يجمع هذا البروتوكول توصيف عينة البروتين بالتفريد جل الشعرية وغربلة سريعة-ملزم يغاندس مشحونة بالتفريد الشعرية تقارب. من المستحسن للبروتينات مع بنية مرنة، مثل البروتينات اضطرابه جوهريا، لتحديد أي اختلافات في ربط كونفورميرس مختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
النباتات التي تعتمد بشدة على بيئتهم. من أجل التكيف مع التغيرات المجهدة (مثلاً، والجفاف والملوحة العالية)، تتطور النباتات العليا وفئات من البروتينات اضطرابه جوهريا (المشردون داخليا) للحد من التوتر التأكسدي وناضح. هذه المقالة يستخدم مزيجاً من جل الشعرية التفريد (فريق الخبراء الاستشاري) والتنقل shift تقارب التفريد (ACE) لوصف سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة من AtHIRD11 المشردين داخليا من نبات التمويل. يستخدم فريق الخبراء الاستشاري لتأكيد نقاء AtHIRD11 واستبعاد الأجزاء والتعديلات بوسترانسلاشونال، وغيرها من الشوائب كأسباب لأنماط معقدة الذروة. في هذا الجزء من التجربة، مفصولة هلام لزج داخل شعري واسطة كتلها مختلفة المكونات العينة مختلفة والكشف مع جهاز كشف صفيف صمام ثنائي. بعد ذلك، يجري التحقيق في سلوك ملزمة العينة نحو الأيونات المعدنية المختلفة بايس. في هذه الحالة، يجند يضاف إلى الحل المخزن المؤقت ويتم قياس التحول في وقت الترحيل من أجل تحديد ما إذا كان حدث ربط حدث أم لا. واحدة من مزايا استخدام المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لتحديد سلوك ملزمة المشردين داخليا هو إمكانية أتمتة التفريد جل والمقايسة ملزمة. وعلاوة على ذلك، فريق الخبراء الاستشاري ويبين حد أدنى للكشف من التفريد جل الكلاسيكية وايس قادرة على أن تحدد بطريقة ملزمة يجند بطريقة سريعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق ACE للأنواع الأخرى مشحونة من الأيونات المعدنية. بيد أن استخدام هذا الأسلوب لربط التجارب هو محدودة في قدرتها على تحديد عدد المواقع الملزمة. ومع ذلك، يمكن تكييفها مع المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لوصف سلوك ملزمة لأي عينة البروتين نحو يغاندس اتهم العديد.
المقدمة
النباتات أكثر اعتماداً على بيئتها من العديد من أشكال الحياة الأخرى. إذ لا يمكن نقل النباتات إلى أماكن أخرى، لديهم للتكيف مع التغيرات في البيئة المحيطة بهم (مثلاً، الجفاف، البرد وارتفاع تركيزات الملح). ونتيجة لذلك، وضعت النباتات العليا البروتينات الإجهاد المتخصصة مثل ديهيدرينس، التي تفي بالمهام المتعددة للحد من التوتر الخلية تتصل بالملوحة العالية. هذه البروتينات ربط الماء والايونات داخل الخلايا، والحد من الأكسدة بربط Cu2 +-الأيونات، والتفاعل مع فوسفوليبيدات، فضلا عن سيتوسكيليتونس. وعلاوة على ذلك، ربط Zn2 +-الأيونات تسمح هذه البروتينات بمثابة عوامل النسخ. القدرة على ربط Ca2 +-الأيونات بعد الفسفرة كما تم الإبلاغ عن
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد الصكوك التفريد الشعرية
-
إعداد الشعيرات الدموية
- استخدام قطع زجاج لقطع والسليكا تنصهر عارية الشعرية مع طلاء خارجي بوليميد وقطر داخلي ل 50 ميكرون إلى 33 سم (لتجربة فريق الخبراء الاستشاري) و 30 سم (للتجربة ACE) طويلة الشعيرات الدموية. إجراء القطع على طبق من زجاج.
ملاحظة: وضعت 2 الأجهزة التجريبية المختلفة للصكوك المختلفة 2. بغية استخدامها في صكوك أخرى، قد نقل طريقة الصحيحة التي يتعين القيام بها وطول شعري إلى تعديل للطول المسموح به من الصك. - استخدم قلم للاحتفال في منتصف نافذة الكشف واسعة 1 سم على مسافة من 24.5 سم من طرف واحد شعري لتجربة فريق الخبراء الاستشاري وفي 21.5 سم من نهاية واحد من الشعرية للتجربة آيس (الطول ال....
- استخدام قطع زجاج لقطع والسليكا تنصهر عارية الشعرية مع طلاء خارجي بوليميد وقطر داخلي ل 50 ميكرون إلى 33 سم (لتجربة فريق الخبراء الاستشاري) و 30 سم (للتجربة ACE) طويلة الشعيرات الدموية. إجراء القطع على طبق من زجاج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 اليكتروفيروجرام AtHIRD11 العينة التي تم الحصول عليها أثناء تجارب فريق الخبراء الاستشاري. زيادة حجم الببتيد من اليسار إلى اليمين. العدد الأقصى 4 كتلة أكبر، ويشير إلى البروتين سليمة. على قمم أصغر 2 و 3 تمثل الشوائب الأصغر حجماً (مثل، منتجات التحلل). كما يمكن أن تستنسخ الذروة الأولى وعدم الاتساق في الأساس قبل دون العينة البروتين. ولذلك، وهو يتصل بالحزب الديمقراطي الصربي هلام نفسها ولا تمثل أي الشوائب المرتبطة بعينه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لجميع CE التجارب، إعداد الشعرية خطوة حاسمة. أنها أنبوب زجاج يبلغ قطرها صغير، فإنه يمكن بسهولة كسر في المواقع حيث يتم إزالة الطلاء عند فإنه يتم معالجة. وينبغي أن يتم التثبيت شعري في الصك بعناية فائقة.
الخطوات الأساسية المتضمنة في استخدام أسلوب آيس أساسا تتعلق بالإعداد التجريبية. خطوة حاسمة أخرى هي إيجاد المعلمات حقن عينة اليمنى. حقن كمية العينة قد يكون كافياً للقمم العالية. بيد التحميل الزائد لأنه سيسفر نمط ذروة حل سيئة مع تداخل قمم. عند تناقص حجم المحقون، من المستحسن أن ينخفض ضغط الحقن بدلاً م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نشكر الامتنان هارا ماساكوزا (معهد البحوث للعلوم الخضراء والتكنولوجيا، وجامعة شيزوكا، اليابان) لتوفير عينات البروتين AtHIRD11.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عينة AtHIRD11 | جامعة شيزوكا (مجموعة البروفيسور M. Hara) | - | بروتين ديهيدرين من Arabidopsis thaliana< / em> معبرا عنها في الإشريكية القولونية< / em> |
| Badenied السيليكا الشعرية | Polymicro Technologies (فينيكس ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 106815-0017 | TSP050375 ، 50 & م القطر الداخلي ، 363 مو ؛ م القطر الخارجي ، طلاء بوليميد |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn ، ألمانيا) | غير متوفر بعد الآن | أداة الرحلان الكهربائي الشعري ؛ يمكن استخدام Agilent 7100 CE بدلا من |
| ذلك Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn ، ألمانيا) | G7100A | أداة الرحلان الكهربائي الشعري |
| Injekt 2 مل | B. Braun (Melsungen ، ألمانيا) | 4606051V | حقنة للترشيح |
| Rotilabo-synringe | Carl Roth GmbH + Co. KG (كارلسروه ، ألمانيا) | KY62.1 | مرشح غشاء PVDF لترشيح |
| المحلولأبحاث Eppendorf plus 10 & mu ؛ L | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf ، ألمانيا) | 3121 000.023 | ماصة صغيرة لمناولة العينات |
| Eppendorf Research plus 10 & mu ؛ L | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf ، ألمانيا) | 3121 000.120 | ماصة صغيرة للتعامل مع محاليل الترابط |
| ماصة لمبة 10 مل | Duran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا) | 24 338 08 | تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم |
| ماصة لمبة 25 مل | Duran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا) | 24 338 14 | تحضير محلول الترابط |
| قارورة Duran glas الحجمية 25 مل | Duran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا) | 24 671 1457 | تحضير محلول مخزون الترابط |
| قارورة Duran glas الحجمية 10 مل | Duran Group GmbH (ماينز ، ألمانيا) | 24 671 1054 | تحضير محلول مخزون |
| الترابط Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea ، الولايات المتحدة الأمريكية) | لم يعد متوفرا بعد الآن | الفصل أثناء الرحلان الكهربائي للهلام الشعري / المخزن المؤقت SDS البديل: CE-SDS تشغيل المخزن المؤقت من مختبرات Bio-Rad (Mü nchen, Germany) رقم الكتالوج: 1485032 |
| أسيتانيليد | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 397229-5G | علامة التدفق الكهربائي |
| المنغنيز (II) كلوريد | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 13217 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 431788-100G | مكون الشطف |
| كلوريد الباريوم | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 202738-5G | ليجند |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 71729-100 جرام | بروتين مذاب للرحلان الكهربائي للهلام الشعري |
| النيكل (II) كلوريد سداسي هيدرات | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 654507-5G | كلوريد |
| السيلينيوم (الرابع) | سيجما ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 323527-10G | Ligand |
| 2- أمينو-2-هيدروكسي-ميثيل بروبان-1.3-ديول (تريس) | سيجما-ألدريتش (شتاينهايم ، ألمانيا) | 252859-100G | مكون عازل |
| كلوريد الزنك (II) | ميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا) | 1088160250 | |
| نيترات السترونتيوم | ميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا) | 1078720250 | ليجاند |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | ميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا) | 1371015000 | ليجاند |
| 37٪ حمض الهيدروكلوريك | ميرك ميليبور (دارمشتات ، ألمانيا) | 1003171000 | ضبط درجة الحموضة |
| ثنائي هيدرات كلوريد النحاس (II | Riedel-de Ha & euml ؛ ن (سيلزي ، ألمانيا) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg ، ألمانيا) | 10000084 ؛ 0 | حمام بالموجات فوق الصوتية |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn ، ألمانيا) | حزم برامج G2070-91126 | لتشغيل أدوات CE والحصول على البيانات وتقييمها |
المراجع
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
