- إدراج آخر شفرة حلاقة الخلفي فقط إلى أول واحد لإنشاء شريحة 0.5 مم، ومكان شفرة حلاقة إضافي اللاحق لهذا واحد.
- نقل هذه الشرائح إلى طبق بتري مع ساكسف كاربوكسيجيناتيد وبقية الدماغ بطبق منفصل مع ساكسف. نقل الشرائح سترياتال إلى نطاق تشريح لتصور المخطط. وينبغي أن تحتوي على أجزاء كبيرة من المخطط الأمامي هذه الشرائح وتفتقر إلى الحصين. استخدام الفلورية تشريح نطاق مع Nkx2.1-Cre+/--؛ Ai9+/-- شرائح التفريق بين تدتوماتو سترياتال ضعف إشارة من إشارة قوية تدتوماتو pallidus جلوبس.
- مع أو بدون الأسفار، قرصه خارج المخطط من كلا نصفي الكرة الأرضية في جميع أقسام وقطع سترياتال نقل إلى الأنبوبة المسماة بشكل صحيح 50 مل مع ساكسف، وتخزين على الجليد.
- هيميسيكت الدماغ على طول خط الوسط باستخدام الملقط أو شفرة الحلاقة، وتقع في نصف الكرة الأرضية حيث أن السطح الآنسي هو مواجهة.
- إزالة أنسجة المخ البطني (المهاد، ganglia القاعدية، إلخ) معسر قبالة هذا النسيج بالملقط. عند إكمال، الحصين (بنية على شكل نقانق تمتد على محور الصورة على طول القشرة الظهرية) والجانب البطين من القشرة يجب أن تكون مرئية بوضوح.
- لإزالة الحصين، إدراج نصائح الملقط أمام الحصين الأمامي بلطف منفصلة الحصين من القشرة بالتحرك الملقط جيدة ومعسر على طول الحدود هيبوكامبال القشرية. نقل الحصين معزولة إلى الأنبوبة المسماة بشكل صحيح 50 مل مع ساكسف، وتخزين على الجليد.
- تشريح القشرة، ضع الجانب الآنسي قشرة هيميسيكتيد إلى أسفل. ثم استخدم الملقط لقرصة الأكثر الظهرية، وأجزاء البطني والامامي والخلفي من القشرة ترك قطعة مربعة من قشرة somatosensory الآنسي، ~ 2 مم × 2 مم. الوجه القشرة ذلك الجانب الآنسي من أعلى ونظيفة من أي أنسجة غير القشرية الزائدة (المهاد ، ganglia القاعدية، إلخ.) على السطح الآنسي إذا لزم الأمر. نقل القطعة اللحاء إلى الأنبوبة المسماة بشكل صحيح 50 مل مع ساكسف، وتخزين على الجليد.
- كرر الإجراء مع نصف الكرة الأرضية لجمع هيبوكامبي وقشرة المناطق.
- كرر هذا الإجراء لكل الجراء، مع التأكد من استبدال ساكسف في أطباق بتري بين الجراء لضمان بقاء ساكسف الباردة والطازجة.
الشكل 2 : التخطيطي، وصور لتشريح الدماغ، الأسلوب #2
تشريح التقنية المذكورة في الخطوات 6.1-6.7. دبوس الدماغ على جانب الظهرية طبق تشريح أعلى. بعد تقشير القشرة إلى الأمام، وقرن آمون والمخطط مرئية ويمكن إزالتها، ثم يمكن إزالة جزء من اللحاء كما هو موضح في أسلوب السابقة. اعتماداً على خط الماوس المحورة وراثيا، يمكن تنظيف المخطط لإزالة globus pallidus والأنسجة الأخرى. في Nkx2.1Cre ؛ Ai9 خط الماوس، قد pallidus جلوبس كثافة أعلى بكثير من الطماطم + الخلايا مقارنة المخطط. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
6-حصاد المخطط وقرن آمون والقشرة، الأسلوب #2
- ضع الجانب البطني الدماغ أسفل في طبق بتري سيلجارد المغلفة التي تحتوي على ساكسف وأحدد من خلال المخيخ والقشرة الأمامية أو المصابيح شمي.
- بدءاً من واحدة من نصف الكرة الغربي، استخدام الملقط منحنى بلطف فصل القشرة الخلفي من الحصين الكامنة والأنسجة الأخرى. برفق وضع قشرة مقشرة منبسطة على طبق بيتري. كرر لنصف الكرة الأرضية الأخرى. هيبوكامبي والمخطط ينبغي أن تكون واضحة للعيان في الدماغ المكشوفة.
- استخدام الملقط لقرصة الحصين واحد في خط الوسط وقشر الحصين جانبياً لإزالة. وضع في قنينة جمع على الجليد وكرر مع غيرها الحصين.
- للمخطط، بلطف كشط حواف المخطط ترخي من الأنسجة المحيطة بها. ثم إزالة المخطط معسر من الخروج من تحت وإضافة إلى أنبوب جمع على الجليد. كرر المخطط الأخرى.
- يمكن أن تحصد الفروع القشرية كما هو موضح في الخطوة 5، 8.
- في حالة استخدام خط ماوس مراسل المحورة وراثيا (مثلاً، Nkx2.1-لجنة المساواة العرقية؛ Ai9، Lhx6-التجارة والنقل، وما إلى ذلك)، ونقل المخطط إلى طبق بتري مع ساكسف وعرض تحت فلوري تشريح نطاق. استخدام الملقط لإزالة أي أنسجة غير سترياتال من المخطط (في Nkx2.1-لجنة المساواة العرقية؛ Ai9 الفئران، إزالة جميع الأنسجة 'مشرق'، كما قد pallidus جلوبس كثير المستمدة من MGE، تدتوماتو + الخلية كثافة أعلى مقارنة بالمخطط). كرر كل من المخطط.
- كرر هذا الإجراء لكل الجراء، مع التأكد من استبدال ساكسف في أطباق بتري بين الجراء لضمان بقاء ساكسف الباردة والطازجة.
7-توليد ديسوسييشنز خلية مفردة
- بعد الانتهاء من التشريح، إعداد 1 ملغ/مل حل بروناسي التي تزن 10 ملغ بروناسي وإذابة في 10 مل كاربوكسيجيناتيد ساكسف.
- نقل الأنسجة من قنينات جمع 50 مل إلى 5 مل الجولة أسفل أنابيب تحتوي على 2 مل الحل ساكسف برنس. احتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تهز/التحريك الأنبوب 3-4 مرات بإصبعك أثناء حضانة لخلط العينات.
- خلال هذه الحضانة، تعد إعادة تشكيل الحل: 1% FBS (100 ميكروليتر) + الدناز (1 ميكروليتر من المضيفين الأسهم الدناز) في 10 مل كاربوكسيجيناتيد ساكسف.
- وبعد 20 دقيقة، بعناية إزالة الحل برنس لعدم الإزعاج الأنسجة في الجزء السفلي، واستبدالها ب 1-2 مل من إعادة تشكيل الحل (الحجم الإجمالي يعتمد على ابتداء من كمية من الأنسجة).
- ميكانيكيا ننأى بالانسجة التي تريتوراتينج الأنسجة مع الممصات باستور مصقول النار المعدة مسبقاً. بدءاً الماصة (~ 600 ميكرون) تحمل كبيرة، نضح وطرد الحل الأنسجة عشر مرات على الأقل تفكك النسيج. عدم إدخال فقاعات في الحل. كرر هذه العملية للمتوسط تتحمل ماصة والصغيرة تتحمل ماصة. أن الحل ينبغي أن يكون غائم ولا قطعة واضحة من الأنسجة يجب أن تكون مرئية في أنابيب جمع.
- بيبيت كتل الحل ليساتي الخلية من خلال عامل تصفية 50 ميكرومتر في أنابيب مخروطية الشكل 5 مل لإزالة أي خلية. المضي قدما في هذه الحلول خلية مفردة بالتدفق الخلوي (أو يحتمل أن تكون مباشرة إلى الخلية العد إذا لم الفرز المسبق).
8-إعداد حلول تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية الخلية لزرع الأعضاء
- عند تلقي الحلول خلية من سيتوميتير التدفق، نقل الحل إلى واحد (أو أكثر) 1.5 مل أنابيب مخروطية الشكل وتدور الخلايا في 500 غرام لمدة 5 دقائق في 4ياجيم بعد الطرد المركزي، قم بإزالة الوسائط حتى أن ~ 20-40 ميليلتر تظل في الأنبوب. إعادة تشكيل خلايا في هذا المتبقية وسائل الإعلام (والجمع بين الحل إذا كانت هناك حاجة إلى أنابيب متعددة).
- في قطعة صغيرة من بارافيلم، خلط معا 2 ميليلتر من حل خلية + 8 ميليلتر ساكسف + 10 ميليلتر من وصمة تريبان الأزرق. بيبيت 10 ميليلتر في هيموسيتوميتير مع غطاء الشريحة.
- حساب عدد الخلايا الحية في كل من الشبكات المربعة 4 × 4 في أركان هيموسيتوميتير استخدام عداد حصيلة يد مختبر قياسية (سوف تكون الخلايا الميتة الزرقاء من الصبغة)، ومتوسط هذه التهم 4. قم بضرب هذا الرقم 100 لتحديد عدد الخلايا كل ميليلتر.
- إذا لزم الأمر، ضبط وحدة التخزين حيث يتم الخلايا بتركيز 10,000 30,000 الخلايا/ميليلتر في إعادة بناء الحل. التركيز النهائي يتوقف على المبلغ الإجمالي للخلايا والعدد المطلوب لعمليات الزرع. تبقى الخلايا على الجليد لزرع الأعضاء
9-زرع في الجراء WT P0-2
- التفاف جرو WT في بعض بارافيلم أو القفازات ومكان ذلك بتغطية جيدة تحت الجليد. تعيين جهاز ضبط وقت لمدة 5 دقائق وبدء تشغيله. بعد ذلك الوقت، إزالة ألجرو والتحقق من أنها لا تستجيب معسر هيندباو.
- بينما ألجرو على الجليد، مزيج حل الخلية التي بيبيتينج ذلك عدة مرات لضمان تعليق خلية يختلط جيدا قبل التحميل (خلط الخلايا قبل تحميل ميكروبيبيتي لكل الحقن). ثم إفراغ ميكروبيبيتي الزيوت المعدنية وملئه تماما مع تعليق خلية.
- ضع ألجرو أنيسثيتيزيد على طبق بيتري برأسه ملقى على المعجون اللاصق حيث يكون الجزء العلوي من الرأس مسطحة نسبيا. وضع الشريط مع حفرة الماس عبر رأس ألجرو، سحب مشدود لضمان يتم تمدد الجلد، والرئيس شركة ولكن أن الفأر مريح والتنفس بشكل جيد. لامدا يجب أن تكون مرئية من خلال ثقب الماس.
الشكل 3 : التخطيطي والصور لزرع
(أ) صور إعداد الحقن. ملاحظة أن أمداً واضحة للعيان من خلال الجمجمة ألجرو وينبغي أن تستخدم للتصفير في ميكروبيبيتي. مقياس بار = 1 بوصة. (ب) التخطيطي تصور إجراء الحقن لاستهداف الحصين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- تحريك ألجرو المضمون تحت نانوجيكت وأقل ميكروبيبيتي حيث يكون غيض من ميكروبيبيتي على مباشرة أعلاه لامدا. تسجيل إحداثيات س ص على المناور.
- ضبط المقابض مناور للانتقال ميكروبيبيتي إلى الإحداثيات المطلوبة على طول في ميديولاتيرال ومحور الصورة الرأس: ← S1 اللحاء الأمامي 1.0 مم و 1.0 مم الجانبية والحصين ← 0.75-1.0 مم الأمامي والجانبية 1.0-1.2 مم والمخطط ← 2.0-2.2 ملم الأمامي والجانبي 1.5 مم. يمكن ضبط إحداثيات قليلاً للتعويض عن سن ألجرو (مثلاً P0 مقابل P2) أو السلالة من الفئران (مثل الفئران أكبر من CD1 و C57/B6 في P2).
- أقل في ميكروبيبيتي حتى أنه يشكل تقعر صغير على الجلد. ثم أدر محور ع مناور بحزم لكن بلطف محرك الأقراص ميكروبيبيتي عن طريق الجلد والجمجمة لدخول الدماغ. عندما يدخل ميكروبيبيتي الدماغ، سيصدر الضغط على الجمجمة والتقعر سوف تختفي.
- سحب ميكروبيبيتي قليلاً حتى التلميح محاط بمخروط جلد، على شكل خيمة. قراءة الإحداثيات على طول المحاور z: ستكون هذه النقطة محور ع الصفر.
- خفض ميكروبيبيتي إلى العمق المطلوب: قشرة ← 0.75-1.0 مم، الحصين ← 1.2-1.5 ملم، المخطط ← 2.0-2.5 مم-عمق يمكن تعديلها قليلاً للتعويض عن سن أو سلالة ألجرو.
- إدخال تعليق الخلايا باستخدام برنامج نانوجيكت الثالث الوارد وصفها أعلاه. بعد حقن برنامج كامل، انتظر 15-20 ثانية قبل التراجع ميكروبيبيتي للتقليل من حل تسرب من موقع الحقن ببطء.
- إذا كان أداء الثنائي الحقن، إعادة صفر ميكروبيبيتي أعلاه لامدا والانتقال إلى الإحداثيات الصحيحة في نصف الكرة الأرضية الأخرى. وبدلاً من ذلك، يمكن للمرء أن حقن اثنين في القشرة نصف الكرة نفسه بتحريك ميكروبيبيتي الأمامي من الحقن الأولى 1 مم.
- بمجرد اكتمال زرع الأعضاء، قم بإزالة الشريط ونقل ألجرو على وسادة التدفئة. إذا لزم الأمر، الوسم ألجرو بقطع ذيل أو أخمص القدمين. وبمجرد ألجرو فقدانه لون أحمر وتتحرك، وضعه مرة أخرى في القفص مع الأم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول يوضح كيفية الحصاد مناطق محددة من الدماغ من العقول بعد الولادة المبكرة (الشكل 1-2)، وجمع ديسوسييشنز خلية مفردة من السلائف إينتيرنيورون، وزرع هذه الخلايا في مختلف مناطق الدماغ في السذاجة WT الجراء بعد الولادة (الشكل 3). لتحليل بوستوك، كانت تحصد العقول التي تلقت الطعوم السلائف إينتيرنيورون بين P30-35 لتوصيف خصائص الكهربية والعلامات الكيميائية العصبية ومورفولوجيا الخلايا. غالباً ما تنفذ هذه الأنواع من ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أحد الجوانب البالغة الأهمية في هذا البروتوكول هو تحقيق أقصى قدر من قابلية البقاء في الخلايا. كفالة أن الأنسجة والخلايا دائماً في الجليد الباردة كاربوكسيجيناتيد ساكسف أمر ضروري لتعزيز بقاء الخلية. وهذا يتطلب إجراء تشريح كفاءة وتفكك استراتيجية للتقليل من طول الفترة الزمنية التي تنفق الخلايا في حل مختلف وخارج بيئة الدماغ. اعتماداً على عدد مناطق الدماغ يجري تشريح وزرعها، يمكن أن تكون مفيدة يكون شريك في المعونة في خطوات تشريح و/أو زرع تقليل طول التجربة. لضمان صحة وبقاء ألجرو، كما أنها حاسمة تقليل وقت التخدير الجليد (< 4 دقيقة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيده هذا البحث "المعاهد الوطنية للصحة" (K99MH104595)، وبرنامج البحوث الداخلية NICHD T.J.P. ونحن نشكر "فيصل غورد"، في المعمل الذي أنشئ أصلاً هذا النهج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلوريد الصوديوم | سيجما | S7653 | |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما | S6297 | |
| كلوريد البوتاسيوم | سيجما | P9541 | |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | سيجما | S0751 | |
| كلوريد الكالسيوم | سيجما | C5080 | |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما | M2670 | |
| الجلوكوز | سيجما | G7528 | |
| السكروز | سيجما | S7903 | |
| مصفوفات الدماغ | Roboz | SA-2165 | مطلوب فقط في حالة حصاد المخطط |
| نقطة الدقيقة Dumont Corpps | Roboz | RS-4978 | |
| مقص التشريح | الدقيق Roboz | RS-5940 | |
| شفرات الحلاقة | ThermoFisher | 12-640 | |
| ماصات باستور | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| مناور يدوي مع حامل | World Precision Instruments | M3301R / M10 | |
| 5 مل أنابيب بلاستيكية مستديرة | القاع ThermoFisher | 149591A | |
| أطباق بتري 60 مم أطباق | بتري | ThermoFisher 12556001 | |
| 100 مم أطباق بتري | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um مرشحات | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| مقياس الدم | ThermoFisher | 02-671-6 |
المراجع
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
