مقالة منهجية

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

DOI:

10.3791/57780

⸱

يونيو 26, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية. ومن ثم تم قياس مستويات سيتوكين تركيز دراسات متعددة في محاولة لفهم آليات محددة تؤدي إلى انهيار سيلفتوليرانسي والمناعة الذاتية اللاحقة. النهج حتى الآن قد تم استناداً إلى دراسة جانب محدد من الجهاز المناعي (واحد أو بعض أنواع الخلايا أو السيتوكينات)، ولا توفر تقييما شاملا لأمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة. اتباع نهج شامل في خلية واحدة لتقييم إنتاج سيتوكين في عدة مجموعات فرعية في الخلايا المناعية، في سياق "الجوهرية" الخاصة بالمريض البلازما تعميم العوامل، يرد هنا. هذا النهج يتيح رصد النمط الظاهري المناعي الخاصة بالمريض (علامات السطحية) والدالة (السيتوكينات)، أما لأن أصلي "الجوهرية المسببة للأمراض" مرض الدولة، أو في وجود العوامل العلاجية (في فيفو أو السابقين فيفو).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض المناعة الذاتية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات التي تؤثر على 3-8 في المائة من السكان. في الولايات المتحدة، اضطرابات المناعة الذاتية من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بين الشباب ومتوسطي العمر النساء (الإعمار < 65 سنة)1،2. اضطرابات المناعة الذاتية تتميز بعرض السريرية غير متجانسة والعمليات المناعية الأساسية المتنوعة. كذلك تمثل الطيف من عدم التجانس عبر الاضطرابات المختلفة، مثل مشاركة المشترك في التهاب المفاصل الرثياني (RA) والأمراض العصبية في التصلب المتعدد (MS). ومع ذلك، يتمثل هذا المستوى من عدم التجانس أيضا داخل اضطراب واحد، مثل الذئبة الحمامية الجهازية (SLE): يجوز تقديم بعض المرضى بأمراض الكلي، بينما يعاني الآخرون من مشاركة الدموية أو المشتركة3.

إيمونوباثوجينيسيس الكامنة في اضطرابات المناعة الذاتية مرايا التغايرية السريرية، التي تشمل وفرط-التنشيط التلقائي لعدة مجموعات فرعية الخلايا المناعية الفطرية والتكيف، وإنتاج سيتوكين dysregulated المصاحبة. بينما السيتوكينات تلعب دوراً محوريا في الآلية المرضية لأمراض المناعة الذاتية، فهم دورها المحدد في إليه المرض ثبت أن التحدي. تتميز السيتوكينات pleiotropy (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار متعددة على أنواع مختلفة من الخلية)، التكرار (السيتوكينات متعددة يمكن أن يكون نفس التأثير)، وازدواجية (سيتوكين واحد يمكن أن يكون آثار برو أو مكافحة inflammatory تحت ظروف مختلفة)، واللدونه (يمكن أن يكون مصبوب السيتوكينات في دوراً مختلفاً عن واحدة "الأصلي"، اعتماداً على البيئة)4،،من56. ونتيجة لذلك، لا يميز أساليب السكان مستوى الاستجابات الخلوية غير المتجانسة لنفس "سيتوكين الوسط". وبالمثل، لا تقدم تصاميم الدراسة التي تركز على جانب واحد من جوانب محددة في الجهاز المناعي (نوع وحيد الخلية أو سيتوكين)، تقييما شاملا لجميع العناصر المتورطة في أمراض المناعة الذاتية المعقدة. في حين أتاحت الدراسات المستندة إلى الأمصال المريض أفكاراً هامة في المناعة الذاتية، لا توفر مصدر السيتوكينات dysregulated الكشف عن الهاتف الخلوي محددة.

مؤخرا، طورنا نهجاً البروتين وحيد الخلية تقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. سير العمل الموضحة هنا يتسم باستخدام عينات الدم كله الطرفية سليمة، بدلاً من خلايا الدم المحيطية المنعزلة وحيدات النوى (ببمكس). الدم كله هامشية تمثل المركبة الأكثر فسيولوجيا ذات الصلة لدراسة المرض المناعي بوساطة النظامية، بما في ذلك خلايا الدم 1) غير-وحيدات النوى غالباً ما تشارك في أمراض المناعة الذاتية (أي، العَدلات، والصفائح الدموية)، و 2) البلازما تعميم العوامل، مثل الأحماض النووية ومجمعات محصنة السيتوكينات، التي لها أدوار تفعيل المناعة. للقبض "الجوهرية المسببة للأمراض" إنتاج سيتوكين dysregulated، الدم المحيطي معالجة العينات مباشرة بعد سحب الدم (T0، الساعة الصفر)، وبعد ح 6 من الحضانة عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم الفسيولوجية) مع نقل بروتين المانع في غياب أي شرط تحفيز خارجية (T6، ح 6 الوقت)، للكشف عن إنتاج سيتوكين (تراكم، T6-T0) التي تعكس حالة المرض "الجوهرية" (الشكل 1). دراسة العمليات dysregulated التي تعكس مدى أو التنشيط الناقص من إشارات سبل المشاركة في الاستجابات المناعية ذات الصلة بالمرض، وعينات الدم المحيطي تعامل (ح 6 الحضانة عند 37 درجة مئوية مع مثبط نقل بروتين) مع خارجية حفز شرط أن يعكس منشأ المرض، مثل عدد القتلى-مثل-مستقبلات (TLR) يضع في حالة الذئبة الحمامية المجموعية (T6 + R848، الساعة 6 ح مع 1 ميكروغرام/مل R848)، للكشف عن إنتاج سيتوكين التي تعكس استجابة للأحماض النووية (مقارنة T0 مقابل T6 مقابل T6 + R848، الشكل 1). دراسة الآثار إيمونومودولاتوري للعلاجات المتاحة السابقين فيفو، كما أنها تتصل بالعمليات الدقيقة dysregulated المناعة للمرضى محددة، يتم التعامل مع عينات الدم المحيطي مع مثبط جاك في ذات الصلة تكون العلاجية تركيز (هنا، 5 أم روكسوليتينيب؛ T6 + 5R، الوقت ح 6 مع 5 أم روكسوليتينيب)، للكشف عن التغييرات في حالة المرض "الجوهرية" في الاستجابة للدواء (T0 مقابل T6 مقابل T6 + 5R، الشكل 1). وقد اختير مثبط جاك لهذه الدراسة لمثبطات جاك قد ثبت نجاحها في علاج أمراض المناعة الذاتية مثل رع.

في نفس الوقت تقييم dysregulated العمليات الوارد وصفها أعلاه في متعددة الخلايا المناعية مجموعات فرعية، عينات الدم المحيطي من الذئبة الحمامية المجموعية معالجتها كما هو موضح أعلاه وتحليلها بواسطة الخلوي الشامل المرضى وضوابط صحية. الشامل الخلوي، المعروف أيضا قياس الوقت-الطيران، يقدم التحليل خلية واحدة من المعلمات ما يزيد على 40 دون تداخل القضايا الطيفي7،،من89. ويستخدم هذا الأسلوب نظائر المعادن الأرضية النادرة في شكل أيونات المعادن القابلة للذوبان كعلامات ملزمة للأجسام المضادة، بدلاً من فلوروفوريس10. ويمكن الاطلاع على تفاصيل إضافية فيما يتعلق بمنصة تكنولوجية الخلوي الشامل (أي ضبط ومعايرة، والحصول على عينة) في Leipold et al. ومكارثي et al. 11 , 12 العالية-أبعاد للخلوي الشامل تمكن قياس السيتوكينات متعددة في جميع أنحاء الخلية المناعية الفطرية وتكيفية مجموعات فرعية متزامنة مع خلية واحدة الحبوبية (جدول المواد).

معلمات السريرية والمختبرية التقليدية الحالية غالباً ليست حساسة أو محددة بما يكفي للكشف عن نشاط المرض الجارية أو الرد على إيمونومودولاتورس محددة13، مما يعكس الحاجة إلى ترسيم أفضل المناعة الكامنة التغييرات التي تدفع تفجر. نظراً لانتشار التقلبات سيتوكين في أمراض المناعة الذاتية، وقد حشدا نهج العلاج باستخدام الأجسام المضادة أو مثبطات الجزيئية صغيرة تستهدف السيتوكينات أو إشارات البروتينات المشاركة في تنظيم إنتاج سيتوكين ظهرت مؤخرا. في شكله الأساسي، النهج التحليلي الدم المحيطي الموصوفة هنا منبرا لتحديد مجموعات فرعية خلية dysregulated الخاصة بالمريض وإنتاج سيتوكين غير طبيعي في أمراض المناعة الذاتية مع مظاهر جهازية. تسمح هذه المنهجية لتخصيص الخيارات العلاجية كما يمكن التعرف على السيتوكينات dysregulated محددة، ومعاملة محددة يمكن أن تكون خيارات اختبار فيفو السابقين لتقييم قدرتها على إيمونومودولاتي المرض محددة المريض عملية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بولاية كولورادو متعددة المؤسسية استعراض المجلس (كوميرب) من جامعة كولورادو. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة أدناه في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم ينص على خلاف ذلك، مع نصائح الماصة التي تمت تصفيتها، وتصفية جميع المواد الكاشفة.

1. إعداد الكواشف لتجهيز الدم كله الطرفية

  1. تحضير روكسوليتينيب مختبرين الأسهم (10 – 15 ميكروليتر/قنينة للاستخدام مرة واحدة) في 10 ملم بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في [دمس] وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (مخزن في-80 درجة مئوية). الحفاظ على تركيزات [دمس] في جميع الاختبارات بما في ذلك عناصر التحكم أونستيمولاتيد أقل من 0.2 في المائة (المجلد/المجلد).
  2. إعداد R848 مختبرين الأسهم (10 – 15 ميكروليتر/قنينة للاستخدام الفردي) (ريسيكويمود) في 1 ميكروغرام/ميكروليتر بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في الماء المعقم ككل إرشادات الشركة المصنعة. مخزن في-80 درجة مئوية.
  3. إعداد lipopolysaccharide (لبس) مختبرين الأسهم (5 ميكروليتر كل قنينة للاستخدام مرة واحدة فقط) في 1 ميكروغرام/ميكروليتر بتمييع الكاشف المجففة بالتبريد في الماء المعقم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. مخزن في-80 درجة مئوية.
  4. تعد وسائل الإعلام تلوين الخلية (CSM) باستخدام برنامج تلفزيوني وجيش صرب البوسنة 0.5% 0.02% نان3.
  5. اكتساب وتبقى جاهزة كوكتيل المانع (الوكالة) النقل البروتين (جدول المواد).
  6. ذوبان الجليد وتمييع في روكسوليتينيب الأسهم قنينة (10 ملم) 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة (1 مم). جانبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة.
  7. ذوبان الجليد وتمييع القنينة R848 الأسهم (1 ميكروغرام/ميليلتر) 01:10 في برنامج تلفزيوني العقيمة (0.1 ميكروغرام/ميليلتر). جانبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة.
  8. ذوبان الجليد وتمييع لبس قنينة الأسهم (1 ميكروغرام/ميليلتر) 1: 100 في برنامج تلفزيوني العقيمة (0.01 ميكروغرام/ميليلتر). جانبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الأنسجة.
  9. قبل الحارة ربمي العقيمة (لا لام الجلوتامين) في حمام مائي القياسية في 37 درجة مئوية (على الأقل 10 دقيقة).
  10. تمييع المخزن المؤقت ليس/الإصلاح من 1:5 في ddH المصفاة2س (تركيز العامل) في benchtop (لا تحتاج لأن تكون عقيمة).
    ملاحظة: 1 مل دم الكامل يتطلب 20 مل تركيز العمل ليسي/إصلاح المخزن المؤقت.
    1. جعل المخزن المؤقت ليس الإصلاح لظروف 5 1 مل من الدم الكامل كل (على الأقل 100 مل). اليكووت 20 مل تركيز العمل ليسي/إصلاح المخزن المؤقت إلى 50 مل الأنابيب المخروطية في المليلتر من الدم كله (إبقاء ليسي/الحل في 37 درجة مئوية حتى اللازمة). تسمية الشروط على أنابيب مخروطية الشكل الذي يحتوي على المخزن المؤقت ليس الإصلاح كما يلي: T0 T6 (الوقت صفر)، + 5R (الوقت ح 6 مع 5 أم روكسوليتينيب)، T6 + R848 (الوقت ح 6 مع 1 ميكروغرام/مل R848)، T6 + T6 من لبس (الوقت ح 6 مع 0.1 ميكروغرام/مل لبس)، (الوقت ح 6).
  11. جولة التسمية أسفل أنابيب البوليستيرين العقيمة مع قبعات وأنابيب ميكروسينتريفوجي 1 مل مع نفس المصطلحات كما هو الحال في الخطوة 1، 10.

2-تحفيز وتجهيز الدم كله الطرفية (الشكل 1)

  1. ضع المسمى جولة أسفل البوليستيرين أنابيب من الخطوة 1، 11 (T0، 5R، لبس، T6 + T6، T6 + R848 + T6) على رف.
    ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية، ما لم يحدد خلاف ذلك في هذا النوع من أنبوب. كاب الأنابيب عند نقل بين هود زراعة الأنسجة وحاضنة للحفاظ على العقم.
  2. إضافة 1 مل من 37 درجة مئوية ربمي (لا لام الجلوتامين) لكل واحدة من هذه الأنابيب (T0، T6 + 5R، لبس، T6 + T6، T6 + R848). عكس أنابيب جمع الدم عدة مرات وإضافة 1 مل دم الكامل لكل أنبوبة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات مزيج دقيق مع ربمي (تمييع مع ربمي يمنع التثاقل من الدم أثناء فترة الحضانة ح 6).
  3. إضافة 10 ميكروليتر من 01:10 روكسوليتينيب T6 + 5R. مزيج دقيق مع ماصة P1000. وضع على رف الأنابيب في الحضانة عند 37 درجة مئوية ويبدأ التوقيت في الحضانة (T = 0).
  4. عملية العينة T0 كما يلي.
    1. "الماصة؛" محتويات الأنبوبة T0 في أنبوب مخروطي مسمى الذي يحتوي على 20 مل من 37 درجة مئوية العامل تركيز ليسي/إصلاح المخزن المؤقت. لتحسين استرداد الخلية، شطف الأنبوب مع تركيز العمل ليس إصلاح المخزن المؤقت. مزج بعكس الأنبوبة المخروطية.
    2. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لتحلل والتثبيت. بعد التثبيت، القيام بكافة الخطوات اللاحقة في benchtop. الطرد المركزي خلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. صب المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد لتفريق بيليه، ثم ملء المخروطية إلى حجم 15 مل مع برنامج تلفزيوني.
    4. الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب المادة طافية. تكرار الغسيل PBS (الخطوات 2.4.3–2.4.4) إذا كانت الكريات الحمراء. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المجلس الأعلى للقضاء لتفريق بيليه، ثم نقل إلى الأنبوبة المسماة ميكروسينتريفوجي (الخطوة 1، 11) لتلوين الأجسام المضادة. يأخذ عينة 10 ميليلتر عد الخلايا استخدام العداد الآلي الخلية أو هيموسيتوميتير.
      ملاحظة: حيث يتم إصلاح كافة الخلايا في هذه المرحلة، من الضروري لا تشمل صلاحية وصمة عار.
    5. الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية، تاركاً بيليه في ~ 60 ميليلتر من وحدة التخزين المتبقية. إبقاء هذا بيليه على الجليد حتى إكمال تجهيز عينات من الشروط الأخرى.
  5. عند T = 30 دقيقة، نقل رف أنبوب (الخطوة 2، 3) إلى هود زراعة الأنسجة والقيام بما يلي.
    1. إضافة 10 ميكروليتر من 0.1 ميكروغرام/ميكروليتر R848 T6 + R848. مزيج دقيق مع ماصة P1000.
    2. إضافة 10 ميكروليتر من 0.01 ميكروغرام/ميكروليتر لبس T6 + لبس. مزيج دقيق مع ماصة P1000.
    3. إضافة 4 ميكروليتر من البروتين النقل المانع (الأسهم في 500 X) إلى لبس (ولكن ليس إلى T6 + R848)، T6 + T6 و T6 + 5R، والعودة العينات إلى الحاضنة حتى T = 6 حاء مزيج دقيق مع ماصة P1000 كل ح 2.
      ملاحظة: R848 هو مؤثر TLR اندوبلاسميك ويتطلب بالتالي تأخير الزمانية في إضافة مثبط النقل البروتين للسماح بالوصول إلى مستقبلات المستهدفة به.
  6. عند T = 2 ح، إضافة 4 ميكروليتر من البروتين النقل المانع كوكتيل (الأسهم في 500 X) إلى T6 + R848 الأنبوبة. يخلط جميع العينات ماصة P1000 والعودة على الرف للحاضنة حتى T = ح 6.
  7. خلط العينات مع P1000 أكثر من مرة واحدة في T = ح 4.
  8. عند T = 6 ح، عملية T6، T6 + لبس، T6 + R848، و T6 + أنابيب عينات الدم 5R كما هو موضح في الخطوة 2.4 للعينة T0.
  9. تخزين الكريات الخلية في حجم المجلس الأعلى للقضاء المتبقية في-80 درجة مئوية عملية في تاريخ في مستقبل. وبدلاً من ذلك، انتقل إلى المتوازية وجسم تلطيخ دون تخزين.

3-الرمز الشريطي لتفكيك/إصلاح خلايا الدم

  1. ذوبان الجليد العينات الثابتة/تفكيك خلية من التخزين-80 درجة مئوية ببطء على الجليد؛ يمكن أن يكون المسمى مع الباركود فريدة كحد أقصى 20 عينة وتجميع باستخدام هذا النظام. تمييع المخزن المؤقت بيرم X barcoding 10 من 01:10 مع برنامج تلفزيوني؛ جعل ما يكفي المخزن المؤقت ل ~ 3 مل كل عينة.
  2. ملء الحوض غير معقمة واحد مع واحد مع المخزن المؤقت بيرم X barcoding 1 والمجلس الأعلى للقضاء. أضف 1 مل جليد الباردة المجلس الأعلى للقضاء لعينات طازجة المذابة، مزيج دقيق مع ماصة، ونقل إلى أنابيب كل كتلة البوليبروبيلين المسمى مسبقاً.
  3. يأخذ عينة 10 ميكروليتر عد الخلايا استخدام العداد الآلي الخلية أو هيموسيتوميتير. تطبيع التهم الخلية إلى 1.5 – 2 × 106 خلايا كل عينة في كل أنبوبة الكتلة: إزالة وتجاهل حجم الخلايا الزائدة أعلاه 2 × 106 خلايا.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المخزن المؤقت بيرم X barcoding 1 مع ماصة متعددة القنوات وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح قبالة المادة طافية.
  5. خط الأنابيب الكتلة على رف بنفس الترتيب كما هو مبين على مفتاح الرمز الشريطي حتى تطابق العينة مع الرمز الشريطي به. إضافة ميكروليتر 800 1 × المتوازية بيرم المخزن المؤقت ماصة متعددة القنوات لجميع العينات في أنابيب الكتلة دون لمس بيليه الخلية مع نصائح ماصة (لا خلط) الحد من الخسائر في الخلية. جانبا على الرف مع أنابيب الكتلة.
  6. إزالة 20-من نوع plex Pd المتوازية كيت الأنبوبة شرائط من-20 درجة مئوية، وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إضافة 100 ميكروليتر 1 المخزن المؤقت بيرم X barcoding ومزيج دقيق ونقل 120 ميكروليتر من مزيج حراكه الرمز الشريطي في عينات الخلايا المناظرة في أنابيب الكتلة.
  7. مزيج دقيق من الأقنية ماصة حيث لا يوجد أي تلوث الصليب بين فرادى المراقب عينات. احتضان أنابيب الكتلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للرموز الشريطية لتسمية الخلايا.
  8. الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية، ثم ريسوسبيند في 1 مل من المجلس الأعلى للقضاء.
  9. الطرد المركزي وريسوسبيند في المجلس الأعلى للقضاء مرة أخرى كما في الخطوة 3، 8.
    ملاحظة: كل عينة يسمى الآن مع باركود فريدة من نوعها، وعلى استعداد لتجميع عينات.
  10. الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. ماصة واحدة واستخدام تلميح نفسه، نقل جميع الخلايا الكريات في ~ 70 – 80 ميكروليتر حجم المتبقية إلى أنبوب البوليستيرين واحد. قم بإخراج طرف ماصة؛ جانبا ماصة واحدة مع هذا التلميح.
  11. ماصة متعددة القنوات ونصائح جديدة، إضافة ~ 100 ميكروليتر المجلس الأعلى للقضاء لكل أنبوبة الكتلة الأصلي إلى أقصى حد خلية الإنعاش. مع ماصة واحدة مع التلميح الذي كان جانبا، نقل جميع الخلايا الكريات في ~ 100 ميكروليتر حجم المتبقية إلى أنبوب البوليستيرين نفسه.
  12. أضف المجلس الأعلى للقضاء إلى أعلى قبالة أنبوب البوليستيرين (~ 3 مل). تعيين العد وسجل عدد الخلايا المجمعة الباركود. الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. المضي قدما إلى تلطيخ عينات المراقب في نفس اليوم.
    ملاحظة: من الطبيعي أن نتوقع فقدان الخلية ~ 20 – 30% في عملية المتوازية.

4-تلوين للمراقب تفكيك/ثابت خلايا الدم والتحضير لتحليل على صك الخلوي الشامل

ملاحظة: كل 1 X عيار لتلطيخ جسم (1 ميكروليتر من جسم كل 100 ميكروليتر تلطيخ رد فعل)، وعادة ما يمكن وصمة عار 3 – 4 × 106 خلايا. ولذلك، عندما يتم تجميع جميع العينات المراقب في أنبوب واحد، كمية الأجسام المضادة يجب الارتقاء. إذا كان يمكن وصمة عار المراقب عينات مبلغ 20 إلى 30 x 106 خلايا، وكل عيار X 1 3 – 4 × 106 خلايا، العينة المراقب يتطلب فقط من 10 X عيار، مقابل تلطيخ كل عينة على حدة، مما يتطلب كمية X 20 من جسم (1 X الواحدة أنبوب الفردية). ينبغي أن يكون تركيز الضد إلى عدد الخلايا تيتراتيد بعناية لكل جسم الفرد كوكتيل (لم تناقش هنا).

  1. وصمة عار في الخلايا باستخدام الأجسام المضادة (جدول المواد) لتحريض تلطيخ وسيتوكين السطحية.
    1. جعل تلطيخ السطح كوكتيل بحساب المبلغ الذي يكون خطأ بيبيتينج المضافة والمحاسبة ل (أيإذا تلطيخ 20 المراقب عينات من 2 × 106 خلايا في كل عينة، 10 X عيار وصمة عار مطلوب؛ وحسابات الحجم النهائي، التعويض عن خطأ بيبيتينج بجعل من 10.5 X تلطيخ الحل النهائي).
    2. إضافة 10 X قيمة من سطح تلطيخ وحدة التخزين إلى بيليه خلية المراقب. للحد من فقدان الخلية، مع تلميح نفسه، مزيج وقياس حجم البقع السطحية وبيليه الخلية.
    3. استناداً إلى حجم الخلايا وتلطيخ كوكتيل، إضافة المجلس الأعلى للقضاء إلى وحدة تخزين المصبوغة نهائي من 50 ميكروليتر الواحدة وعدد العينات الخلية (أي، في حالة تشغيل مجموعة من عينات 20، 50 ميكروليتر × 20 = 1 مل). احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحرض عينة كل 15 دقيقة لتشجيع حتى تلطيخ.
    4. أثناء الاحتضان وصمة عار السطحية، إعداد المخزن المؤقت بيرم/يغسل (جدول المواد) بتمييع 01:10 مع ddH المصفاة2O. تحضير كميات من 2 مل بيرميبيليزيشن، و 5 مل للغسيل. تبقى عند 4 درجة مئوية أو على الجليد.
    5. أعلى قبالة السطح تلطيخ أنبوب مع المجلس الأعلى للقضاء، وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نضح المادة طافية. ريسوسبيند العينة المراقب في 2 مل 4 درجة مئوية، 01:10 إضعاف بيرم/يغسل المخزن المؤقت. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة الكامل بيرميبيليزي الخلايا.
    6. الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية.
    7. لتلوين داخل الخلايا، اتبع الخطوات المصبوغة مماثلة (وبالنسبة لتلطيخ السطحية). ومع ذلك، استخدام 4 درجات مئوية، 01:10 إضعاف بيرم/يغسل المخزن المؤقت بدلاً من المجلس الأعلى للقضاء جعل إجمالي تلوين وحدة التخزين حتى تظل الخلايا في بيئة بيرميبيليزينج في جميع أنحاء تلطيخ داخل الخلايا.
    8. إضافة الأجسام المضادة داخل الخلايا كوكتيل إلى السطح الملون وبيرميبيليزيد بيليه الخلية (الخطوات 4.1.2–4.1.17). يصل إجمالي تلوين وحدة التخزين إلى 50 ميكروليتر الواحدة وعدد العينات الخلية. احتضان لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحرض عينة كل 15 دقيقة لضمان حتى تلطيخ.
    9. خلال تلطيخ داخل الخلايا، إعداد الحل إينتيركالاتور: 900 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني المصفاة + 100 ميكروليتر من المصفاة 16% منهاج عمل بيجين (التركيز النهائي من 1.6% منهاج عمل بيجين) + 0.2 ميكروليتر من 500 أم لصبغ إينتيركالاتور (جدول المواد).
    10. أعلى مقابل بيليه خلية + جسم داخل الخلايا كوكتيل مع الباردة 01:10 بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
    11. الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية. أعلى قبالة أنبوب المصبوغة مع المجلس الأعلى للقضاء. عد وسجل عدد الخلايا. الطرد المركزي في 600 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ونضح المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من محلول إينتيركالاتور من الخطوة 4.9. احتضانها لمالا يقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة الالكترود كاملا، أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية (يمكن أن يبقى عينات في حل إينتيركالاتور عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع واحد قبل تشغيلها على الصك الخلوي الشامل).
  2. إعداد الخلايا للصك الخلوي الشامل.
    1. أعلى قبالة الأنبوب مع 3 مل من المصفاة ddH2س، وأجهزة الطرد المركزي في ز 600 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند الخلايا في 3 مل من المصفاة ddH2"سين تمرير" هذا التعليق من خلال عامل تصفية 100 ميكرومتر إزالة أي الحطام أو المجاميع التي يمكن أن تسد يحتمل أن الصك الخلوي الشامل.
    2. عد وسجل الترشيح بعد رقم في الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية
  3. إعداد الحل حبة المعايرة (جدول المواد) باذابته 01:10 في المصفاة ddH2o.
  4. ريسوسبيند ملطخة الخلايا في الحجم المطلوب من 01:10 إضعاف المعايرة حبة حل لتحقيق تركيز خلية ~ 1 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: CyTOF1 في ميليلتر في الدقيقة 45، المثلى الموصى به 5 × 105 خلايا/مل؛ هيليوس في 30 ميليلتر في الدقيقة، 7.5 × 105 خلايا/مل.
  5. الشروع في تشغيل العينة على صك الخلوي الشامل9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يوضح سير العمل للتحفيز وتجهيز عينات الدم المحيطية، بما في ذلك تخصيص مختبرين عينة الدم، النقل توقيت إضافة عوامل التحفيز، بروتين مثبط كوكتيل، والحضانة مرات حتى تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) والتثبيت. وسيتوقف اختيار عوامل حفز على مسارات الإشارات وسيتوكين التي تستهدف تقييم. على سبيل المثال، تستخدم في البروتوكول هو موضح هنا، يضع TLR لتقييم آليات الاستشعار عن المناعة الفطرية عبر العديد من أنواع الخلايا. الممثل خارج الخلية (لبس، مؤثر TLR4) واندوبلاسميك (R848...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا الرواية، خلية واحدة، نهج البروتين لتقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة في وقت واحد، والكشف عن هذه الاضطرابات سيتوكين مختلف في الوسط المريض "الممرضة" بلازما الدم الطرفية يتناقل عوامل محددة. يستخدم هذا الأسلوب الدم كله الطرفية كأداة تحليلية، والخلوي الشامل كأداة لتقييم المناعة الخلوية شذوذ المظهرية والوظيفية. الأسلوب ينطبق بسهولة ل دراسات حقوق الإنسان والفئران21، وهو متوافق مع التحليل الوظيفي المناعة الأخرى، مثل الكشف عن تشوهات مما يشير إلى14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر إيمي بوغ برنار لها مساهمات فكرية وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل ووارنج "بوتشير مؤسسة ويب جائزة البحوث الطبية الحيوية" عدد K23-1K23AR070897 من المعاهد الوطنية للصحة لايلينا W.Y. هسيه. كما أيدها عدد جائزة K12-HD000850 من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية وولوسيل باكارد لصحة الأطفال، وجامعة ستانفورد كتسا UL1 TR001085، وأبحاث صحة الطفل جامعة معهد ستانفورد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RuxolitinibSanta CruzSC-364729Aمخزون Conc: 10 ملم ؛ المسار النهائي: 5 & mu ؛ M
R848Invivogentlrl-r848-5مخزون Conc: 1 & mu ؛ ز /&مو; L; المسار النهائي: 1 & mu; جم / مل لتر
LPS-EKInvivogenTLRL-eklpsمخزون Conc: 1 & mu ؛ ز /&مو; L; المسار النهائي: 0.1 & جم / مل
معقم PBSLonza17-516F
Lyse / Fix BufferBD biosciences558049Stock Conc: 5X ؛ Conc النهائي: 1X (مخفف في ddH2O)
BD Phosflow perm / wash buffer IBD biosciences557885Stock Conc: 10X ؛ Conc النهائي: 1:10 (مخفف في ddH2O)
RPMIGibco21870-076
أزيد الصوديوم (NaN3)Sigma-AldrichS-8032مخزون Conc: >99.9٪; العنصر النهائي: 0.0002
مثبط نقل البروتين (PTI)eBiosciences00-4980-93Stock Conc: 500X ؛ Conc النهائي: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192BStock Conc: 500 & mu ؛ M; المسار النهائي: 0.1 &
خلية تلطيخ وسائل الإعلام (CSM)PBS + 0.5٪ BSA ، 0.02٪ NaN3
MaxPar Barcode Perm BufferFluidigm201057مخزون Conc: 10X ؛ Conc النهائي: 1X
20-plex Pd مجموعة الباركودFluidigmS0014مخزون Conc: N / a ؛ Conc النهائي: N / a
EQ TM< / sup> أربعة عناصر معايرة الخرزFluidigm201078مخزون conc: 10X ؛ Conc النهائي: 1X
16٪ محلول فورمالديهايد خال من MeOHThermo28908مخزون Conc: 16٪ (وزن / حجم) ؛ Conc النهائي: 1.6٪ (وزن / حجم)
أنابيب البوليسترين المستديرة السفلية المعقمةVWR60818-496Stock Conc: N / a ؛ Conc النهائي: N / A
أنابيب عنقودية من مادة البولي بروبلينمختبرات الضوءA-9001Stock Conc: N / a ؛ العنصر النهائي: N / a
أداة Helios CyTOFFluidigmHeliosيجب أن تكون جميع المحاليل المستخدمة في تحليل CyTOF خالية من التلوث المعدني. يستخدم ddH2O في تحضير أي حلول يجب أن يكون لها مقاومة لا تقل عن 18.0 M & Omega ؛. سم ddH2O وأي محاليل معدة ذاتيا يجب تخزينها في زجاجات بلاستيكية أو زجاجية جديدة لم يتم تعقيمها مطلقا.
nameCompany Catalog NumberComments
antibodies المستخدمة في قياس الخلايا الكتلية
علامات السطح
CD1cBiolegendL161الكتلة: 161
CD3BDUCHT1الكتلة: 144
CD4BiolegendSK3الكتلة: 174
CD7BDM-T701الكتلة: 149
CD8BiolegendSK1الكتلة: 142
CD11bFluidigmICRF44الكتلة: 209
CD11cBDB-ly6الكتلة: 152
CD15BDHI98الكتلة: 115
CD14BiolegendM5E2الكتلة: 154
CD16eBioscience / ThermoB73.1الكتلة: 165
CD19سانتا كروزSJ25C1الكتلة: 163
CD21BiolegendBu32الكتلة: 141
CD27BDL128الكتلة: 155
CD38FluidigmHIT2الكتلة: 172
CD45 إجماليBiolegendHI30الكتلة: 89
CD45RABiolegendHI100الكتلة: 153
CD56MiltenyiREA196الكتلة: 168
CD66BDB1.1 / CD66الكتلة: 113
CD86FluidigmIT2.2الكتلة: 150
CD123Fluidigm6H6الكتلة: 143
CD278 / ICOSBiolegendC398.4Aالكتلة: 156
CD179 / PD1BiolegendEH12.2H7الكتلة: 162
IgDBiolegendIA6-2الكتلة: 146
IgMBiolegendMHM-88الكتلة: 151
CXCR5BDRF8B2الكتلة: 173
HLADRBiolegendL243الكتلة: 167
<قوي>السيتوكينات< / قوي>
IL-1 & alpha;Biolegend364-3B3-14الكتلة: 147
IL-1 & بيتا;Biolegend H1b-98كتلة: 169
IL-1RAسانتا كروز & nbsp ؛كتلة AS17: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5الكتلة: 164
IL-8BDE8N1الكتلة: 160
IL-12 / IL-23p40Biolegend  C8.6كتلة: 171
IL-17ABiolegend  BL168كتلة: 148
IL23p19eBioscience / Thermo23dcdpكتلة: 176
MIP1 & beta ؛دينار بحرينيD21-1351كتلة: 158
MCP1BD5D3-F7الكتلة: 170
IFN & alpha ؛Miltenyi LT27: 295الكتلة: 175
IFN & gamma ؛بيولوجي ليجند4 إس. كتلة B3: 165
PTENBDA2B1الكتلة: 159
TNF & alpha ؛BiolegendMab11كتلة: 166
<قوي>ملاحظة< قوي>: إذا تم ذكر الشركة المصنعة على أنها Fluidigm ، فقد تم شراء هذا الجسم المضاد من Fluidigm مع معدن مترافق مسبقا. إذا تم ذكر الشركة المصنعة على أنها غير Fluidigm ، فقد تم اقتران هذا الجسم المضاد ذاتيا باستخدام MaxPar Multi-Metal Labeling  طقم (Fluidigm Cat: 201300) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
M

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mass CytometryPeripheral BloodCytokine ProductionImmunophenotype AnalysisAutoimmune DiseaseSingle cell AnalysisBlood StimulationBarcoding ProtocolCell Surface MarkersProtein Transport Inhibitor

مقالات ذات صلة