مقالة منهجية

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

DOI:

10.3791/57763

⸱

أغسطس 10, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لتصور وضع القلوب في الزرد في 4-الأبعاد (4-د). تصوير 4-د، عبر ورقة الضوء الفلورية مجهرية ()، يأخذ 3 الأبعاد (3-D) الصور على مر الزمن، لإعادة إعمار قلوب النامي. نعرض كيفا وكما أن إجهاد القص ينشط الشق للوفلر إشارات من خلال دائرة التنمية، الذي يشجع ترابيكوليشن القلب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القوات الفسيولوجية تعانيها التنمية القلب تأثير القلب، وبخاصة ترابيكوليشن، التي تشكل شبكة أووتجرووثس المتفرعة من عضلة القلب. عيوب البرنامج الوراثي في الشق إشارات تتالي تشارك في عيوب البطين مثل البطين الأيسر الضغط عدم اعتلال عضلة القلب أو مرض القلب ترك التصنع. استخدام هذا البروتوكول، فإنه يمكن تحديد أن إجهاد القص مدفوعة ترابيكوليشن وإشارات الدرجة مرتبطة ببعضها البعض. استخدام ورقة الضوء "الفلورية مجهرية"، أمكن تصور القلب الزرد النامية. في هذه المخطوطة، تم تقييم ما إذا كانت القوات الفسيولوجية تعدل الشروع في ترابيكوليشن عن طريق الإشارات الشق والتأثير بالتالي، وظيفة الهوس يحدث. للنوعية والكمية للقص تحليل الإجهاد، 4-د (3-D + الوقت) الصور التي تم الحصول عليها أثناء morphogenesis القلب الزرد، ومجهرية المتكاملة ورقة الضوء الفلورية مع تزامن 4-د استولت الحركة البطين. خفض لزوجة الدم عن طريق gata1a-morpholino النوكليوتيد (MO) الصغرى-الحقن لتقليل إجهاد القص، وبالتالي أسفل تنظيم الشق الإشارات وتخفيف ترابيكوليشن. حقن المشارك من مرناً Nrg1 مع gata1a مو إنقاذ الجينات المتعلقة بالشق لاستعادة ترابيكوليشن. لتأكيد تأثير إجهاد القص مدفوعة مما يشير إلى درجة ترابيكوليشن، اعتقل انكماش كارديوميوسيتي كذلك عن طريق tnnt2a-مو لخفض القوات الفسيولوجية، وبالتالي تنظيم أسفل الشق الهدف الجينات لتطوير غير ترابيكولاتيد عضلة القلب. وأخيراً، أجرى التثبت أنماط التعبير المراعية لإجهاد القص الشق الجينات بإخضاع خلايا بطانية لتدفق نابض. وهكذا كشفت مجهرية الضوء-ورقة 4-د الفسيولوجية القوى الكامنة وراء إشارات الشق وترابيكوليشن مع أهميتها السريرية لاعتلال عضلة القلب غير الضغط.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشارك قوي النشاط الحيوي، مثل الإجهاد القص الفسيولوجية، ووثيقا في morphogenesis القلب. استجابة لقوى القص الفسيولوجية، تطوير المتطاولة احتشاء عضلة القلب والاخاديد في شبكة trabecular موجه تشبه في محاذاة مع الاتجاه لإجهاد القص عبر صمام (AV) بي1. ترابيكوليشن القلب من الضروري زيادة وظيفة الهوس و كتلة عضلة القلب2. الطفرات في الدرجة الأولى مما يشير إلى مسارات تؤدي عيوب القلب الخلقية في البشر و الفقاريات الأخرى3. على سبيل المثال، أظهرت للحد من تكون الكريات الحمر، بينما الاريثروبويتين (EPO) مرناً6 وإيسوبروتيرينول (ISO)7 زيادة الدم الحمراء gata1a4 و tnnt2a5 morpholino النوكليوتيد (مو) الخلايا ومعدل ضربات القلب على التوالي، ومن ثم الجدار إجهاد القص (WSS). وعلاوة على ذلك، يشير ErbB2، المصب من الدرجة الأولى، يشجع على انتشار كارديوميوسيتي والتمايز لتوليد القوة الهوس، الذي بدوره يقوم بتنشيط الشق مما يشير إلى8،9. ويقترح أن إجهاد القص يحكم الشق إشارات ترابيكوليشن مدفوعة للتنمية البطين. حاليا، هناك العديد من الدراسات التي تسعى إلى زيادة فهم الأحداث البرمجة الوراثية المؤدية إلى القلب الخلقي العيوب (CHD)10،،من1112، ولكن القليل جداً من التحقيق في كيفية قوي ميكانيكية التأثير على تشكيل القلب.

من أجل التحقيق في قوي ميكانيكية بالنيابة عن البطانة، الملاحظة عن كثب خلال فترة النمو يحتاج إلى تنفيذ. ومع ذلك، أنها صعبة للحصول على صور ذات نوعية جيدة في فيفو ضرب عينات بسبب إينهيرينسي للفحص المجهري التقليدي13. من أجل مراقبة التنمية على مر الزمن داخل عينة، ولذلك تقطيع المادية وتلطيخ، بحاجة إلى تحدث13،،من1415. على الرغم من أن الفحص المجهري [كنفوكل] يستخدم على نطاق واسع صورة هيكل ثلاثي الأبعاد لعينات14،16، لا تزال محدودة اقتناء أنظمة التصوير هذه ببطء سرعة المسح الضوئي.

ورقة الضوء الفلورية مجهرية () هو تقنية تصوير فريدة من نوعها التي يسمح التصور في فيفو الأحداث الحيوية مع فترة طويلة عامل المسافة13. يستخدم هذا الأسلوب المجهري نيون الورقة الضوء على الفرع بصريا عينة17. بسبب الإضاءة فقط ورقة رقيقة من الضوء على العينة، هناك انخفاض في تبييض الصورة وصور سمية13،18. ميدان كبير عرض وطويلة المسافة العمل يسمح لعينات كبيرة على البقاء سليمة كما هي المصورة13،،من1417. التكبير منخفض يسمح بمساحة أكبر تصويرها، بينما منذ فترة طويلة المسافة العمل يسمح لعينات أكثر سمكا تصويرها دون المساس بنسبة الإشارة إلى الضجيج. واستخدمت لسفم لصورة كاملة الأجنة17العديد من المجموعات، العقول14،18والعضلات وقلوب19 بين سائر الأنسجة، وعرض أنواع مختلفة من العينات التي يمكن تصويرها.

على الرغم من أن البحوث السابقة تجلى قوة القص الفسيولوجية انخفاض أوككلودينج المسارات تدفق أو خروج من قلب الزرد، المعلومات بحسب النوعية. النتائج في الدائرة الثالثة غير طبيعي، وتقلص القلب حلقات، و تشكيل صمام البصر20. الصور لسفم 4-د إعطاء منظور جديد في طريقة القص الفسيولوجية القوات تؤثر على تنمية أنسجة القلب. هذه القوات الميكانيكية قد تنشيط الجزيئات مما يشير إلى القوة الحساسة والحث على تشكيل التلال ترابيكولار. بسبب الجانب المتعلق بالوقت وأضاف التصوير 4-د، واحد قادرة على تعقب التغييرات في التنمية في الوقت الحقيقي، والتي يمكن أن تؤدي إلى الرؤيا الجديدة التي قد يلحظها سابقا. الزرد نموذج مثالي للتصوير لأن العلماء يمكن مراقبة الحيوانات الفقارية كامل مقابل فقط خلية خلية التفاعلات. كما يمكن منتشر الأوكسجين من خلال الجنين الكامل، الذي يتيح للتنمية تحدث دون الاعتماد على نظام الأوعية الدموية، خلافا في تطور الثدييات. على الرغم من أن قلب الزرد تفتقر إلى أجهزة الرئوية، التي تتطلب قلب أربع غرف، هناك عدد كبير من القلب من الجينات التي يتم الحفاظ عليها بين البشر والزرد21.

في هذه المخطوطة، نحن تصف كيفية استخدام الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري للصورة ترابيكولاي النامية في قلوب الزرد تحت ظروف مختلفة. أولاً، حقن gata1a4 أو tnnt2a5 استخدمت موس إلى انخفاض لزوجة الدم، ومن ثم WSS. ثم سجلت مورفولوجية للقلب. في مجموعة منفصلة من الأسماك، ونحن زيادة WSS بإدارة مكتب البراءات الأوروبي مرناً6 أو إيسوبروتيرينول7 ولاحظ النتائج. كما أجرينا دراسة خلية مع معدلات تدفق نابض أو متذبذبة مختلفة. بعد التصوير كل مجموعة، وجدنا أن لمست WSS بالبطانة عبر الشق مما يشير إلى ترابيكوليشن يبدأ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأساليب التالية أجريت وفقا لبروتوكولات يوتا وجامعة كاليفورنيا إياكوك. واستخدمت هذه المجموعات التجريبية مع المعدلة وراثيا Tg(cmlc2:gfp)، طفرات الإنجيلي (اتريوم ضعيفة) أو أومه (cloche) : مراقبة (أ) البرية من نوع (WT)، (ب) gata1a مو، والحقن (ج) tnnt2a مو (الجدول 1).

نموذجالاسمتعديل الجيناتالنمط الظاهريمرجع
عنصر التحكمنوع البريةلا شيءN/A
Tg(cmlc2:gfp)سلسلة الخفيفة الميوسين القلبأخضر فلوريسسينسي أعرب على وجه التحديد في عضلة القلب34
إجهاد القص الجدار المنخفضالمسخ اتريوم ضعيفة (الإنجيلي)سلسلة هيسي الميوسين اتريوم على حدةلا يمكن عقد اتريوم، ضغط البطين، جدار سميك احتشاء عضلة القلب، والتجويف الضيق، اتريوم ديالاتيد،37
المسخ cloche (أومه)N/Aإزالة كاملة من شغاف، اتريوم أوناتورالي الكبيرة مع الصغيرة البطين، كوشينس القلب غير موجود41
gata1a مو gata1a فقر الدم عن نقص خلايا الدم الحمراء4
tnnt2a موtnnt2a39
إجهاد القص زيادة حائط مكتب البراءات الأوروبي مرناًلا شيءشديدة polycythemia، زيادة في عدد خلايا الدم، بتعميم زيادة اللزوجة6
إيسوبروتينيروللا شيءزيادة معدل أمراض القلب7

الجدول 1: الزرد الأوصاف. تعريفات وتوصيفات الزرد المستخدمة في التجارب.

1-دراسة الإعداد

  1. إعداد Nrg1 و مكتب البراءات الأوروبي مرناً للإنقاذ ترابيكوليشن.
    1. الحصول على كدنا البشرية Nrg1 وتضخيم من بلازميد الجهات مانحة.
      ملاحظة: وكان موهوب كدنا البشرية Nrg1 من تالبوت وليام من جامعة ستانفورد.
      1. أخرج الكواشف اللازمة والمواد، هما PCR mastermix (المخزنة في-20 درجة مئوية) والإشعال (انظر الجدول 2) (المخزنة في-20 درجة مئوية) ولوحة بكر (المخزنة في درجة حرارة الغرفة) وماصة 20 ميكروليتر (المخزنة في درجة حرارة الغرفة). انظر الجدول المواد على سبيل المثال المنتجات.
        figure-protocol-1
        الجدول 2: كبسولة تفجير لاستنساخ البشر Nrg1 .
      2. إعداد mastermix للتمهيدي كل مجموعة في ثلاث استخدام ماصة ميكروليتر 20. للحصول على مجموعة واحدة من تريبليكاتيس، استخدام ميكروليتر 37.5 من mastermix، ميكروليتر 3 من المياه خالية من الحمض النووي، ميكروليتر 4.5 من التمهيدي. لمزيد من تريبليكاتيس، ببساطة اضرب عدد العينات.
      3. تمييع الحل العامل البشري Nrg1 كدنا (20 نانوغرام/ميكروغرام تركيز) في قطاع التمهيدي مع المياه خالية من الحمض النووي حيث أن هناك 10 ميكروليتر مجموع كل بئر كل عينة.
        ملاحظة: التأكد من أن كل حل ضمن الخطوة 1.1.1 موزعة بالتساوي. القيام بذلك عن طريق خلط كل حل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. لمنع التلوث المتبادل، استخدم واحد ماصة تلميح لنموذج واحد فقط.
      4. قاسمة كدنا Nrg1 مع ماصة متعدد القنوات 10 ميكروليتر إلى الآبار المرغوبة في لوحة PCR.
      5. إضافة 14.5 ميكروليتر من mastermix كدنا في الآبار. تطبيق غطاء مثبت على لوحة بكر ختم الآبار، ووضع في آلة PCR.
      6. بدء تشغيل الجهاز بكر وضمان أن يصل الدورة إلى درجات الحرارة المناسبة وفقا للإنزيمات والإشعال المستخدمة.
    2. استنساخ كدنا Nrg1 إلى pCS2 بلازميد+ في مواقع بامهي واكوري استخدام الإنزيمات الزائدة بامهي واكوري ضمان هو متصلة كدنا في جميع والبلازميدات.
      1. مزيج كدنا Nrg1 مع الجهة المانحة pCS2 بلازميد+، خلط الرئيسية المتاحة تجارياً الحل والإشعال (الجدول 2).
        ملاحظة: يجب أن يكون حجم رد فعل مجموع 50 ميكروليتر مع 25 ميكروليتر من مزيج الرئيسي، ميكروليتر 3 كبسولة تفجير وميكروليتر 1 من 20 نانوغرام/ميكروليتر المانحة بلازميد مع كدنا Nrg1 .
      2. وضع المزيج من الخطوة 1.1.2.1 في الجهاز بكر وتعيين معلمات للوفاء بالمواصفات التالية: 98 درجة مئوية 10 s و 55 درجة مئوية ل s 5 أو 15 72 درجة مئوية ل 5 s/كيلو بايت.
      3. تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات تنقية اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الوت المنتج إلى 50 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت.
      4. هضم المنتج بكر المنقي و 5 ميكروغرام من pCS2+ مع بامهي واكوري على حدة في 37 درجة مئوية ح 2 في وحدة رد فعل 200 ميكروليتر. تنقية الهضم الناتجة مع مجموعة تجارية والوت في ميكروليتر 20 و 100 ميكروليتر من تريس-HCl (pH 8.5)، على التوالي.
      5. سد ميكروليتر 4 من كدنا Nrg1 و 2 ميكروليتر من pCS2 هضمها+ بلازميد في 25 ميكروليتر فعل مع ميكروليتر 1 المحفز ليجاسى في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
        ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء هنا للحضانة بين عشية وضحاها.
      6. استخدام ميكروليتر 2 ربط حل من خطوة 1.1.2.5 والتحويل إلى 50 ميكروليتر كولاي بكتيريا خلايا مناسبة لاستنساخ (انظر الجدول للمواد).
    3. وتؤكد أن التحول الذي وقع قبل الفحص كدنا Nrg1 استنساخ باستخدام PCR. اختر استنساخ بشكل عشوائي وإضافة إلى إيجاد حل للإشعال محددة وبوليميراز ديوكسيريبونوكليوتيدي تريفوسفاتيس (دنتبس).
      ملاحظة: عناصر التحكم بالموجة (pCS2+) مع أو بدون الإدراج (كدنا البشرية). عدم انتقاء كبيرة جداً من مستعمرة للبكتيريا المفرطة يمكن أن تمنع PCR.
      1. اختيار 8 مستعمرات من pCS2 التحول والشاشة+-استنساخ Nrg1 استخدام الإشعال بكر من الجدول 2.
      2. ثقافة استنساخ واحدة مع كدنا Nrg1 لعزل pCS2+-Nrg1 بلازميد الحمض النووي. تلقيح مع 100 ميكروليتر من البكتيريا كولاي مع pCS2+-بلازميد Nrg1 إلى 100 مل رطل وسائط الإعلام، والثقافة التي تهز (160-225 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية.
    4. ترانسفيكت pCS2 المنقي+-بلازميد Nrg1 إلى HEK-293 الخلايا في صفيحة 6-جيدا باستخدام كاشف تعداء تجارية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    5. 24 ساعة بعد تعداء، الخلايا باستخدام مخزن مؤقت تحلل وتخترق هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، نقل إلى غشاء هلام، وثم وصمة عار مع مضادات الأجسام المضادةNrg1 22. تحقق من التعبير البروتين Nrg1 استخدام "الغربية لطخة".
      ملاحظة: عنصر التحكم هو pCS2 فارغة+ بلازميد. يمكن أن يكون مؤقتاً هنا إذا نقل جل الغشاء يحدث بين عشية وضحاها.
    6. توليف مرناً Nrg1 استخدام منتج تجاري مماثل لذلك في الجدول للمواد واتبع إرشادات الشركة المصنعة.
      1. تأخذ 5 ميكروليتر من pCS2+-Nrg1 الحمض النووي من الثقافة البكتيريا المعزولة، وخلاصة مع نوتي في رد فعل 200 ميكروليتر ح 2 في 37 درجة مئوية لينيريزي بلازميد.
      2. تنقية بلازميد خطية مع مجموعة تجارية والوت في 20 ميكروليتر من تريس-HCl (pH 8.5).
      3. إجراء النسخ في المختبر مع مجموعة عزل الحمض النووي الريبي تجارية في رد فعل 20 ميكروليتر باستخدام 5 ميكروليتر من بلازميد خطية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      4. إضافة في المختبر نسخها Nrg1 إلى 350 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي وتنقية ثم مع مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي. الوت الجيش الملكي النيبالي في 60 ميكروليتر من تريس-HCl (pH 8.5).
      5. قياس تركيز الحمض النووي الريبي وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    7. اتبع الخطوات 1.1.6.1-1.1.6.5 أعلاه لكدنا البراءات وإعداد مرناً ولكن استنساخ مواقع كدنا في بلازميد pCS2 + في اكوري وزهوي بدلاً من ذلك.
  2. حقن Morpholino الزرد
    1. تصميم23 مو الحقن باستخدام أداة على إنترنت (جدول المواد) ضد التسلسل ATG gata1a4 (5-كتجكاجتجتاجتاتجاجاتجتك-3) و tnnt2a5 (5-كاتجتتجكتكتجاتكتجاكاكجكا-3).
    2. إضافة gata1a و tnnt2a مو بشكل منفصل للماء خالية من نوكلاس لجعل النهائي تركيزات 8 نانوغرام/nL و 4 نانوغرام/nL، على التوالي. كرر مع المكتب الأوروبي للبراءات مرناً بتركيز نهائي من 20 بيكوغرام/nL. تأكد من أن وحدة التخزين النهائي 1 مل.
    3. حقن 1 nL 8 نانوغرام/nL من gata1a مو و 1 nL من 4 نانوغرام/nL من tnnt2a مو إلى أجنة الزرد منفصلة في 1 إلى المرحلة 4-خلية للحد من جدار البطين إجهاد القص (WSS)24. زيادة WSS، حقن 1 nL من 20 بيكوغرام/nL من مكتب البراءات الأوروبي مرناً6 أجنة الزرد في المرحلة 1-4 خلايا.
  3. علاج كيميائيا الزرد تمنع ترابيكوليشن
    1. استخدام ماصة 20 مل، تمييع 10 ملغ/مل AG1478 في [دمس] 1% في المتوسط E3 لتركيز نهائي من 5 ميكرومترات في 30 هبف في أنبوب 15 مل. كعنصر تحكم، تعامل كل الأسماك مع [دمس] 1% فقط.
    2. إضافة N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine تي-بوتيل إستر (ضابت) في [دمس] 1% (100 ميكرومتر) إلى متوسط E3 في أنبوب 15 مل تمنع الشق إشارات في 40 هبف بطريقة مماثلة. كعنصر تحكم، تعامل مع [دمس] 1% فقط.

2. تقنيات التصوير

  1. 4-د القلب "لسفم التصوير" مع خوارزمية التزامن
    1. تولي الصور 2-د الجنين كامل الأسماك متعددة القلب ضرب دورات باستخدام الخطوات التالية (الشكل 1). التأكد من أن سمك الورقة الضوء حوالي 5 ميكرومترات. تأخذ 500 س ص إطارات مع وقت تعرض للسيدة 10 مجموعة المسح الضوئي z إلى 1 ميكرومتر لضياع العينات الرقمية وفقا لمبدأ أخذ العينات نايكست25.
      1. إنشاء 1% (w/v) [اغروس] هلام بإضافة 1 غرام من [اغروس] إلى 100 مل والتدفئة أنه حتى يتم حل جميع [اغروس]. تحميل أنبوب بلاستيكية صغيرة مع الجنين واستخدام ماصة 20 ميكروليتر من [اغروس] وضمان الحصول عليها في المرحلة.
      2. فتح صورة عرض البرنامج وانقر فوق Live لمشاهدة عرض مباشر للعينة. ضبط الهدف استخدام المقبض بحيث تكون العينة في التركيز. وبالمثل، نقل المسرح حيث يعيش رأي العينة يظهر الجزء العلوي من الجنين.
      3. التقاط صور 500 مرة عن 5 s في 10 X التكبير باستخدام البرمجيات للمجهر26.
      4. الانتقال من مرحلة استخدام المحرك لطبقة جديدة (1 ميكرومتر في محور ع) وكرر الإجراء التصوير.
      5. كرر الخطوات 2 أعلاه حتى يتم تصويرها قلب كامل تماما.
    2. ضمان سلامة البيانات بالتغاضي عن الصور الأولى والأخيرة من دورة القلب. البحث عن فترة دورة القلب بمطابقة الصور التي تم التقاطها في نفس الوقت نقطة في دورة القلب، ولكن في فترات مختلفة. استخدم المعادلة التالية التي وضعت للبحث عن الفترة:
      figure-protocol-2(1)
      حيث D هو دالة التكلفة المستخدمة لتركيب فرضية فترة، أنام الصورة التي تم التقاطها، τ ' سم ضك فهرس z-اتجاه الصورة، الوقت تم القبض على الصورة، متجه للفهرس بكسل، و T ' هو الفرضية الدورية.
    3. استخدم المعادلة التالية لإيجاد هذا التحول النسبي بين صورتين في مراحل مشابهة:
      figure-protocol-3(2)
      حيث سك '، ك ترمز إلى دالة تكلفة لهذا التحول النسبي، R هو حي المكانية الممكنة، L هو إجمالي الوقت لالتقاط الصورة، x هو z الفهرس zk و بكسل ك' هي الشرائح z-الاتجاه الأول والثاني، t هو الزمن، وهو s فرضية التحول النسبي.
    4. تحويل هذا التحول النسبي للتحول المطلق فيما يتعلق بالصورة الأولى، وحل المعادلة الخطية باستخدام نهج الزائفة العكسية، لإيجاد العلاقة المطلقة بمحاذاة المقطع التالي من الصور كما هو موضح سابقا27.
    5. تم تجهيز الصور 4-د النهائي باستخدام برامج معالجة الصور (جدول المواد).
      1. التراص الصور ثنائي الأبعاد إلى ثلاثي الأبعاد
        1. افتح برامج معالجة صور تجارية.
        2. انقر فوق فتح البيانات.
        3. حدد جميع الصور تكون مكدسة في ثلاثي الأبعاد > انقر فوق تحميل.
        4. إضافة في حجم فوكسل 0.65 × 0.65 × 1 > انقر فوق موافق.
        5. انقر فوق المربع عرض مولتيبلانار لتصور صورة ثلاثية الأبعاد.
        6. زر الماوس الأيمن فوق المربع الأزرق slice_1.tiff > اختر عرض > حدد فولرين.
        7. انقر فوق تحرير > تحديد خيارات > حدد تحرير Colormap.
        8. ضبط اللون باستخدام المربعات المحددة باللون الأحمر > انقر فوق موافق.
      2. تحويل ثلاثي الأبعاد إلى 4-د
        1. انقر فوق "ملف > فتح بيانات السلاسل الزمنية.
        2. حدد المشاجرات ثلاثية الأبعاد التي تم إجراؤها فقط > انقر فوق تحميل.
        3. أدخل حجم فوكسل نفس قبل.
        4. الحق انقر فوق المربع الأزرق slice_1.tiff > حدد "عرض" > حدد فولرين.
        5. انقر فوق تحرير > تحديد خيارات > حدد تحرير Colormap. ضبط اللون باستخدام المربعات > انقر فوق موافق.
        6. الحق انقر فوق الوقت سلسلة التحكم > انقر فوق Movie maker > اضغط الزر تشغيل لمشاهدة الفيلم.
        7. إضافة اسم الملف، حجم الإطار، معدل الإطار، نوعية تساوي 1، اكتب مونوسكوبيك > انقر فوق تطبيق
        8. تصدير الفيديو. فتح الفيديو في برامج مناسبة.

3-قرة-PCR التحليل

  1. الزرد القلب "عزل الحمض النووي الريبي" لقياس درجة يغاندس، المستقبلات، واستهداف التعبيرات الجينات
    1. التضحية الزرد بإخضاعها لجرعة زائدة من تريكيني ميثيلاتي،من2829. استخدام بروتوكول هو موضح سابقا30، اقتطعت قلوب الزرد وعلى استعداد لعزل الحمض النووي الريبي.
    2. عزل مجموع الجيش الملكي النيبالي، وتوليف كدنا استخدام عدة توليف كدنا اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    3. تصميم كبسولة تفجير PCR يغاندس الشق Jag1، Jag2، Dll4، ومستقبلات Notch1bوالإشارات المتصلة جينات Nrg1 و ErbB2. انظر الجدول 3 للإشعال استخدمنا.
    4. إضافة الإشعال من الخطوة 3.1.3 ومرناً المعزولة من الخطوة 3.1.2 mastermix تجارية إلى لوحة PCR. تشغيل قرة-PCR في درجات الحرارة المناسبة والأوقات طبقاً للإنزيمات المستخدمة. تطبيع النتائج إلى الزرد α-أكتين.
      ملاحظة: وهذا حساب مستويات التعبير لكل من يغاندس، والمستقبلات، والجينات.

4. في المختبر التجارب الخلية البشرية غشائي الابهري (هايك)

  1. نموذج ديناميكي القص الإجهاد
    1. الثقافة هايك الخلايا مع هايك ثقافة وسائل الإعلام. متى المتلاقية تماما، تعرض الخلايا إلى الاندفاق الصفحي ونابض تدفق 23 × 10-5 N بمعدل 1 هرتز ح 24.
      1. الاحماء EC وسائل الإعلام/دميم 10% FBS في مياه حمام لمدة 20 دقيقة.
      2. استرداد خلايا حايك من خزان النتروجين السائل ووضع القنينة في حوض ماء حتى تذوب.
      3. استخدام ماصة ميكروليتر 1,000، إزالة الخلايا المذابة ووضعها في أنبوب 15 مل مع 3-5 مل من وسائل الإعلام. الطرد المركزي حل الخلية في 53 x ز لمدة 3 دقائق.
      4. نضح الحل إيقاف وإضافة وسائط كافية لإجمالي حجم 10 مل. إضافة حل الخلية إلى قارورة T75 عقيمة وكاب قارورة وتوزيع الخلايا بالتساوي على الجزء السفلي من اللوحة.
      5. وضع علامة قارورة مع الأحرف الأولى من اسم وتاريخ ونوع الخلية ومرور عدد. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية، 5% CO2، حتى يتم روافد 80% من الخلايا. تذكر أن تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام.
      6. باستخدام مضخة تجارية، إرفاق الأنابيب قارورة، وتعيين المعلمات المذكورة أعلاه في الخطوة 4.1.131،،من3233.
    2. إضافة GI254023X إلى 50 مل متوسطة حايك في تركيز نهائي من 5 ميكرومترات مدة 30 دقيقة.
    3. مع GI254023X قبل مختلطة، إجراء المانع ADAM10 الذي يمنع الشق الإشارات، نفس الاندفاق الصفحي أو تجارب تدفق نابض كما هو الحال في 4.1.1.
    4. قياس درجة يغاندس (Jag1، Jag2، و Dll4) والجينات المستهدفة الشق (شعر ومحسن لتقسيم [هس]) باستخدام qRT PCR لأربع مجموعات من عينات حايك (الاندفاق الصفحي، الاندفاق الصفحي + GI254023X، تدفق نابض، تدفق نابض + GI254023X) الموصوفة سابقا32.

5-الإنقاذ والتعبير المفرط من الدرجة الأولى مما يشير إلى

  1. حقن 1 nL مرناً Nrg1 المعدة بتركيز 5 جزء من الغرام/nL (من الخطوة 1-1-6) في المرحلة 1-4 خلية مع gata1a مو بغية أوفيريكسبريس الشق الهدف الجينات24.
  2. حقن 1 nL مرناً Nrg1 إلى التحالف الإنجيلي المسخ في طريقة مماثلة24.
  3. ضعف تركيز مرناً Nrg1 (10 بيكوغرام/nL) وحقن24 1 nL في الزرد لمراقبة مورفولوجية البطين.
  4. حقن 1 nL من 20 بيكوغرام/nL من مكتب البراءات الأوروبي مرناً6 أجنة الزرد في المرحلة 1-4 خلية لزيادة هيماتوبويسيس زيادة WSS البطين كما سبق سيظهر24.
  5. حقن 1 تستزرع nL من 50 ميكرومتر Isoproterenol7، مما يزيد من معدل contractility، إلى متوسطة E3 لمدة 24 ساعة بينما الزرد كما هو موضح سابقا24.
  6. إجراء تصوير لسفم 4-د لكل مجموعة. اتبع الإرشادات في الخطوات 2.1.1-2.1.5.2.8.

6-التحديد الكمي "تقصير كسرى" وحجم تغير مع مرور الوقت

  1. إجراء تصوير لسفم 4-د لكل مجموعة في 50 و 75 و 100 هبف. اتبع الإرشادات في الخطوات 2.1.1-2.1.5.2.8. تقسيم كل صورة حتى كل العقد 600 للنسخ متماثل الحركة جدار القلب.
  2. قياس التغير في قطر البطين خلال االنبساط واالنقباض باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-4(3)
    تحميل صور ثلاثية الأبعاد البطين في كل 0.1 s مع البرمجيات التصور وقياس الحجم.
  3. مؤامرة تغيير الحجم على مر الزمن لكل مجموعة تجريبية في 75 هبف و 100 هبف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واستخدمت لسفم في هذه المخطوطة بغية الحصول على صور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد ذات دقة عالية. كما يتضح في الشكل 1A و 1B، يوجه عدسة الإضاءة الورقة الضوء على العينة. بسبب ركاكة الورقة الخفيفة، مضاءة سوى طائرة واحدة. عدسة الكشف عن وضع عمودي العدسة الإضاءة ويتركز على متن الطائرة مضيئة (الشكل 1B). ثم تفحص الورقة الضوء من العدسة إضاءة العينة من اليسار إلى اليمين (الشكل 1). المسح الضوئي ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا أن التصوير 4-د يمكن استخدامها لتتبع تطور شبكة ترابيكولار في الاستجابة للتغيرات في النشاط الحيوي القوى. على وجه الخصوص، إجهاد القص ذوي الخبرة بخلايا بطانية يبدأ الشق إشارات تتالي، الذي يعزز بدوره ترابيكوليشن. في هذه المخطوطة، وقد أظهرنا أن انخفض (1) gata1a مو حقن هيماتوبويسيس وذلك أنه تقليل إجهاد القص الجدار، (2) tnnt2a مو حقن تثبيط وظيفة الهوس البطين لتقليل إجهاد القص الجدار، والتحالف الإنجيلي (3) طفرات تفتقر إلى خوارج انقباض، الذي ثم انخفضت القوة الفسيولوجية تطبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أعرب عن امتنان تالبوت وليام من جامعة ستانفورد لتقدم الإنسان Nrg1 كدنا وأن ديبورا ييلون من جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير التحالف الإنجيلي طفرات . الكتاب أيضا يود أن يشكر تشن سينثيا للمساعدة في الحصول على الصور. هذه الدراسة كانت تدعمها المنح HL118650 المعاهد الوطنية للصحة (أن ت هسياي)، HL083015 (أن ت هسياي)، HD069305 (لتشي نورث كارولاينا وت هسياي.)، HL111437 (أن ت هسياي ونورث كارولاينا تشي)، HL129727 (أن ت هسياي)، T32HL007895 (إلى R.R. Sevag Packard)، 134613 HL (إلى ميسيرشميدت ف) و جامعة "تكساس نظام النجوم" التمويل (للي جيه)-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Clontech Hifi PCR pre-mix تاكارة 639298PCR mastermix
1.1.1.1.1 ، 1.1.1.2 ، 1.1.1.5 ، 1.1.2.1 ، 3.1.4
Human Nrg1< / em> هدية cDNAمن ويليام تالبوت ، جامعة ستانفورد ، ستانفورد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةغيرفي الإنقاذ
1.1.1.3 ، 1.1.1.4 ، 1.1.2.1
CFX Connect & Trade ؛ نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5 ، 1.1.1.6 ، 1.1.2.2 ، 1.1.3.2
pCS2 +GE HealthPlasmid المستخدم لتصنيع mRNA
1.1.2.1 ، 1.1.2.4 ، 1.1.2.5
طقم تنقية النوكليوسبين  ؛  Clontech740609.25تنقية الحمض النووي
1.1.2.3 ، 1.1.2.4 ، 1.1.6.2
T4 DNA ligase   ؛Clontech2011Aحل ربط PCR
1.1.2.5
الخلايا النجمية المختصةClontech636763 E. القولوني< / em> الخلايا المستخدمة في التحويل
1.1.2.6 ، 1.1.3.1 ، 1.1.3.2
كاشف الإرسال Lipofectamine 2000Life Technologiesكاشفالإرسال 11668027
1.1.4
mMessage SP6 kitInvitrogenAM1340مجموعة تستخدم لتصنيع mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820ينقي الحمض النووي الريبي & nbsp ؛
1.1.6.4 ، 3.1.2
GeneTools 4.3.8برنامج GeneToolsN / Aلتصميم التمهيدي
1.2.1 ، 3.1.3
يزيد CDFH006026 EPO cDNACreative BiogeneWSS
1.2.2 ، 1.2.3 ، 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich   ؛T4182مثبط ErbB
1.3.1
E3 mediumلنمو الأجنة
1.3.1 ، 1.3.2 ، 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich & nbsp ؛D5942& gamma ;-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose سيجما ألدريتش A9539تستخدم لتركيب الأجنة
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT & nbsp ؛ كاميرا CMOS الرقميةHamamatsu PhotonicsC11440-42Uتستخدم لالتقاط الصور
2.1.1.2 ، 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN / Aتصور وتحليل الصور في 3D ، و 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate سيجما ألدريتش 886-86-2تستخدم لتخدير الأجنة أو التضحية بها بشكل إنساني
3.1.1
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890يصنع cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 جهاز طرد مركزي دقيقEppendorf05-400-005أجهزة الطرد المركزي الدقيقة
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich & nbsp ؛260264-93-5مثبط ADAM10
4.1.2, 4.1.3 
هيدروكلوريد الأيزوبرينالينسيجما ألدريتش   ؛I5627يزيد Isoproterenol من WSS
5.1.5
MATLABMathworks N/ Aتحليل ميكانيكا القلب
متوفرة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

الوسوم

TrabeculationNotch Signaling4D ImagingGata1a MorpholinoNrg1 mRNATnnt2a MorpholinoHemodynamic Forces

مقالات ذات صلة