مقالة منهجية

تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

5.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57749

⸱

أغسطس 22, 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

في هذه المقالة

ملخص

يجمع هذا البروتوكول توصيف عينة البروتين بالتفريد جل الشعرية وغربلة سريعة-ملزم يغاندس مشحونة بالتفريد الشعرية تقارب. من المستحسن للبروتينات مع بنية مرنة، مثل البروتينات اضطرابه جوهريا، لتحديد أي اختلافات في ربط كونفورميرس مختلفة.

الملخص

النباتات التي تعتمد بشدة على بيئتهم. من أجل التكيف مع التغيرات المجهدة (مثلاً، والجفاف والملوحة العالية)، تتطور النباتات العليا وفئات من البروتينات اضطرابه جوهريا (المشردون داخليا) للحد من التوتر التأكسدي وناضح. هذه المقالة يستخدم مزيجاً من جل الشعرية التفريد (فريق الخبراء الاستشاري) والتنقل shift تقارب التفريد (ACE) لوصف سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة من AtHIRD11 المشردين داخليا من نبات التمويل. يستخدم فريق الخبراء الاستشاري لتأكيد نقاء AtHIRD11 واستبعاد الأجزاء والتعديلات بوسترانسلاشونال، وغيرها من الشوائب كأسباب لأنماط معقدة الذروة. في هذا الجزء من التجربة، مفصولة هلام لزج داخل شعري واسطة كتلها مختلفة المكونات العينة مختلفة والكشف مع جهاز كشف صفيف صمام ثنائي. بعد ذلك، يجري التحقيق في سلوك ملزمة العينة نحو الأيونات المعدنية المختلفة بايس. في هذه الحالة، يجند يضاف إلى الحل المخزن المؤقت ويتم قياس التحول في وقت الترحيل من أجل تحديد ما إذا كان حدث ربط حدث أم لا. واحدة من مزايا استخدام المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لتحديد سلوك ملزمة المشردين داخليا هو إمكانية أتمتة التفريد جل والمقايسة ملزمة. وعلاوة على ذلك، فريق الخبراء الاستشاري ويبين حد أدنى للكشف من التفريد جل الكلاسيكية وايس قادرة على أن تحدد بطريقة ملزمة يجند بطريقة سريعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق ACE للأنواع الأخرى مشحونة من الأيونات المعدنية. بيد أن استخدام هذا الأسلوب لربط التجارب هو محدودة في قدرتها على تحديد عدد المواقع الملزمة. ومع ذلك، يمكن تكييفها مع المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لوصف سلوك ملزمة لأي عينة البروتين نحو يغاندس اتهم العديد.

المقدمة

النباتات أكثر اعتماداً على بيئتها من العديد من أشكال الحياة الأخرى. إذ لا يمكن نقل النباتات إلى أماكن أخرى، لديهم للتكيف مع التغيرات في البيئة المحيطة بهم (مثلاً، الجفاف، البرد وارتفاع تركيزات الملح). ونتيجة لذلك، وضعت النباتات العليا البروتينات الإجهاد المتخصصة مثل ديهيدرينس، التي تفي بالمهام المتعددة للحد من التوتر الخلية تتصل بالملوحة العالية. هذه البروتينات ربط الماء والايونات داخل الخلايا، والحد من الأكسدة بربط Cu2 +-الأيونات، والتفاعل مع فوسفوليبيدات، فضلا عن سيتوسكيليتونس. وعلاوة على ذلك، ربط Zn2 +-الأيونات تسمح هذه البروتينات بمثابة عوامل النسخ. القدرة على ربط Ca2 +-الأيونات بعد الفسفرة كما تم الإبلاغ عن1.

سلوك متعدد الوظائف لهذه البروتينات يرتبط بعدم وجود مخلفات الأحماض الأمينية مسعور. وبالتالي فإنها تفتقر إلى أي التفاعلات مسعور داخل سلسلة الببتيد وبنية مقيدة أيضا. ومع ذلك، نظراً لأن هذه البروتينات تفتقر إلى هيكل تقييدية، التي يشغلونها كونفورميرس مختلفة تحت نفس الظروف. ولذلك، يمكن وصف أفضل كفرقة هياكل بدلاً من تكيف واحد. تعرف البروتينات بهذه الخصائص كما جوهريا اضطرابه البروتينات (داخليا) ومفهوم مستخدمة على نطاق واسع للبروتينات الإجهاد والحديث المتبادل بين مسارات مختلفة في الخلايا حقيقية النواة2.

واحد من هذه الأشخاص المشردين داخليا المتصلة بالإجهاد هو AtHIRD11. أنها واحدة من التمويل نباتشديدة الجفاف-أعرب معظم النازحين. ومن ثم، كونفورميرس مختلفة يمكن أن تكون مفصولة دائرة نصف قطرها فعالة لشحن نسبة، والتفريد الشعرية (CE) وقد استخدمت لإجراء مزيد من التحقيقات. آيس التجارب السابقة أثبتت التفاعلات بين AtHIRD11 وأيونات المعادن الانتقالية مثل Cu2 +Zn2 +-، Co2 +وني2 +-الأيونات. ويمكن الاطلاع على النتائج المفصلة في هارا et al. 3 وناخبار et al. 4.

تستند الطريقة آيس التي سيتم استخدامها هنا لدينا الأعمال المنشورة في وقت سابق6. ومع ذلك، إضافة اسيتانيليد علامة EOF إلى عينة البروتين ليست مناسبة. AtHIRD11 يعرض أنماط ذروة واسعة، وإضافة علامة EOF إلى العينة أن تخفي قمم اثنين. ولذلك، يتم استخدام العلامة في تشغيل منفصلة. قبل النظر في سلوك ملزمة، من المؤكد أن قمم عثر عليها خلال التجارب السابقة من كونفورميرس مختلفة. وهكذا، يستخدم فريق الخبراء الاستشاري للتمييز بين كونفورميرس البروتين، تعديل بوستترانسلاشونال البروتين والشوائب، مثل أجزاء من AtHIRD11، بكتلها مختلفة. وفي وقت لاحق، التحقيق في العينة AtHIRD11 يتسم سلوك ربط نحو مختلف الأيونات المعدنية المختلفة.

والغرض من هذه المقالة وصف إعداد تجريبية للتمييز بين المشردين داخليا والمكونات الأخرى من عينة من أجل تقييم الاختلافات في سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد الصكوك التفريد الشعرية

  1. إعداد الشعيرات الدموية
    1. استخدام قطع زجاج لقطع والسليكا تنصهر عارية الشعرية مع طلاء خارجي بوليميد وقطر داخلي ل 50 ميكرون إلى 33 سم (لتجربة فريق الخبراء الاستشاري) و 30 سم (للتجربة ACE) طويلة الشعيرات الدموية. إجراء القطع على طبق من زجاج.
      ملاحظة: وضعت 2 الأجهزة التجريبية المختلفة للصكوك المختلفة 2. بغية استخدامها في صكوك أخرى، قد نقل طريقة الصحيحة التي يتعين القيام بها وطول شعري إلى تعديل للطول المسموح به من الصك.
    2. استخدم قلم للاحتفال في منتصف نافذة الكشف واسعة 1 سم على مسافة من 24.5 سم من طرف واحد شعري لتجربة فريق الخبراء الاستشاري وفي 21.5 سم من نهاية واحد من الشعرية للتجربة آيس (الطول الفعال).
    3. إزالة الطلاء الخارجي بوليميد من الشعيرات الدموية بحرق مع موقد اللحام، 0.5 سم قبل وبعد العلامة. وبالمثل، استخدم في موقد اللحام لإزالة 1 سم للطلاء على كلا طرفي من الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: طول الفعال قد تختلف بشكل طفيف حيث أنها تعتمد على الصك التفريد الشعرية المستخدمة.
    4. تنظيف نهايات الشعيرات الدموية ونوافذ الكشف مع الإيثانول وأنسجة لينة.
      ملاحظة: الشعيرات الدموية غير المصقول أقل مرونة ومن المرجح أن كسر.
  2. تثبيت الشعيرات الدموية
    1. تثبيت شعري في نظام CE مع نافذة الكشف عن قرب بالمأخذ.
      ملاحظة: مختلف نماذج صك CE قد نظم عقد مختلفة الشعيرات الدموية. أرجع إلى الدليل للأداة المستخدمة للتعليمات الدقيقة.

2-إعداد الحلول

  1. إعداد الحلول لتحليل فريق الخبراء الاستشاري
    1. إعداد أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) (تريس)-الحزب الديمقراطي الصربي المخزن المؤقت (mM/1% 100 w/v) في درجة الحموضة 8.0.
      1. استخدام قناع التنفس وكشك لوزن 1.00 g من دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في كوب 100 مل.
      2. إضافة ز 1.21 من تريس في الكأس 100 مل وحل استخدام 50 مل مياه وبار إثارة مغناطيسية على محرض مغناطيسية.
      3. وضع قطب درجة حموضة في الحل وضبط درجة الحموضة إلى 8.0 استخدام 1.0 M HCl.
      4. تعبئة الحل إلى قارورة حجمية 100 مل وإضافة المياه يصل إلى العلامة. اهتز برفق لتجنب أي تشكيل الرغوة.
    2. إعداد الحل هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
      1. وزن ز 4.0 من هيدروكسيد الصوديوم في قارورة حجمية 100 مل. ملء ما يصل إلى العلامة مع المياه لجعل مخزون 1 م.
      2. استخدام ماصة لمبة 10 مل لنقل 10 مل هذا الحل إلى قارورة حجمية 100 مل آخر وملء ما يصل إلى العلامة مع المياه..
    3. تعد حل HCl 0.1 متر.
      1. وضع 10 مل من 10 M HCl إلى قارورة حجمية 100 مل استخدام ماصة حجمية من 10 مل وملء ما يصل إلى العلامة مع المياه. كرر هذه الخطوة للحصول على HCl 0.1 متر.
    4. إعداد الحل عينة.
      1. وزن 0.5 ملغ البروتين في أنبوب 1 مل. إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت جل تريس-الحزب الديمقراطي الصربي من الخطوة 2.1.1 مع ميكروبيبيتي.
      2. حل البروتين التي تهز برفق لتجنب أي تشكيل الرغوة وتحلل البروتين.
        ملاحظة: استخدم ultrasonication إذا كان لا يمكن حله البروتين كما هو موضح؛ تجنب أي تدفئة للحل.
    5. تعبئة الحلول إلى قنينة.
      1. تصفية كل حل من خلال 0.22 ميكرومتر الفينيليدن الفلوريد (PVDF) التصفية باستخدام المحاقن كافية مباشرة إلى القنينة.
        ملاحظة: للحلول التي تحتوي على هلام، الضغط الخلفي يمكن أن تكون مرتفعة بسبب لها لزوجة عالية.
      2. إعداد قنينة 15 في المجموع وعلامة كل منها لتجنب أي ميكسوبس.
        1. ملء قنينات 3 مع صوديوم متاحة تجارياً دوديسيل كبريتات (SDS) جل المخزن مؤقت على درجة الحموضة 8.
          ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت جل المخزونات المتوفرة تجارياً يوفر نتائج أكثر دقة.
        2. ملء قنينة 1 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وقنينة 1 مع 0.1 M HCl للتنظيف.
        3. ملء قنينة 1 مع الحل عينة.
        4. تعبئة القنينات 5 مع المياه وقارورة 4 مع 0.1 مل مياه (غمس قارورة).
          ملاحظة: تستخدم القنينات غمس كقارورة النفايات أثناء التنظيف من الشعرية قبل كل تشغيل. هي انخفضت نهايات الشعيرات الدموية في الماء شطف أي مخلفات هلام.
  2. إعداد الحلول لتحليل آيس
    1. إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم 1 متر.
      1. وزن ز 4.0 من هيدروكسيد الصوديوم في قارورة حجمية 100 مل.
      2. ملء ما يصل إلى العلامة مع المياه لجعل مخزون 1 م.
    2. تحضير حمض اتهيلينديامينيتيتراسيتيك 0.1 M (يدتا) في محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
      1. نقل 10 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.1 في قارورة حجمي 100 مل استخدام ماصة لمبة 10 مل. ملء ما يصل إلى العلامة مع المياه.
      2. وزن ز 2.42 يدتا على متن قارب وزنها وحل المجمع الصلبة في 100 مل من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    3. إعداد الحل تريس المخزن المؤقت (30 مم).
      1. إضافة ز 3.63 من تريس، 200 مل من المياه، وبار ضجة في كوب 500 مل. ضع في الكأس على طبق من إثارة وتشغيله.
      2. وضع قطب مقياس الأس الهيدروجيني الكأس وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام 0.1 M HCl.
      3. تعبئة الحل في دورق حجمي 1 لتر وتعبئة ما يصل إلى العلامة بالمياه.
        ملاحظة: هذا الإجراء قد تتكرر أو حاجة دورق حجمي أكبر منذ أكثر من 1 لتر هناك حاجة لتحليل كامل.
    4. إعداد تدفق اليكتروسموتيك اسيتانيليد (EOF)-حل علامة (60 ميكرومتر).
      1. إضافة 6 مغ من اسيتانيليد و 100 مل من تريس المخزن المؤقت قارورة حجمية 100 مل.
      2. دورق حجمي في حمام الموجات فوق الصوتية وتشغيله لمدة 30 دقيقة.
    5. إعداد الحل عينة (1 ملغ/مل).
      1. وضع أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل على توازن دقة وإضافة 0.3 ملغ مسحوق AtHIRD11 المعصوفه في الأنبوب.
      2. استخدام ميكروبيبيتي لإضافة 0.3 مل من المخزن المؤقت تريس 30 مم (درجة الحموضة 7.4) في الأنبوب. هز الأنبوب بعناية لإذابة البروتين.
    6. إعداد الحلول يجند.
      1. إعداد الحل كاكل الأسهم2 (5 مم).
        1. تأخذ قارب وزنها ووضعها على توازن التحليلي وتزن ملغ 36.76 كاكل2* H2o.
        2. ميكروبيبيتي، باستخدام مسح كاكل2* ح2س من وزنها قارب في قارورة حجمي 50 مل مع المخزن المؤقت تريس المجهز سابقا.
        3. ملء قارورة الحجمي مع المخزن المؤقت تريس ما يصل إلى العلامة.
      2. إعداد الحلول الأسهم المتبقية (5 مم).
        1. كرر الخطوة 2.2.6.1 المعادن الأخرى باستخدام أملاح بدلاً من كاكل2* ح2س [مجكل2: 23.80 ملغ، BaCl2: ملغ 26.02, ريال (لا3)2: 52.91 ملغ، الحركة2: ملغ 31.46, سيكل4: 52.91 ملغ، كوكل 2* 2 ح2o: 41.47 ملغ، كوكل2* ح 22o: 42.62 ملغ، زنكل2: مغ 3.41 ونيكل2* o: 6 ح2ملغ 59.43].
          ملاحظة: قد حل2 زنكل بتركيز 0.5 مم. إذ لوحظ وجود تفاعلات قوية بين الأيونات والجدار الداخلي الشعرية، التركيز انخفض بمقدار 104.
      3. إعداد الحل2 كاكل 500 ميكرومتر.
        1. ملء 10 مل الحل الأسهم2 كاكل ووضعها في قارورة حجمية 100 مل.
        2. ملء قارورة الحجمي مع عازلة تريس إلى العلامة واهتز قارورة.
      4. إعداد الحل2 ميكرومتر 250 كاكل.
        1. ملء 5 مل الحل الأسهم2 كاكل ووضعها في قارورة حجمية 100 مل.
        2. ملء قارورة الحجمي مع عازلة تريس إلى العلامة واهتز قارورة.
      5. كرر الخطوتين 2.2.6.3 و 2.2.6.4 للحلول الأسهم الأخرى.
    7. ملء الحلول في القنينات.
      ملاحظة: كل التشغيل المتكرر يحتاج إلى مجموعة من قنينات مدخل ومخرج. يقلل استخدام الحلول يجند الطازجة في مداخل ومخارج التحولات في وقت الترحيل بعد كل تشغيل.
      1. ملء الحل2 ميكرومتر 250 كاكل في حقنه 10 مل.
      2. وضع مرشح PVDF ميكرومتر 0.22 المحاقن ودفع 2 مل الحل من خلال عامل التصفية باستخدام المحاقن لتجاهل هذا الحل الذي تم تصفيته.
      3. ملء قارورة 10 تصل إلى أقصى حجم مسموح به مع الحل2 كاكل 250 ميكرون المتبقية من المحاقن. وضع علامة على كل ك 250 ميكرون كاكل 2 حل مدخل قنينة.
      4. ملء قارورة 10 حتى تكون مملوءة نصف مع 250 ميكرون كاكل2 الحل. وضع علامة على كل ك 250 ميكرون كاكل 2 الحل مأخذ قنينة.
      5. كرر الخطوات 2.2.7.1-2.2.7.4 للحلول التي تحتوي على الملح المعدنية الأخرى.
      6. كرر الخطوات لكل زوج من قنينات مدخل ومخرج 30 ملم من تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) الحل باستخدام بدلاً من ذلك.
        ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت الهيدروجيني 7.4 تريس 30 ملمول/لتر بين يمتد من أجل الحصول على بيانات الوقت الهجرة للبروتين في حالة عدم وجود أيونات المعادن. من الضروري من أجل إهمال التغييرات في EOF.
      7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لقنينة واحدة بدلاً من ذلك باستخدام اسيتانيليد علامة EOF (60 ميكرومتر) الحل. أيضا، كرر هذه الخطوات باستخدام الحل عينة (1 ملغ/مل) بدلاً من ذلك.

3-الفصل شعري جل الغرواني الكهربي

ملاحظة: إعداد الفصل وفقا للطريقة الموضحة في الأعمال السابقة التي ناخبار et al. 4.

  1. إعداد التحليل
    1. شرط شعري
      1. تعيين الحرارة إلى 23 درجة مئوية.
      2. تدفق شعري لمدة 10 دقيقة في بار 2.5 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
      3. مسح شعري لمدة 5 دقائق في شريط 2.0 مع 0.1 M HCl.
      4. تدفق شعري لمدة 2 دقيقة في بار 2.0 مع المياه.
    2. ملء المخزن المؤقت جل مخزونات النشر الاستراتيجي
      1. ملء شعري لمدة 10 دقيقة في بار 2.0 مع المخزن المؤقت جل مخزونات النشر الاستراتيجي متاحة تجارياً في pH 8.0.
    3. تدفق شعري قبل تشغيل كل فصل
      1. مسح شعري لمدة 3 دقيقة في بار 4.0 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
      2. تدفق شعري لمدة 1 دقيقة في بار 4.0 مع 0.1 M HCl.
      3. تدفق شعري لمدة 1 دقيقة في بار 4.0 مع المياه.
      4. تدفق شعري لمدة 10 دقيقة في بار 4.0 مع المخزن المؤقت جل الحزب الديمقراطي الصربي.
  2. تشغيل الفصل
    1. حقن الحل عينة لتجارب فريق الخبراء الاستشاري (الخطوة 2.1.4) هيدروديناميكالي عن طريق تطبيق 0.1 بار لمدة 4 دقائق في المدخل.
    2. تطبيق-16.5 كيلو فولت وضغط من شريط 2.0 في كلا طرفي شعري لمدة 25 دقيقة.

4-تقارب تحليل الغرواني الكهربي الشعرية

ملاحظة: إعداد الفصل وفقا للطريقة الموضحة في الأعمال السابقة التي ناخبار et al. 4 والحازمي et al. 5.

  1. شرط شعري
    1. تعيين الحرارة إلى 23 درجة مئوية.
      ملاحظة: درجة حرارة يتم استخدامها وفقا للبروتوكولات المنشورة ويمكن تغييره إلى غيرها من درجات الحرارة54،. ومع ذلك، التفاعلات تعتمد على درجة الحرارة وستتغير تبعاً لذلك.
    2. مسح شعري لمدة 40 دقيقة في بار 2.5 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    3. تدفق شعري لمدة 10 دقيقة في شريط 1.0 مع المياه.
    4. تدفق شعري لمدة 30 دقيقة في شريط 1.0 مع عازلة تريس 30 مم (درجة الحموضة 7.4).
  2. إعداد أساليب آيس
    1. إعداد الأسلوب للقياسات دون يغاندس.
      ملاحظة: اسيتانيليد لم يتم إضافة إلى الحل العينة، كما أنها تخفي 2 بروتين قمم.
      1. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع حل يدتا 0.1 متر.
      2. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع المياه.
      3. أشطف شعري لمدة دقيقة 1.5 2.5 بار مع عازلة تريس للموازنة.
      4. حقن الحل اسيتانيليد 6 s في شريط 0.05 وتغيير المدخل وقنينات منفذاً للقنينات المخزن المؤقت تريس.
      5. تطبيق شريط 0.05 ل 2.4 s من أجل دفع الحل اسيتانيليد من غيض الداخل المزيد الشعرية.
      6. تطبيق 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق والكشف عن ذروة اسيتانيليد في موجه 200 نانومتر.
      7. كرر الخطوات 4.2.1.1. -4.2.1.6. البروتين باستخدام عينة بدلاً من الحل اسيتانيليد والكشف عن جميع قمم البروتين.
    2. إعداد الأسلوب للقياسات مع يغاندس.
      1. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع حل يدتا 0.1 متر.
      2. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع المياه.
      3. أشطف شعري لمدة دقيقة 1.5 2.5 بار مع الحل يجند للموازنة.
      4. حقن الحل اسيتانيليد 6 s في شريط 0.05 وتغيير المدخل وقنينات منفذاً للقنينات العازلة التي تحتوي على [ليغند].
      5. تطبيق شريط 0.05 ل 2.4 s من أجل دفع الحل اسيتانيليد من غيض الداخل المزيد الشعرية.
      6. تطبيق 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق والكشف عن ذروة اسيتانيليد في موجه 200 نانومتر.
      7. كرر الخطوات 4.2.2.1-4.2.2.6 استخدام العينة البروتين بدلاً من الحل اسيتانيليد والكشف عن جميع قمم البروتين.
    3. بدلاً من ذلك كرر الخطوات 4.2.1 و 4.2.2 لحساب التغير في نسب حجم الشحنة لتفاعلات أيون البروتين-المعادن المختلفة (وصف إطار النتائج الممثل).
      1. تغيير الحل البروتين بعد كل ح 60 إلى واحد جديد.
        ملاحظة: عند هذه النقطة، التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً. هذا الإجراء هو المتكررة على الأقل 10 x لكل تركيز من يغاندس نظراً لنمط الذروة يختلف قليلاً من التشغيل إلى التشغيل. إذا كان يتم استخدام الحل أطول من ح 60، تصبح الاختلافات كبيرة جداً.
    4. تشغيل الأساليب
      1. تشغيل الأسلوب الموصوفة في إطار خطوة 4-2-2، باستخدام حلول يجند الأرض القلوية (كاكل2، مجكل2، BaCl2، وحلول2 سركل).
      2. الاستمرار في استخدام الطريقة الموضحة أسفل الخطوة 4-2-2، استخدام الحركة2وسيكل4، كوكل2، كوكل2، زنكل2، وحلول2 نيكل بدلاً من الحلول يجند الأرض القلوية.
        ملاحظة: كلوريدات المعادن الانتقالية الأخيرة أظهرت تفاعل أقوى مع شعري ولا يمكن إزالتها تماما. هذه نتيجة التفاعلات في التحولات في وقت الترحيل من التشغيل إلى التشغيل. ونتيجة لذلك، أنهم للتحقيق بعد الأيونات المعدنية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 اليكتروفيروجرام AtHIRD11 العينة التي تم الحصول عليها أثناء تجارب فريق الخبراء الاستشاري. زيادة حجم الببتيد من اليسار إلى اليمين. العدد الأقصى 4 كتلة أكبر، ويشير إلى البروتين سليمة. على قمم أصغر 2 و 3 تمثل الشوائب الأصغر حجماً (مثل، منتجات التحلل). كما يمكن أن تستنسخ الذروة الأولى وعدم الاتساق في الأساس قبل دون العينة البروتين. ولذلك، وهو يتصل بالحزب الديمقراطي الصربي هلام نفسها ولا تمثل أي الشوائب المرتبطة بعينه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لجميع CE التجارب، إعداد الشعرية خطوة حاسمة. أنها أنبوب زجاج يبلغ قطرها صغير، فإنه يمكن بسهولة كسر في المواقع حيث يتم إزالة الطلاء عند فإنه يتم معالجة. وينبغي أن يتم التثبيت شعري في الصك بعناية فائقة.

الخطوات الأساسية المتضمنة في استخدام أسلوب آيس أساسا تتعلق بالإعداد التجريبية. خطوة حاسمة أخرى هي إيجاد المعلمات حقن عينة اليمنى. حقن كمية العينة قد يكون كافياً للقمم العالية. بيد التحميل الزائد لأنه سيسفر نمط ذروة حل سيئة مع تداخل قمم. عند تناقص حجم المحقون، من المستحسن أن ينخفض ضغط الحقن بدلاً م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نشكر الامتنان هارا ماساكوزا (معهد البحوث للعلوم الخضراء والتكنولوجيا، وجامعة شيزوكا، اليابان) لتوفير عينات البروتين AtHIRD11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
عينة AtHIRD11جامعة شيزوكا (مجموعة البروفيسور M. Hara)-بروتين ديهيدرين من Arabidopsis thaliana< / em> معبرا عنها في الإشريكية القولونية< / em>
Badenied السيليكا الشعريةPolymicro Technologies (فينيكس ، الولايات المتحدة الأمريكية)106815-0017TSP050375 ، 50 & م القطر الداخلي ، 363 مو ؛ م القطر الخارجي ، طلاء بوليميد
Agilent 1600AAgilent Technologies (Waldbronn ، ألمانيا)غير متوفر بعد الآنأداة الرحلان الكهربائي الشعري ؛ يمكن استخدام Agilent 7100 CE بدلا من
ذلك Agilent 7100 CEAgilent Technologies (Waldbronn ، ألمانيا)G7100Aأداة الرحلان الكهربائي الشعري
Injekt 2 ملB. Braun (Melsungen ، ألمانيا)4606051Vحقنة للترشيح
Rotilabo-synringeCarl Roth GmbH + Co. KG (كارلسروه ، ألمانيا)KY62.1مرشح غشاء PVDF لترشيح
المحلولأبحاث Eppendorf plus 10 & mu ؛ LEppendorf (Wesseling-Berzdorf ، ألمانيا)3121 000.023ماصة صغيرة لمناولة العينات
Eppendorf Research plus 10 & mu ؛ LEppendorf (Wesseling-Berzdorf ، ألمانيا)3121 000.120ماصة صغيرة للتعامل مع محاليل الترابط
ماصة لمبة 10 ملDuran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا)24 338 08تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم
ماصة لمبة 25 ملDuran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا)24 338 14تحضير محلول الترابط
قارورة Duran glas الحجمية 25 ملDuran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا)24 671 1457تحضير محلول مخزون الترابط
قارورة Duran glas الحجمية 10 ملDuran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا)24 671 1054تحضير محلول مخزون
الترابط Proteome Lab SDS MW Gel BufferBeckman Coulter (Brea ، الولايات المتحدة الأمريكية)لم يعد متوفرا بعد الآنالفصل أثناء الرحلان الكهربائي للهلام الشعري / المخزن المؤقت SDS البديل: CE-SDS تشغيل المخزن المؤقت من مختبرات Bio-Rad (Mü nchen, Germany) رقم الكتالوج: 1485032 
أسيتانيليدسيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)397229-5Gعلامة التدفق الكهربائي
المنغنيز (II) كلوريدسيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)13217
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)431788-100Gمكون الشطف
كلوريد الباريومسيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)202738-5Gليجند
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)71729-100 جرامبروتين مذاب للرحلان الكهربائي للهلام الشعري
النيكل (II) كلوريد سداسي هيدراتسيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)654507-5Gكلوريد
السيلينيوم (الرابع)سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)323527-10GLigand
2- أمينو-2-هيدروكسي-ميثيل بروبان-1.3-ديول (تريس)سيجما-ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا)252859-100Gمكون عازل
كلوريد الزنك (II)ميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا)1088160250
نيترات السترونتيومميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا)1078720250ليجاند
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا)1371015000ليجاند
37٪ حمض الهيدروكلوريكميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا)1003171000ضبط درجة الحموضة
ثنائي هيدرات كلوريد النحاس (IIRiedel-de Ha & euml ؛ ن (سيلزي ، ألمانيا)31286Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45LAllpax (Papenburg ، ألمانيا)10000084 ؛ 0حمام بالموجات فوق الصوتية
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1Agilent Technologies (Waldbronn ، ألمانيا)حزم برامج G2070-91126لتشغيل أدوات CE والحصول على البيانات وتقييمها
مرشحات ليجاند )

المراجع

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AtHIRD11

مقالات ذات صلة