الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

Summary

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية المعزولة من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). ويشمل هذا البروتوكول إعداد فلاش تجميد عينات من الأنسجة المعوية البشرية، كريوسيكتيونينج، وتلطيخ ethanolic والجفاف، LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

والغرض من هذا الأسلوب الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية التي جمعت من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). وقد حددنا خمس خطوات في سير العمل التي لا بد منها للحصول على عزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي مع كمية ونوعية عالية بما فيه الكفاية لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، عند إعداد الأنسجة المعوية، يجب أن يكون كل عينة السائل الزائد كل إزالة بواسطة النشاف قبل التسوية serosa قدر الإمكان عبر الجزء السفلي من قوالب قاعدة كبيرة. العينات ثم تجمد بسرعة فوق ملاط الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني. وثانيا، عند تقطيع الأنسجة، من المهم أن موضع كريومولدس حتى الأجزاء المعوية موازية للطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك، مما تسفر عن مساحة أكبر من ganglia المعوي كل شريحة. الثالثة، خلال LCM، البولي إثيلين نابثالاتي (القلم)-عرض الشرائح غشاء أكبر قدر من السرعة والمرونة في تحديد الأشكال غير موحدة من ganglia المعوي عند جمع ganglia المعوي. رابعا، للتصور متميزة من ganglia المعوية داخل الأقسام، نقدم الأصباغ المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، ممتازة الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي بالنسبة للأصباغ المائية. أخيرا، لاستخراج الحمض النووي الريبي من العقد تم التقاطها، لاحظنا الفروق بين مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية التي أسفرت عن تفوق الجيش الملكي النيبالي الكمية والنوعية، والقضاء على التلوث بالحمض النووي. الأمثل لهذه العوامل في البروتوكول الحالي إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي النوعية والكمية.

Introduction

ويهدف هذا الأسلوب للحصول على عينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة من ganglia المعوي من الأنسجة المعوية البشرية باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). البروتوكول هو موضح هنا تم الأمثل لتقديم نوعية الجيش الملكي النيبالي وغلة كافية للحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) والمقصود ليتم استخدامها مع الأنسجة المعوية البشرية مستأصل حديثا، غير المثبتة، مجمدة في فلاش.

اضطرابات حركية الجهاز الهضمي والأمعاء الوظيفية يؤثر على واحد من كل أربعة أشخاص في الولايات المتحدة. النظام العصبي المعوي (ENS)، كما يشار إلى الدماغ الثاني¹، غالباً في وسط هذه الاضطرابات، كما أنها تلعب دوراً حاسما في التوازن القناة الهضمية وحر....

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المذكورة هنا فاندربيلت الجامعي المؤسسي استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين).

1-إعداد قبل وصول الأنسجة

1. الحصول على موافقة الاتحاد الدولي للرجبى السليم والتنسيق مع وكالات التبرع بالأعضاء البشرية للحصول على أنسجة الأمعاء مستأصل حديثا، غير المثبتة من الجهات المانحة أن تفي بجميع معايير البحث المطلوبة للدراسة.
   ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن تطويعها للاستخدام مع الفئران والقوارض نماذج أخرى.
   1. فورا على استئصال كل جزء الأمعاء، دقة مسح التجويف مع برنامج تلفزيوني المثلجة أو وسيطة تخزين الأنسجة لإزالة بقايا المواد لومينال أو البراز.
   2. بعد التنظيف والتخلص من النفايات في وعاء واقية مناسبة، غمر ....

Results

ونحن قد أدخلت عدة تحسينات على البروتوكولات القائمة التي تمكن من جمع السريع نسبيا من ganglia المعوي من عينات الأمعاء البشرية باستخدام LCM، الوفاء بالمعايير لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، نحن الأمثل التجميد السريع لشرائح الأنسجة المعوية في قوالب قاعدة كبيرة وضعت على سطح من الطين ثلج الجاف في 2 ميغا بايت (الشكل 1ب). تم الحصول على نجاح أفضل أثناء كريوسيكتيونينج و LCM اللاحقة بزرع شرائح المعوية شقة داخل قاعدة العفن، تواجه الغشاء المخاطي-الجا.......

Discussion

يتيح هذا الإجراء كفاءة جمع ganglia المعوية عديدة كمصدر استخلاص الحمض النووي الريبي لما يليها الحمض النووي الريبي هنا، نحن قد تسارعت العمليات الواردة في البروتوكولات القائمة مع أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كما كافة الخطوات في هذا الإجراء مترابطة، من المهم أن القضاء على كافة القضايا من بداية الدراسة وأن جميع العينات على استعداد المثل لبعضها البعض قدر الإمكان، للحصول على الحمض النووي الريبي موثوقة-ما يليها

من بداية الإجراء، سلامة الحمض النووي الريبي يمكن أن تكون سلبي إذا كان الفاصل .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10٪ فورمالين محايد	سيجما	HT501128-4 لتر
2-ميثيل بوتان	فيشر	O3551-4
حقنة 3 مل	BD	309628
50 مل أنابيب مخروطية ، بولي بروبيلين & nbsp ؛	قوالب قاعدة Corning	05-526B
37x24x5mm ، علوم	المجهر الإلكتروني	5025511
Belzer UW & nbsp ؛ حل التخزين البارد	جسر الحياة	NA
CapSure Macro LCM caps	Arcturus ، ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap ، اضغط n Seal	سعيد	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
لوح التقطيع	علوم المجهر الإلكتروني	63308
الإيثانول ، 190 برهان	من Pharmco-AAPER	111000190
الإيثانول ، 200 برهان	Pharmco-AAPER	111000200
شرائح المجهر الزجاجي	فيشر	12-550-343
قفازات ، صفعة ممتدة	Microflex   ؛	19010144
العباءات, جراحيا يمكن التخلص	منها Kimberly-Clark	19-088-2116
صينية ، 20 لتر (مقلاة تعقيم كبيرة من مادة البولي بروبلين)	Nalgene   ؛	1335920B
Kimwipes (كبير)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (صغير)	Kimberly-Clark	34133
نظام التشريح الدقيق للالتقاط بالليزر (ArcturusXT)	ThermoFisher	NA
لايكا كرايوستات تشاك، كبير،  40 مم	خدمة أدوات علم الأمراض الجنوبية الشرقية	NA   ؛
المجهر الضوئي	أوليمبوس	CX43
المجهر الهدف (20X)	أوليمبوس UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
هدف المجهر (10X)	أوليمبوس UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
المناخل الجزيئية	Acros Organics	AC197255000
المياه الخالية من النوكلياز	Ambion	AM9937
طقم استخراج الحمض النووي الريبي PicoPure	الأنظمة الحيوية التطبيقية	12204-01
بيليه مدقة	Kimble Kontes	غشاء
شرائح LCM	Arcturus ، ThermoFisher	LCM022
أنابيب خالية من RNase ، 1.5 مل	Ambion	AM12400
RNaseZAP  ؛	الريبي Sigma	Sigma-R2020
"A" (PicoPure)	التطبيقية Biosystems	12204-01
"B" (RNeasy   مجموعة صغيرة)	Qiagen	74004
طريقة استخراج الحمض النووي الريبي "C" (TRIzol) طقم	Invitrogen	15596-026
"D" (مجموعة RNeasy PLUS الصغيرة)	Qiagen	74134
Splash Shield ، مقص درع الوجه القابل للتصرف	فيشر	17-310
، جراحي ، 14.5 سم "حاد حاد"	أدوات	العلوم الدقيقة14002-14
مرشح حقنة ، أسيتات السليلوز (0.2 & mu; م)	Nalgene   ؛	190-2520
تجميد الأنسجة متوسط	البيانات العامة الرعاية الصحية	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL