Method Article

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

DOI:

10.3791/57780

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية. ومن ثم تم قياس مستويات سيتوكين تركيز دراسات متعددة في محاولة لفهم آليات محددة تؤدي إلى انهيار سيلفتوليرانسي والمناعة الذاتية اللاحقة. النهج حتى الآن قد تم استناداً إلى دراسة جانب محدد من الجهاز المناعي (واحد أو بعض أنواع الخلايا أو السيتوكينات)، ولا توفر تقييما شاملا لأمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة. اتباع نهج شامل في خلية واحدة لتقييم إنتاج سيتوكين في عدة مجموعات فرعية في الخلايا المناعية، في سياق "الجوهرية" الخاصة بالمريض البلازما تعميم العوامل، يرد هنا. هذا النهج يتيح رصد النمط الظاهري المناعي الخاصة بالمريض (علامات السطحية) والدالة (السيتوكينات)، أما لأن أصلي "الجوهرية المسببة للأمراض" مرض الدولة، أو في وجود العوامل العلاجية (في فيفو أو السابقين فيفو).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض المناعة الذاتية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات التي تؤثر على 3-8 في المائة من السكان. في الولايات المتحدة، اضطرابات المناعة الذاتية من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بين الشباب ومتوسطي العمر النساء (الإعمار < 65 سنة)1،2. اضطرابات المناعة الذاتية تتميز بعرض السريرية غير متجانسة والعمليات المناعية الأساسية المتنوعة. كذلك تمثل الطيف من عدم التجانس عبر الاضطرابات المختلفة، مثل مشاركة المشترك في التهاب المفاصل الرثياني (RA) والأمراض العصبية في التصلب المتعدد (MS). ومع ذلك، يتمثل هذا المستوى من عدم التجانس أيضا داخل اضطراب واحد، مثل الذئبة الحمامية الجهازية (SLE): يجوز تقديم بعض المرضى بأمراض الكلي، بينما يعاني الآ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بولاية كولورادو متعددة المؤسسية استعراض المجلس (كوميرب) من جامعة كولورادو. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة أدناه في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم ينص على خلاف ذلك، مع نصائح الماصة التي تمت تصفيتها، وتصفية جميع المواد الكاشفة.

1. إعداد الكواشف لتجهيز الدم كله الطرفية

  1. تحضير روكسوليتينيب مختبرين الأسهم (10 – 15 ميكروليتر/قنينة للاستخدام مرة واحدة) في 10 ملم بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في [دمس] وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (مخزن في-80 درجة مئوية). الحفاظ على تركيزات [دمس] في جميع الاختبارات بما في ذلك عناصر التحكم أونستيمولاتيد أقل من 0.2 في المائة (المجلد/المجلد).
  2. إعد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يوضح سير العمل للتحفيز وتجهيز عينات الدم المحيطية، بما في ذلك تخصيص مختبرين عينة الدم، النقل توقيت إضافة عوامل التحفيز، بروتين مثبط كوكتيل، والحضانة مرات حتى تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) والتثبيت. وسيتوقف اختيار عوامل حفز على مسارات الإشارات وسيتوكين التي تستهدف تقييم. على سبيل المثال، تستخدم في البروتوكول هو موضح هنا، يضع TLR لتقييم آليات الاستشعار عن المناعة الفطرية عبر العديد من أنواع الخلايا. الممثل خارج الخلية (لبس، مؤثر TLR4) واندوبلاسميك (R848.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا الرواية، خلية واحدة، نهج البروتين لتقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. يستخدم هذا الأسلوب الدم كله الطرفية كأداة تحليلية، والخلوي الشامل كأداة لتقييم المناعة الخلوية شذوذ المظهرية والوظيفية. الأسلوب ينطبق بسهولة ل دراسات حقوق الإنسان والفئران21، وهو متوافق مع التحليل الوظيفي المناعة الأخرى، مثل الكشف عن تشوهات مما يشير إلى14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر إيمي بوغ برنار لها مساهمات فكرية وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل ووارنج "بوتشير مؤسسة ويب جائزة البحوث الطبية الحيوية" عدد K23-1K23AR070897 من المعاهد الوطنية للصحة لايلينا W.Y. هسيه. كما أيدها عدد جائزة K12-HD000850 من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وولوسيل باكارد لصحة الأطفال، وجامعة ستانفورد كتسا UL1 TR001085، وأبحاث صحة الطفل جامعة معهد ستانفورد.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RuxolitinibSanta CruzSC-364729Aمخزون Conc: 10 ملم ؛ المسار النهائي: 5 & mu ؛ M
R848Invivogentlrl-r848-5مخزون Conc: 1 & mu ؛ ز /&مو; L; المسار النهائي: 1 & mu; جم / مل لتر
LPS-EKInvivogenTLRL-eklpsمخزون Conc: 1 & mu ؛ ز /&مو; L; المسار النهائي: 0.1 & جم / مل
معقم PBSLonza17-516F
Lyse / Fix BufferBD biosciences558049Stock Conc: 5X ؛ Conc النهائي: 1X (مخفف في ddH2O)
BD Phosflow perm / wash buffer IBD biosciences557885Stock Conc: 10X ؛ Conc النهائي: 1:10 (مخفف في ddH2O)
RPMIGibco21870-076
أزيد الصوديوم (NaN3)Sigma-AldrichS-8032مخزون Conc: >99.9٪; العنصر النهائي: 0.0002
مثبط نقل البروتين (PTI)eBiosciences00-4980-93Stock Conc: 500X ؛ Conc النهائي: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192BStock Conc: 500 & mu ؛ M; المسار النهائي: 0.1 &
خلية تلطيخ وسائل الإعلام (CSM)PBS + 0.5٪ BSA ، 0.02٪ NaN3
MaxPar Barcode Perm BufferFluidigm201057مخزون Conc: 10X ؛ Conc النهائي: 1X
20-plex Pd مجموعة الباركودFluidigmS0014مخزون Conc: N / a ؛ Conc النهائي: N / a
EQ TM< / sup> أربعة عناصر معايرة الخرزFluidigm201078مخزون conc: 10X ؛ Conc النهائي: 1X
16٪ محلول فورمالديهايد خال من MeOHThermo28908مخزون Conc: 16٪ (وزن / حجم) ؛ Conc النهائي: 1.6٪ (وزن / حجم)
أنابيب البوليسترين المستديرة السفلية المعقمةVWR60818-496Stock Conc: N / a ؛ Conc النهائي: N / A
أنابيب عنقودية من مادة البولي بروبلينمختبرات الضوءA-9001Stock Conc: N / a ؛ العنصر النهائي: N / a
أداة Helios CyTOFFluidigmHeliosيجب أن تكون جميع المحاليل المستخدمة في تحليل CyTOF خالية من التلوث المعدني. يستخدم ddH2O في تحضير أي حلول يجب أن يكون لها مقاومة لا تقل عن 18.0 M & Omega ؛. سم ddH2O وأي محاليل معدة ذاتيا يجب تخزينها في زجاجات بلاستيكية أو زجاجية جديدة لم يتم تعقيمها مطلقا.
nameCompany Catalog NumberComments
antibodies المستخدمة في قياس الخلايا الكتلية
علامات السطح
CD1cBiolegendL161الكتلة: 161
CD3BDUCHT1الكتلة: 144
CD4BiolegendSK3الكتلة: 174
CD7BDM-T701الكتلة: 149
CD8BiolegendSK1الكتلة: 142
CD11bFluidigmICRF44الكتلة: 209
CD11cBDB-ly6الكتلة: 152
CD15BDHI98الكتلة: 115
CD14BiolegendM5E2الكتلة: 154
CD16eBioscience / ThermoB73.1الكتلة: 165
CD19سانتا كروزSJ25C1الكتلة: 163
CD21BiolegendBu32الكتلة: 141
CD27BDL128الكتلة: 155
CD38FluidigmHIT2الكتلة: 172
CD45 إجماليBiolegendHI30الكتلة: 89
CD45RABiolegendHI100الكتلة: 153
CD56MiltenyiREA196الكتلة: 168
CD66BDB1.1 / CD66الكتلة: 113
CD86FluidigmIT2.2الكتلة: 150
CD123Fluidigm6H6الكتلة: 143
CD278 / ICOSBiolegendC398.4Aالكتلة: 156
CD179 / PD1BiolegendEH12.2H7الكتلة: 162
IgDBiolegendIA6-2الكتلة: 146
IgMBiolegendMHM-88الكتلة: 151
CXCR5BDRF8B2الكتلة: 173
HLADRBiolegendL243الكتلة: 167
<قوي>السيتوكينات< / قوي>
IL-1 & alpha;Biolegend364-3B3-14الكتلة: 147
IL-1 & بيتا;Biolegend H1b-98كتلة: 169
IL-1RAسانتا كروز & nbsp ؛كتلة AS17: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5الكتلة: 164
IL-8BDE8N1الكتلة: 160
IL-12 / IL-23p40Biolegend  C8.6كتلة: 171
IL-17ABiolegend  BL168كتلة: 148
IL23p19eBioscience / Thermo23dcdpكتلة: 176
MIP1 & beta ؛دينار بحرينيD21-1351كتلة: 158
MCP1BD5D3-F7الكتلة: 170
IFN & alpha ؛Miltenyi LT27: 295الكتلة: 175
IFN & gamma ؛بيولوجي ليجند4 إس. كتلة B3: 165
PTENBDA2B1الكتلة: 159
TNF & alpha ؛BiolegendMab11كتلة: 166
<قوي>ملاحظة< قوي>: إذا تم ذكر الشركة المصنعة على أنها Fluidigm ، فقد تم شراء هذا الجسم المضاد من Fluidigm مع معدن مترافق مسبقا. إذا تم ذكر الشركة المصنعة على أنها غير Fluidigm ، فقد تم اقتران هذا الجسم المضاد ذاتيا باستخدام MaxPar Multi-Metal Labeling  طقم (Fluidigm Cat: 201300) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

Related Articles