مقالة منهجية

الفحص نيوروسفيري لتقييم تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الذاتية في نموذج الفأر من إصابات النخاع الشوكي الحد الأدنى

DOI:

10.3791/57727

⸱

سبتمبر 13, 2018

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، علينا أن نظهر أداء نموذج إصابة الحبل الشوكي الحد الأدنى في ماوس الكبار أن قطع الغيار مكانة القناة الوسطى السكن الذاتية العصبية الخلايا الجذعية (الود). علينا إظهار كيف يمكن استخدام التحليل نيوروسفيري التحديد الكمي للتنشيط والهجرة من الود البدائية ونهائية بعد الإصابة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هي الخلايا الجذعية العصبية (الود) في الحبل الشوكي الثدييات الكبار سكان هادئة نسبيا ميتوتيكالي تلين الخلايا التي يمكن دراستها في المختبر باستخدام الإنزيم نيوروسفيري. هذا الفحص تشكيل مستعمرة أداة قوية لدراسة استجابة الود للعوامل الخارجية في صحن؛ ومع ذلك، هذا يمكن أيضا لدراسة التأثير في فيفو التلاعب مع الفهم الصحيح لمواطن القوة والقيود المفروضة المقايسة. أحد التلاعب بالفائدة السريرية هو تأثير الإصابة على تفعيل مجلس الأمن القومي الذاتية. توفر النماذج الحالية لإصابات النخاع الشوكي تحديا لدراسة هذا حسب شدة النماذج شيوعاً كدمة وضغط ترانسيكشن تتسبب في تدمير مكانة مجلس الأمن القومي في موقع الإصابة التي يقيم فيها الخلايا الجذعية. وهنا يصف لنا نموذج الحد أدنى من ضرر الذي يتسبب في أضرار المترجمة على السطح dorsolateral سطحية من انخفاض مستوى الصدر (T7/8) على الحبل الشوكي الماوس الكبار. هذا النموذج الإصابة قطع غيار القناة الوسطى على مستوى الإصابة ويسمح تحليل الود التي تتواجد على مستوى الآفة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة. هنا، نحن إظهار كيف يمكن استخدام التحليل نيوروسفيري لدراسة تفعيل السكان متميزة، وذات الصلة منحدرين، اثنين من الود التي تتواجد في منطقة تلين النخاع الشوكي-الود البدائية ونهائي (بنسكس ودنسكس، على التوالي). ونحن لشرح كيفية عزل وثقافة هذه الود من منطقة تلين على مستوى الإصابة وموقع الإصابة المسألة الأبيض. لدينا تشريح النخاع الشوكي بعد الجراحة تظهر زيادة في إعداد بنسك والمستمدة من دنسك نيوروسفيريس من منطقة تلين الاحبال المصابين مقارنة بضوابط، متحدثاً عن التنشيط عن طريق الإصابة. وعلاوة على ذلك، في أعقاب الإصابة، المستمدة من دنسك نيوروسفيريس يمكن أن تكون معزولة من موقع الإصابة، مما يدل على قدرة الود لترحيل من مكانها تلين إلى مواقع الإصابة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي الجهاز العصبي المركزي يتدنى لتجديد ذاتي، مولتيبوتينت من الخلايا الجذعية التي لها القدرة على أن تؤدي إلى جميع الخلايا العصبية الناضجة مختلف أنواع1،2،3،4. هذه الخلايا الجذعية العصبية (الود) الموجودة في المنافذ المتخصصة في المخ والحبل الشوكي ويمكن تفعيلها بعد إصابة تتكاثر وتهاجر، وتفرق في الخلايا العصبية الناضجة. قد ثبت الود وذرياتهم إلى الهجرة إلى موقع الإصابة في الإصابات القشرية نماذج5،6. في الدماغ، وأظهرت الود لترحيل من البطينات الجانبية إلى موقع الإصابة حيث أنها تفرق في أستروسيتيس التي تسهم في تشكيل ندبة الدبقية7. في الحبل الشوكي، ومع ذلك، يفعل دراسات قليلة لاسال إذا كانت هذه نفس الود الذاتية يمكن تسخيرها لتعزيز الانتعاش بعد إصابة الحبل الشوكي. وفي الواقع، هناك حاليا نقاش بشأن ما إذا كان يتطلب التنشيط تجمع الخلايا الجذعية في الحبل الشوكي أضرار مادية مباشرة من مكانة تلين بطانة القناة الوسطى8 أو إذا كانت الأضرار التي لحقت العمود الفقري الحبل حمة (ترك الساق خلية مكانة سليمة) غير كافية لتنشيط الذاتية الود9.

استخدمت عدد من نماذج الإصابة (علوم) الحبل الشوكي لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للإصابات الحادة والمزمنة. كما استخدمت هذه النماذج لاختبار العلاجات الممكنة لعلاج الخيال العلمي من خلال نيوروبروتيكتيون والمرباة والنامية خلية زرع/استبدال استراتيجيات10،،من1113. النماذج الحالية تشمل الإصابات ضغط و/أو كدمة، مما يتسبب في عجز وظيفي على نطاق واسع، فضلا عن الآفات واسعة و cavitations في سلك14،15. ندوب الدبقية الناتجة يمكن أن تمتد عبر عدة قطاعات العمود الفقري جنبا إلى جنب مع أغلبية العرض/محيط النخاع الشوكي16. وهكذا، بينما هذه النماذج ذات الصلة سريرياً، أنها تحمل تحديات كبيرة لدراسة رد الود الذاتية بعد الإصابة. وهناك نماذج كيميائية من الإصابات التي يمكن تكييفها ليسبب أشكالاً أكثر اعتدالا من الإصابات التي يمكن أن تدخر القناة الوسطى17. بيد هذه الأنواع من الإصابات التركيز على ديميليناتيون المرتبطة بالعلوم وليست نماذج ذات الصلة سريرياً عن الأضرار المادية و/أو الميكانيكية المرتبطة بالصدمة عشر

لمعالجة أوجه قصور نماذج الإصابة الحالية، أننا قد تكيفت إبرة مسار الحد أدنى علوم نموذجا، وضعت أصلاً في الفئران9، لتطبيق نموذج ماوس الكبار. يمكن إنشاء آفة متسقة من منطقة دورسولاتيرال في الحبل الشوكي الماوس نموذجنا إصابة تكييف وقطع الغيار القناة الوسطى في مستوى (مستويات) للإصابة. وميزة هذا النموذج أن ذلك يسمح بدراسة حركية مجلس الأمن القومي بعد الإصابة وهجرتها شعاعي المحتملة إلى موقع الإصابة. استخدام نموذج الماوس أيضا يسمح باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تتيح تتبع النسب من الود الذاتية وذرياتهم بعد الإصابة. ويمكن كذلك تقييم خصائص الود باستخدام صيغة معدلة في المختبر نيوروسفيري التحليل التي يتم تقديمها في هذا البروتوكول.

تحليل نيوروسفيري هو في المختبر تشكيل مستعمرة مقايسة تسمح بعزل الود حضور ميتوجينس. في كثافة الطلاء الاستنساخ، تتكاثر الود الفردية إلى نشوء مستعمرات كروية التعويم الحر للخلايا التي تتكون من يتدنى صغيرة من الود وغالبية العظمى من فروعه18،19. لدينا بروتوكول، نبدي عزل اثنين من الود متميزة، وذات الصلة منحدرين من منطقة تلين النخاع الشوكي – تحت ظروف خط الأساس، وفي أعقاب نموذجنا علوم الحد الأدنى. وقف نيستين إكسبرس الخلايا (دنسكس) والبروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني) نهائي العصبية وتزرع حضور عامل نمو البشرة (مماثلة) وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة) والهيبارين (يطلق عليها معا EFH)20. هذه دنسكس نادرة في الحبل الشوكي ساذج، مما أدى إلى نيوروسفيريس قليلة جداً في المختبر. ومع ذلك، نعرض أن دنسكس يتم تنشيطها بعد علوم الدنيا، توسيع عدد نيوروسفيريس معزولة عن منطقة المحيط بالبطينات21. الخلايا البدائية العصبية (بنسكس) المنبع دنسكس في نسب الخلايا الجذعية العصبية. بنسكس نادرة جداً، والتعبير عن مستويات منخفضة من علامة بلوريبوتينسي Oct4، وهي سرطان الدم استجابة العوامل المثبطة (LiF)22. ولا تشكل بنسكس نيوروسفيريس عندما المعزولة من النخاع الشوكي الماوس الكبار بسبب وجود البروتين الأساسية (MBP) المايلين في الثقافات الأولية؛ بيد أن نيوروسفيريس بنسك يمكن أن تكون معزولة من الفئران MBP ناقصة وإعدادهم الإصابات التالية الموسعة – شبيه دنسكس21. وأخيراً، نحن إظهار أن المستمدة من دنسك نيوروسفيريس يمكن أن تكون معزولة من موقع الإصابة في أوائل الأوقات بعد عشر الحد الأدنى وتبين هذه النتائج أن لدينا نموذج الضرر وفحوصات يمكن تقييم خصائص التنشيط تلين الود مثل قدرتها على تتكاثر وتهاجر في الاستجابة للإصابة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول وافقت "اللجنة رعاية الحيوان" في جامعة تورنتو ويتفق "دليل لرعاية واستخدام لتجريبية الحيوانات" (2nd الطبعة، "المجلس الكندي للعناية بالحيوان"، 2017).

1-جراحة إصابات النخاع الشوكي الحد الأدنى

ملاحظة: قبل عملية جراحية تأكد من أن جميع الأدوات الجراحية والمواد يتم تعقيمها بالطرق المناسبة (الشكل 1A).

  1. بناء قوس دعم الصدري المتداول يصل المربعات 4 – 5 من الشاش وتسجيل لهم معا في الوسط للحصول على لفافة ثابتة من الشاش.
  2. ضع الماوس في قاعة توجيهي والشروع في التخدير مع إيسوفلوراني 5%. تأكيد غياب منعكس قرصه تو قبل المتابعة، وكذلك طوال فترة الإجراءات. كما يمكن أن تأخذ عملية جراحية ما يزيد عن 30 دقيقة لإكمال، الأمثل للتعرض isoflurane الحد الأدنى (5 دقيقة في 5 ٪) والوقت المتبقي في 2 – 3%.
  3. نقل الماوس إلى مخروط الآنف المرفقة بالجهاز مخدر جرعة الصيانة إيسوفلوراني 2 – 3%. استخدام مقص الشعر لإزالة الفراء من دورسوم للحيوان من منتصف الظهر حتى العنق/الأذان للكشف عن منطقة واسعة مستطيلة من الجلد لإجراء عملية جراحية.
  4. نقل الماوس إلى أداة ستيريوتاكسيك بوضع انفها في مخروط الآنف المرفقة واستقرار في الجمجمة مع أشرطة الإذن. الحفاظ على إيسوفلوراني 5% أثناء وضع أشرطة الإذن وانخفاض مرة أخرى إلى 2 – 3% مجرد تأمين الماوس في جهاز ستيريوتاكسيك.
  5. إدارة الأدوية مسكن قبل الجراحة إينترابيريتونيلي – ميلوكسيكام (2.0 مغ/كغ). سخاء تطبيق تزييت العين على عيون الماوس مفتوحة لمنع جفاف القرنية تحت التخدير.
  6. وضع قوس الدعم الصدري أسفل البطن الماوس مع استقامة الجسم الماوس والعمود الفقري عن طريق سحب طفيفة على قاعدة الذيل. استخدام مختبر وسم الشريط لتأمين الذيل وجميع أطرافه ممتدة في موقف مثل نجمة. بمجرد تأمين، دفع القوس دعم الصدر روسترالي، من البطن الماوس صوب الصدر العلوي – من أجل دعم العمود الفقري الصدري (الشكل 1B).
  7. إعداد حقل جراحية معقمة بتطهير منطقة الجلد قص الفراء إعدادها في الخطوة 1، 3 مع الإيثانول 70 في المائة، تليها بوفيدون. كرر مرتين. تطبيق ثني جراحية معقمة للحفاظ على حقل واسع عقيمة.
  8. استخدام شفرة المبضع #10، جعل شق عمودي موازية للمحور الطولي للحيوان من نقطة الوسط لكلا ريش الكتف إلى انحناء العمود الفقري والصدر. سحب الجلد لفضح الأنسجة اللينة وكفاف العمود الفقري (الشكل 1).
  9. تحديد الحدود الدنيا للوحة الدهون سوبراسكابولار (هذا فىالوقت مستوى العمود الفقري T4/5). مع نفس شفرة #10، قص بعناية ولكن بقوة، على طول جانبي عظم العمود الفقري T5-T8/9 فصل الأوتار العضلات الظهر من العمود.
  10. إدراج أسنان الكامشات في مواقع شق على جانبي العمود الفقري. ضبط التعرض عن طريق توسيع الكامشات لرفع العمود الفقري بما فيه الكفاية دون وضع الكثير من الضغط على طبقات العضلات تراجع (الشكل 1).
  11. تحت المجهر الجراحي، بعناية تنظيف العضلات المتبقية والأنسجة الرخوة الأخرى تعلوها العمود الفقري لفضح عظم العمود الفقري (الشكل 1E). تحديد الفقرات التي سيتم إزالتها بقبض هذه العملية الشائكة من الفقرات مع ملقط مسنن ونقله طفيفة تصل وإلى أسفل.
    ملاحظة: هذا يجب السماح بتحديد المفاصل الفقرية وفضح الفتحات الصغيرة (الثقب الفقرية) تحت الفقرات الفائدة.
  12. إدراج رأس واحد مقص يتثلم منحنى جانبي الثقبة الفقرية المكشوفة، والذيلية للصفيحة الفقرية أن اقتطعت، وقطع المفاصل الفقرية الربط على المستوى الثنائي.
  13. رفع الصفيحة صعودا وقطع الملحق العلوي الصفيحة على عزل وإزالة العظام.
    ملاحظة: هذا سوف يعرض الكيس دورال سليمة تحتوي على الحبل الشوكي (الشكل 1F). قد يكون هناك إفراط النزيف التي يمكن السيطرة عليها عن طريق وضع بريكوت شاش 1 سم × 1 سم على المناطق المتضررة و/أو تغسل مع PBS العقيمة.
  14. مع على المنوال الظهرية خط الوسط بوصفه معلما، إدراج رمح تلميح إبرة 30 غرام (مع إبرة شطبه تواجه صعودا) بنت 45° في السطح دورسولاتيرال على الحبل الشوكي (حوالي 1 ملم العميق) في حوالي 0.5 مم الجانبي على أحد جانبي خط الوسط.
  15. نقل الإبرة ~ 2 مم من والذيلية إلى روسترال (الموازية لخط الوسط) حيث يتم إدراج على طول المجسم مشطوف الحواف الإبرة في الحبل. إزالة الإبرة بالرجوع عن طريق مسار الإدخال (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك لا نزيف ولكن تورم أنسجة العمود الفقري يمكن أن ينظر إليها في هذه الخطوة.
  16. لإغلاق الجرح، إزالة ضام وخياطة عضلات الظهر على جانبي الضرر معا في خط الوسط استخدام خياطة امتصاص 6-0. استخدام خياطة حرير عقيم 4-0 في وقت لاحق إغلاق الجلد السطحية.
  17. تطبيق مرهم مضاد حيوي للجزء العلوي من الجلد سوتوريد السطحية لمنع الإصابة بعد العملية الجراحية باستخدام تلميح مسحه القطن. إدارة مسكن بعد العمليات الجراحية من 0.1 مغ/كغ البوبرينورفين تحت الجلد جنبا إلى جنب مع السوائل (1 مل من محلول لاكتاتيد المسابقة).
  18. إيقاف تشغيل المرذاذ isoflurane والأكسجين. إزالة الماوس من جهاز ستيريوتاكسيك ومكانه في قفص نظيف مع لا الأسرة.
  19. ضع الماوس في القفص حوالي 30 سم بعيداً عن مصباح حرارة للتعافي من التخدير ومراقبة السلوك بعد الاستيقاظ. الماوس يجب أن يستيقظ داخل 5 – 10 دقيقة والدالة أطرافهم هند مع شلل المحتملة و/أو ضعف الذيل عند الاستيقاظ.
  20. رصد سلوك الماوس خلال الأيام القليلة القادمة وتوفير الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية المناسبة والمسكنات (أي، الهريس، لاكتاتيد في المسابقة حل السائل تحت الجلد، 0.1 مغ/كغ البوبرينورفين 2 × يوميا تحت الجلد لمدة 2 – 3 أيام، ومراقبة الوزن المناسب ) قد تختلف حسب الاسترداد وفقا للوائح المحلية مرفق الحيوانية، وعلى أساس فردي.

2. تشريح الإنزيم نيوروسفيري

ملاحظة: اتباع الإجراءات المناسبة زراعة الأنسجة المعقمة في جميع أنحاء.

  1. إعداد الحل الانزيمية
    1. إضافة 32 مل من موازنة الملح الحل (ابس إيرل) إلى الزلال أوفوموكويد المانع زجاجة تحتوي على الزجاج ودوامه حتى يذوب بلطف.
    2. إضافة 5 مل ابس بقنينة زجاج غراء مقسم مسبقاً ووضع في حمام مائي 37 درجة مئوية حل. سوف يصبح الحل الواضح (الحل 1).
    3. تأخذ 500 ميليلتر من ابس وإضافة إلى الدناز مقسم مسبقاً أنا زجاج القنينة للحصول على تركيز 1 ملغ/مل (حل 2). المزيج بلطف جداً عن إمالة القنينة ذهابا وإيابا وإضافة 250 ميليلتر من هذا الخليط 1 الحل.
      ملاحظة: جميع الحلول المقدمة (الحل 1 و 2) بما فيه الكفاية لمعالجة قطعتين من الأنسجة. إذا كان تجهيز المزيد من قطع الأنسجة، استيعاب مع أكثر الحل الإعدادية.
  2. إعداد الأنسجة والتشريح
    1. مكان مسح مختبر غارقة في إيسوفلوراني في قفص الماوس والسماح 2-3 دقيقة للأبخرة تخدير الماوس تماما. إزالة الماوس من القفص التالية بالضربة القاضية، وتؤكد غياب منعكس قرصه إصبع القدم.
    2. أداء التفكك عنق الرحم بجسم معدني غير حادة (أي، بطاقة القفص المعدني) euthanize الحيوان. رش الحيوان يوثانيزيد من على الرقبة إلى الخلف منتصف سخاء مع الإيثانول 70%.
    3. عند قاعدة الجمجمة، استخدام مقص لقطع الرأس وتجاهل في كيس الحيوية. جعل شق خط الوسط في الجلد على طول الجزء الخلفي تكشف عن العضلات والعظام الفقرية كونتور (الشكل 2A).
    4. رفع الجانب الآنسي لكل كتف (أي.، الكتف – حددها تعلوها لوحة الدهون) واستخدام مقص لقطع الأنسجة الرخوة (بين سكابولاي وفقرات). منفصلة تماما لفضح العمود الفقري الأساسي.
    5. وبعد انحناء العمود الفقري، إدراج نفس زوج من مقص في فتحه الصدر العلوي وعزل العمود الفقري عن طريق خفض بعيداً المرفقة الأضلاع والعضلات والأعضاء الداخلية (الشكل 2).
    6. إدراج العمود الفقري والذيلية الثقبة/فتح المقص وقطع المفاصل الفقرية على جانبي عن (الظهرية السطحية). رعاية خاصة عدم إتلاف الحبل سليمة. تستمر هذه العملية حتى المستوى المطلوب و/أو يتعرض لها طول الحبل.
    7. قطع spinal nerve(s) تمتد أفقياً من الحبل السري قبل نقل أنسجة النخاع الشوكي في طبق بتري مع العادية النخاعي الاصطناعي بعناية. الاحتفاظ عينة على الجليد (الشكل 2).
    8. تحت مجهر تشريح، قطع أنسجة النخاع الشوكي تشمل ~ 2 مم روسترال ووالذيليه إلى موقع الإصابة. استخدام اثنين من أزواج من الملقط لفصل الحبل السري بلطف إلى نصفين 2 طوليا على امتداد الصدوع الظهرية والبطني (الشكل 2').
    9. مع ميكروسسيسورس، قطع المسألة الأبيض دورسولاتيرال المصابين. ضع القطعة في أنبوب مخروطي 15 مل.
    10. عقد واحد نصف الحبل الشوكي أسفل مع الملقط، ندف وإزالة المسألة الأبيض استخدام زوج آخر من الملقط غرامة على طول مدى روستروكودال النخاع الشوكي لعزل منطقة تلين المرجوة. كرر للنصف الآخر من الحبل الشوكي.
    11. ضع قطعة من الأنسجة تلين في أنابيب مخروطية الشكل منفصلة 15 مل. استخدام ميكروسسيسورس ولطف فرم الأنسجة ضد جدران الأنابيب المخروطية.
      ملاحظة: "التعديلات تفكك" النسيج من "غراء تفكك نظام البروتوكول"23 والأنسجة تم وصفه مسبقاً إعداد إجراءات24.
    12. إضافة 2.5 مل من جديد الحل 1 (الخطوة 2.1.3) لعينات الأنسجة ومكان على الروك في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    13. بلطف تريتوراتي الأنسجة في الحل مع تلميح ماصة 1,000 ميليلتر. الطرد المركزي من تعليق خلية غائم في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    14. إعداد 3 الحل مع 2.7 مل من إيرل "موازنة محلول الملح"، 300 ميليلتر من أوفوموكويد المانع الحل (الخطوة 2.1.1) و 150 ميليلتر من الدناز أنا الحل (الخطوة 2.1.3).
    15. تجاهل المادة طافية من الخطوة (الخطوة 2.2.13) وريسوسبيند في 1.5 مل من 3 الحل من الخطوة السابقة (الخطوة 2.2.14).
    16. طبقة هذا تعليق خلية جديدة (الخطوة 2.2.15) على رأس 5 مل من أوفويموكويد المانع الحل (الخطوة 2.1.1) في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد لإنشاء تدرج كثافة متقطع. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    17. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 2 مل من نيوروباسال وسائل الإعلام. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 3 دقائق في الرايت
    18. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 1 مل من نيوروباسال وسائل الإعلام. تصفية بتعليق استخدام مصفاة خلية 20 ميكرومتر تليها 4 مل من وسائط الإعلام لإجمالي حجم 5 مل.
  3. الطلاء
    1. إعداد وسائط الثقافة للنمو نيوروسفيري باستكمال وسائل الإعلام نيوروباسال مع عامل نمو البشرة (20 نانوغرام/ملليلتر)/عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (20 نانوغرام/مل)/الهيبارين (2 ميكروغرام/مل) [للود قاطع] أو العوامل المثبطة (10 نانوغرام/مل) ليوكيمينا [للود البدائية]. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام أما في قارورة زراعة الأنسجة 25 مل.
    2. استخدام هيموسيتوميتير وصبغ تريبان الأزرق لحساب عدد الخلايا في تعليق من (الخطوة 2.2.18)25. وبمجرد حساب، إضافة خلايا إلى قوارير زراعة الأنسجة التي أعدت في (الخطوة 2.3.1) إلى كثافة الاستنساخ من 10 خلايا/ميليلتر ومكان قارورة زراعة الأنسجة مع إضافة خلايا إلى حاضنة ح 24 (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO2).
      ملاحظة: مثال على أسلوب العد كما يلي: تأخذ 10 ميليلتر تعليق خلية والمزيج مع 10 ميليلتر لصبغ تريبان الأزرق. إضافة 10 ميليلتر من هذا الخليط في هيموسيتوميتير. تحت 10 × مجهر الضوء، عد أرقام الخلايا الحية ومجموع كافة الخلايا التي تحسب ضمن 4 أرباع الدائرة 4 × 4. استخدام الصيغة: 100,000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1,000] لإعطاء حجم تعليق خلية يكون مطلي في كل قارورة 25 مل زراعة الأنسجة لضمان كثافة الاستنساخ (10 خلايا/ميليلتر).
    3. بعد 24 ساعة، بلطف دوامة في قارورة وصب محتويات في أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    4. تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في 1-2 مل من وسائل الإعلام نيوروباسال الطازجة.
    5. كرر الخطوة 2.3.2 حساب عدد الخلايا في الخلايا لوحة وتعليق في كثافة الاستنساخ في صفيحة 24-جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على 500 ميليلتر من كل وسائل الإعلام mitogen كل منهما يكمل (EFH نهائي مجلس الأمن القومي النمو) وليف للنمو القومي البدائية.
      ملاحظة: استخدم الصيغة المعدلة (5,000/[س خلايا/4) × 2 × 10 × 1,000) لحساب حجم تعليق خلية يكون مطلي في كل منها أيضا يحتوي على 500 ميليلتر لوسائل الإعلام.
    6. وضع لوحات تحتوي على خلايا في الحاضنة (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO2) ينمو لمدة 7 أيام.
  4. عد
    1. وبعد 7 أيام في الثقافة، إزالة لوحات وعرضها تحت مجهر خفيفة. قياس نيوروسفيريس عن طريق العد مستعمرات كروية هي > 80 ميكرومتر في القطر للثقافات دنسكس و > 50 ميكرومتر القطر للثقافات بنسكس.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، نيوروسفيريس يمكن أن يكون المزيد من باساجيد26 أو متباينة. إذا لم تعد هناك حاجة إلى الخلايا، التصرف بإضافة المعجل من بيروكسيد الهيدروجين للآبار (حوالي 1 مل) لمدة 20 دقيقة لكي يتحول إلى اللون الأصفر اللون المتوسط. ثم تجاهل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في أعقاب عملية جراحية، يجب أن تواجه الفئران العجز الحركي الحد الأدنى التي قد تشمل الذيل وشلل أطرافهم هند ممكن لمدة تصل إلى 24 ساعة. بعد هذا الوقت، يجب أن تواجه الفئران لا شلل أطرافهم هند و/أو شلل وتغيرات طفيفة في مشيه.

ويبين الشكل 3 نتائج تمثيلية من الإنزيم نيوروسفيري 5 أيام بعد إصابة الحبل الشوكي الحد الأدنى. العدد المطلق نيوروسفيريس المستمدة من دنسك (نمت في EFH) أكبر من عدد نيوروسفيريس المستمدة من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وخلال العملية الجراحية، وهناك بضع خطوات حاسمة حيث أن الباحث ينبغي أن تولي اهتماما خاصا لبغية الحصول على نتائج أفضل وتقليل التباين بين الحيوانات. يجب الحرص مع التخدير استنشاق (إيسوفلوراني) أثناء الجراحة كالمخدر قد ثبت أن لها آثار محصن مع التعرض لفترة طويلة27. وبناء على ذلك، عند دراسة قدرة التجدد بعد إصابة الحبل الشوكي، بذل جهد لإجراء الجراحة، بسرعة وكفاءة ممكنة لمنع التباس المتغيرات. المحافظة على نفس الوقت التعرض isoflurane كل الماوس سوف يقلل تقلب. معدل التنفس الماوس ينبغي رصدها في جميع أرجاء الجرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هو تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كريمبيل (منحة تشغيلية CMM). وكان WX جائزة الطالب "كارلتون مارغريت سميث". NL حصل "منحة الدراسات العليا أونتاريو".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agricola Retractorأدوات العلوم الدقيقة17005-04
مقص الربيع Moria Vannas-Wolff (منحني)أدوات العلوم الدقيقة15370-50قم بالتخصيص عند الطلب للحصول على نصائح ضعيفة
ملقط Graefe (مستقيم ، 1 × 2 أسنان)أدوات العلوم الدقيقة11053-10
ملقط Graefe ناعم للغاية (منحني ، مسنن)أدوات العلوم الدقيقة11152-10أو أي ملقط آخر لخياطة
Hartman Hemostats (Straight)Fine Science Tools13002-10أو أي ملقط آخر مناسب لخياطة
مقبض المشرط # 3أدوات العلوم الدقيقة10003-12أو أي
ماكينة قص شعرamazon.cahttps://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAأو أي
Stereotaxic مناسب آخر تمت معاقبة الصكStoeling51500أو أي
بوبرينورفينمناسب أو أي معتمد على مرفق رعاية الخاص بي
Meloxicamأو أي مرفق مناسب يعاقب عليه من قبل مرفق رعاية
Tears Naturale P.M.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXEأو أي 02225875 أخرى مناسبة
من IsofluraneBaxter International IncDINأو أي amazon.ca أخرى مناسبة للتخدير
Q-tips Cottom Swabshttps://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
شاش قطنيفيشر علمي13-761-52
30 جرام إبربيكتون ديكنسون305106للإصابة
25 جرام إبربيكتون ديكنسون305122لحقن المخدرات
1 مل محاقنبيكتون ديكنسون3090659لحقن المخدرات
3 مل محاقنبيكتون ديكنسون309657لحقن السوائل
4-0 خياطةuoftmedstore.com2297-VS881لخياطة الجلد
6-0 خياطةuoftmedstore.comVS889لخياطة العضلات
مرهم بوليسبورينamazon.ca102051
Isoflurane VaporizerVetEquip901806
15 مل أنابيب مخروطيةThermoFisherأي
أطباق بتريThermoFisherأي
Trypan BlueThermoFisherمناسب أي
مقياس للخلاياThermoFisher
طرد مركزي مناسبThermoFisherأي
أدوات تشريح قياسيةأدوات
مجهرZeissStemi 2000
مجهر العدأوليمبوسCKX41
العصبي القاعدي-Aمتوسط Invitrogen10888-022
B27Invitrogen17404-044
البنسلين - ستربتومايسينجيبكو15070
لتر - الجلوتامينجيبكو25030
DMEMInvitrogen12100046
F12Invitrogen12700075
30٪ جلوكوزسيجماG61521 م ، 9.01 جم في 100 مل dH 2< / sub>O
1 م جلوكوز
7.5٪ NaHCO3SigmaS5761155 mM ، 1.30 g in 100 مل dH2< / sub>O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH337523.83 g في 100 مل dH2
O Apo-TransferrinR& D Systems3188-AT
Putrescine سيجماP7505
الأنسولينسيجماI5500
السيلينيومسيجماS9133
البروجسترونسيجماP6149
نظام تفكك غراء قارورة Worthington Biochemical CorporationPDS1 من غراء لعينتين
من مسحوق PMG8041 عامل نمو البشرةالمعاد تكوينه بمزيج هرمون 1 مل ويتم تقسيسه في قوارير 20 ميكرولتر ليتم تخزينها في الفريزر
PHG0226نمو الخلايا الليفيةالمعاد تشكيله بمزيج هرمون 0.5 مل ونقاصه في 20 مو ؛ L قوارير ليتم تخزينها في الفريزر
HeparinSigmaH3149
عامل مثبط لسرطان الدمفي المنزل
الدم
الأزرق
24 بئر لوحاتNUNC
2 M NaClSigmaS588611.69 جم في 100 مل dH2< / sub>O
1 M KCLSigmaP54057.46 جم في 100 مل dH2O
1 M MgCl2SigmaM239320.33 g في 100 مل dH2O
108 mM CaCl2Sigma C79021.59 جم في 100 مل dH2O
أخرى مناسبة آخر مناسبة أي جهاز مناسبة العلوم الدقيقة تشريح يمكن استخدام مسحوق عامل مقياس Trypan

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
  24. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  25. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  26. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  27. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  28. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  29. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة